CN105051028A

CN105051028A - 布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂

Info

Publication number: CN105051028A
Application number: CN201480011793.5A
Authority: CN
Inventors: C·E·布罗泽顿-普雷斯; R·K·孔德鲁; F·J·罗裴茨-塔比阿; Y·娄
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-03-05
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2034-03-03
Also published as: CA2902038A1; WO2014135470A1; EP2964627B1; KR20150123318A; HK1214257A1; EP2964627A1; RU2618529C2; US9556147B2; BR112015021719A8; CN105051028B; MX2015010820A; KR101737724B1; RU2015141357A; US20160002206A1; JP6089124B2; JP2016510049A; BR112015021719A2; CA2902038C

Abstract

本申请公开了根据通式I的化合物(I)，其中所有变量如本文中所述定义，所述化合物抑制BTK。本文公开的化合物可用于调节BTK的活性和治疗与过度BTK活性相关的疾病。所述化合物还可用于治疗与异常B细胞增殖相关的炎性疾病和自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎。还公开了含有式I化合物和至少一种载体、稀释剂或赋形剂的组合物。

Description

布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂

发明领域

本发明涉及抑制BTK并且可用于治疗由异常B-细胞活化引起的自身免疫疾病和炎性疾病的新化合物的用途。

发明背景

蛋白激酶组成人类酶的最大家族之一并且通过添加磷酸基团到蛋白质上来调节许多不同的信号传导过程(T.Hunter,Cell198750:823-829)。特别地，酪氨酸激酶磷酸化蛋白质在酪氨酸残基的酚部分。酪氨酸激酶家族包括控制细胞生长、迁移和分化的成员。异常的激酶活性已经涉及许多人类疾病，包括癌症、自身免疫疾病和炎性疾病。由于蛋白激酶属于细胞信号传导的关键调节剂，它们提供用小分子激酶抑制剂来调节细胞功能的目标，并且因此成为了良好的药物设计靶标。除了激酶介导的疾病过程的治疗，激酶活性的选择性和有效抑制剂还可用于研究细胞信号传导过程和鉴定其它具有治疗意义的细胞靶标。

关于B细胞在自身免疫疾病和/或炎性疾病的发病机制中的关键作用存在良好的证据。消耗B细胞的基于蛋白质的治疗剂例如Rituxan针对自身抗体导致的炎性疾病例如类风湿性关节炎是有效的(Rastetter等人,AnnuRevMed200455:477)。因此，在B-细胞活化中发挥作用的蛋白激酶的抑制剂应当是对于B细胞介导的疾病病理例如自身抗体生成的有用的治疗剂。

通过B-细胞受体(BCR)的信号传导控制一系列B细胞应答，包括增殖和分化到成熟的抗体生成细胞。BCR是B-细胞活性的关键调节点并且异常的信号传导可以引起失调的B-细胞增殖和病原性自身抗体的形成，其导致多种自身免疫疾病和/或炎性疾病。布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)是在BCR的膜近端和紧接下游的非-BCR相关的激酶。BTK的缺乏已经显示阻断BCR信号传导，并且因此BTK的抑制可以是阻断B细胞介导的疾病过程的可用治疗方法。

BTK是酪氨酸激酶Tec家族的成员，并且显示是早期B细胞发育以及成熟B细胞活化和存活的关键调节剂(Khan等人，Immunity19953:283；Ellmeier等人，J.Exp.Med.2000192:1611)。人中的BTK突变导致病症X染色体连锁性丙种球蛋白缺乏血症(XLA)(Rosen等人，NewEng.J.Med.1995333:431和Lindvall等人，Immunol.Rev.2005203:200中综述)。这些患者是免疫受损的，并且显示受损的B细胞成熟，降低的免疫球蛋白和外周B细胞水平，减少的不依赖T细胞的免疫应答以及在BCR刺激后的减弱的钙动员。

关于BTK在自身免疫疾病和炎性疾病中的作用的证据已经由BTK-缺陷型小鼠模型提供。在***性红斑狼疮(SLE)的临床前鼠模型中，BTK缺陷型小鼠显示疾病进展的显著改善。此外，BTK-缺陷型小鼠对胶原诱导的关节炎具有抗性(Jansson和Holmdahl，Clin.Exp.Immunol.199394:459)。已经证明选择性BTK抑制剂在小鼠关节炎模型中的剂量依赖性功效(Z.Pan等人,Chem.MedChem.20072:58-61)。

BTK还由除了B-细胞之外可能涉及疾病过程的细胞表达。例如，BTK由肥大细胞表达并且BTK缺陷型骨髓来源的肥大细胞显示受损的抗原诱导的脱粒(Iwaki等人，J.Biol.Chem.2005280:40261)。这显示BTK可以用于治疗病理性肥大细胞响应例如***反应和哮喘。此外，其中缺乏BTK活性的来自XLA患者的单核细胞显示在刺激后减少的TNFα生成(Horwood等人，JExpMed197:1603,2003)。因此，TNFα介导的炎症可以由小分子BTK抑制剂调节。此外，已经报道BTK在细胞凋亡中发挥作用(Islam和Smith，Immunol.Rev.2000178:49)，并且因此BTK抑制剂可用于治疗某些B-细胞淋巴瘤和白血病(Feldhahn等人，J.Exp.Med.2005201:1837)。

发明概述

本申请提供式I的BTK抑制剂化合物，其使用方法，如本文下面所述：

本申请提供了式I化合物，

其中：

X是卤素；

Y是H或低级烷基；

R是-R¹-R²-R³；

R¹是杂芳基；

R²是-C(＝O)或不存在；

R³是杂环烷基，其任选被一个或多个R^3’取代；并且

每个R^3’独立地是低级烷基、卤素、低级烷氧基或低级卤代烷基；

或其可药用盐。

本申请提供了治疗炎性病症和/或自身免疫病症的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I化合物。

本申请提供了药物组合物，其包含式I化合物与至少一种可药用载体、赋形剂或稀释剂混合。

发明详述

定义

如本文使用的，短语“一(a)”或“一(an)”种实体是指一种或多种该实体；例如，一种化合物指一种或多种化合物或至少一种化合物。因此，术语“一种(a)”(或“一种(an)”)，“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中可交换使用。

短语“如上文定义”是指如发明概述或最宽权利要求中提供的每个基团的最宽定义。在下面提供的所有的其它实施方案中，可以在每个实施方案中存在并且没有明确定义的取代基保留在发明概述中提供的最宽定义。

如在此说明书中使用的，不管在过渡性短语中或在权利要求的主体中，术语“包含”和“包括”应当被解释为具有开放式的含义。即，该术语应当被解释为与短语“至少具有”或“至少包括”同义。当在方法的上下文中使用时，术语“包含”是指该方法至少包含所述的步骤，但是可以包含另外的步骤。当在化合物或组合物的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物或组合物至少包含所述的特征或组分，但是还可以包含另外的特征或组分。

如本文中所用的，除非另外具体指出，单词“或”的使用是“和/或”的“包括”意思，而不是“或/或”的“排它”意思。

本文中使用的术语“独立地”是指变量被用于任何一种情况，而不考虑在相同的化合物内存在或不存在具有相同或不同定义的变量。因此，在其中R”出现两次并且被定义为“独立地为碳或氮“的化合物中，两个R”可以是碳，两个R”可以是氮，或者一个R”可以是碳并且另一个是氮。

在描绘或描述本发明中采用的或要求保护的化合物的任何部分或式中，任何变量出现多于一次时，其在每一次出现时的定义独立于其在每一次另外出现时的定义。此外，取代基和/或变量的组合只有在这些化合物导致稳定的化合物的情况下才是允许的。

在键末端处的符号“*”或划过键的“------”分别是指官能团或其它化学部分与其作为一部分的分子的余下部分的连接点。因此，例如：

MeC(＝O)OR⁴其中或

划入环体系中的键(与在明确的顶点处连接相反的)是指该键可以连接到任何适合的环原子。

如本文中所用的术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可以、但不是必须发生，并且是指该描述包括事件或情形发生的情况，和它不发生的情况。例如，“任选取代的”是指任选取代的部分可以结合氢原子或取代基。

短语“任选的键”是指该键可以存在或可以不存在，并且是指该描述包括单键、双键或三键。如果取代基被指定为是“键”或“不存在”，则连接到该取代基上的原子直接连接。

本文使用的术语“约”是指大致地、在...的附近、粗略地或大约。当术语“约”与一个数值范围一起使用时，它通过将边界延伸高于和低于所列出的数值而改变该范围。通常，本文使用的术语“约”将数值改变到高于和低于所述的值20％的方差。

式I的某些化合物可以显示出互变异构现象。互变异构的化合物可以以两种或更多种可以相互转化的物种存在。质子转移的互变异构体由共价结合的氢原子在两个原子之间的迁移得到。互变异构体通常存在着平衡并且分离单个互变异构体的尝试通常制备出其化学和物理性质与化合物的混合物一致的混合物。平衡的位置取决于在分子内的化学特征。例如，在许多脂族醛和酮例如乙醛的情况下，酮形式占优势，而在酚中，烯醇形式占优势。常见的质子转移的互变异构体包括酮/烯醇酰胺/亚氨酸和脒互变异构体。后两种在杂芳基和杂环中是特别常见的，并且本发明包括化合物的所有互变异构形式。

本文使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域内的技术人员所通常理解的含义，除非另外定义。本文参考本领域技术人员已知的多种方法和材料。列出药理学的通用原理的标准参考著作包括Goodman和Gilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第10版,McGrawHillCompaniesInc.,NewYork(2001)。可以将本领域技术人员已知的任何适合材料和/或方法用于实施本发明。但是，描述的是优选的材料和方法。在下面的描述和实施例中涉及的材料、试剂等可获自商业来源，除非另外指出。

本文所述的定义可以被附加以形成化学上相关的组合，例如“杂烷基芳基”、“卤代烷基杂芳基”、“芳基烷基杂环基”、“烷基羰基”、“烷氧基烷基”等。当术语“烷基”被用作另一个术语之后的后缀时，例如在“苯基烷基”或“羟基烷基”中时，它意在表示如上定义的烷基，其被一至两个选自所述的另外具体标名的基团的取代基取代。因此，例如“苯基烷基”是指具有1至2个苯基取代基的烷基，并且因此包括苄基、苯基乙基和联苯。“烷基氨基烷基”是具有1至2个烷基氨基取代基的烷基。“羟基烷基”包括2-羟基乙基、2-羟基丙基、1-(羟基甲基)-2-甲基丙基、2-羟基丁基、2,3-二羟基丁基、2-(羟基甲基)、3-羟基丙基等。因而，如本文中所用的，术语“羟基烷基”用来定义下面定义的杂烷基的子集。术语-(芳)烷基是指未取代的烷基或芳烷基。术语(杂(hetero))芳基或(杂(het))芳基是指芳基或杂芳基。

如本文中所用的术语“螺环烷基”是指螺环的环烷基，例如螺[3.3]庚烷。如本文中所用的术语螺杂环烷基是指螺环的杂环烷基，例如2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷。

如本文中所用的术语“酰基”表示式-C(＝O)R的基团，其中R是氢或如本文中定义的低级烷基。如本文中所用的术语“烷基羰基”表示式C(＝O)R的基团，其中R是如本文中定义的烷基。术语C_1-6酰基是指基团-C(＝O)R含6个碳原子。如本文中所用的术语“芳基羰基”表示式C(＝O)R的基团，其中R是芳基；如本文中所用的术语“苯甲酰基”是其中R是苯基的“芳基羰基”。

如本文中所用的术语“酯”表示式-C(＝O)OR的基团，其中R是如本文所定义的低级烷基。

如本文中所用的术语“烷基”表示含有1至10个碳原子的非支链或支链的饱和一价烃残基。术语“低级烷基”表示含有1至6个碳原子的直链或支链烃残基。如本文中所用的“C_1-10烷基”是指由1至10个碳构成的烷基。烷基的实例包括但不限于低级烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基和辛基。

当术语“烷基”被用作另一个术语之后的后缀时，如在“苯基烷基”或“羟基烷基”中时，它意在表示如上定义的烷基，其被一至两个选自所述的另外具体标名的基团的取代基取代。因此，例如“苯基烷基”表示基团R’R”-，其中R’是苯基，并且R”是如本文中定义的亚烷基，其中理解的是苯基烷基部分的连接点将在亚烷基上。芳基烷基的实例包括但是不限于苄基、苯基乙基、3-苯基丙基。术语“芳基烷基”或“芳烷基”被类似地解释，不同之处在于R’是芳基。术语“(杂)芳基烷基”或“(杂)芳烷基”被类似地解释，不同之处在于R’任选是芳基或杂芳基。

术语“卤代烷基”或“卤代-低级烷基”或“低级卤代烷基”是指含1至6个碳原子的直链或支链烃残基，其中一个或多个碳原子被一个或多个卤原子取代。

如本文中所用的术语“亚烷基(alkylene或alkylenyl)”表示1至10个碳原子的二价饱和直链烃基(例如(CH₂)_n)或2至10个碳原子的支链饱和二价烃基(例如-CHMe-或-CH₂CH(i-Pr)CH₂-)，除非另外指出。除了在亚甲基的情况下之外，亚烷基的开放价态不连接到相同的原子上。亚烷基的实例包括但是不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、2-甲基-亚丙基、1,1-二甲基-亚乙基、亚丁基、2-乙基亚丁基。

如本文中所用的术语“烷氧基”表示-O-烷基，其中烷基如上定义，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基，包括它们的异构体。如本文中所用的“低级烷氧基”表示具有如上面定义的“低级烷基”基团的烷氧基。如本文中所用的“C_1-10烷氧基”是指-O-烷基，其中烷基是C_1-10。

术语“PCy₃”是指被三个环状部分三取代的膦。

术语“卤代烷氧基”或“卤代-低级烷氧基”或“低级卤代烷氧基”是指低级烷氧基，其中一个或多个碳原子被一个或多个卤原子取代。

如本文中所用的术语“羟基烷基”表示如本文中定义的烷基，其中在不同碳原子上的1至3个氢原子被羟基替代。

如本文中所用的术语“烷基磺酰基”和“芳基磺酰基”是指式-S(＝O)₂R的基团，其中R分别是烷基或芳基，并且烷基和芳基如本文中定义。如本文中所用的术语“杂烷基磺酰基”表示式-S(＝O)₂R的基团，其中R是如本文中定义的“杂烷基”。

如本文中所用的术语“烷基磺酰基氨基”和“芳基磺酰基氨基”是指式-NR’S(＝O)₂R的基团，其中R分别是烷基或芳基，R’是氢或C_1-3烷基，并且烷基和芳基如本文中所定义。

如本文中所用的术语“环烷基”是指含有3至8个碳原子的饱和碳环，即环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。如本文中所用的“C_3-7环烷基”是指由在碳环中的3至7个碳构成的环烷基。

如本文中所用的术语羧基-烷基是指烷基部分，其中一个氢原子已经被羧基替代，其中应理解，杂烷基的连接点是通过碳原子。术语“羧基(carboxy或carboxyl)”是指-CO₂H部分。

如本文中所用的术语“杂芳基”或“杂芳族”是指5至12个环原子的单环或二环基团，其具有至少一个芳族或部分不饱和的环，每个环含有4至8个原子，结合有一个或多个N、O或S杂原子，其余环原子是碳，其中理解的是杂芳基的连接点将在芳族或部分不饱和的环上。如本领域中技术人员周知的，杂芳基环比它们的全碳副本具有更低的芳族特性。因此，对于本发明而言，杂芳基只需要具有一定程度的芳族特性。杂芳基部分的实例包括具有5至6个环原子和1至3个杂原子的单环芳族杂环，包括但不限于吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、唑基、4,5-二氢-唑基、5,6-二氢-4H-[1,3]唑基、异唑、噻唑、异噻唑、***啉、噻二唑和二唑啉(oxadiaxoline)，它们可以任选被1个或多个、优选1或2个取代基取代，所述的取代基选自羟基、氰基、烷基、烷氧基、硫代、低级卤代烷氧基、烷硫基、卤素、低级卤代烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、硝基、烷氧基羰基和氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、烷基羰基氨基和芳基羰基氨基。二环部分的实例包括但不限于喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并唑、苯并异唑、苯并噻唑、萘啶基、5,6,7,8-四氢-[1,6]萘啶基和苯并异噻唑。二环部分可以在任一环上任选取代，但是连接点在含有杂原子的环上。

如本文中所用的术语“杂环基”、“杂环烷基”或“杂环”表示由一个或多个环、优选1至2个环(包括螺环环系)组成的一价饱和环状基团，每个环3至8个原子，其结合有一个或多个环杂原子(选自N、O或S(O)_0-2)，并且其可以任选独立地被一个或多个、优选1个或2个取代基取代，所述的取代基选自羟基、氧代、氰基、低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、烷硫基、卤素、低级卤代烷基、羟基烷基、硝基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基及其离子形式，除非另外指出。杂环基的实例包括但不限于吗啉基、哌嗪基、哌啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、六氢氮杂基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、唑烷基、噻唑烷基、异唑烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、奎宁环基和咪唑啉基及其离子形式。实例还可以是二环的，例如3,8-二氮杂-二环[3.2.1]辛烷、2,5-二氮杂-二环[2.2.2]辛烷或八氢-吡嗪并[2,1-c][1,4]嗪。

BTK抑制剂

本申请提供了式I的化合物，

其中：

X是卤素；

Y是H或低级烷基；

R是-R¹-R²-R³；

R¹是杂芳基；

R²是-C(＝O)或不存在；

R³是杂环烷基，其任选被一个或多个R^3’取代；并且

或其可药用盐。

本申请提供了式I化合物，其中X是F。

本申请提供了以上式I化合物，其中R¹是吡啶基。

本申请提供了以上式I化合物，其中R²是-C(＝O)。

本申请提供了以上式I化合物，其中R³是吗啉基。

本申请提供了以上式I化合物，其中Y是H。

本申请可选择地提供了以上式I化合物，其中Y是叔丁基。

本申请提供了式I化合物，其中R²不存在。

本申请提供了式I化合物，其中X是F，R²不存在，并且R¹是吡啶基。

本申请提供了以上式I化合物，其中R³是吡咯烷基，其任选被一个或多个R^3’取代。

本申请提供了以上式I化合物，其中R^3’是甲基。

本申请提供了以上式I化合物，其中X是F，并且Y是H。

本申请可选择地提供了以上式I化合物，其中X是F，并且Y是叔丁基。

本申请提供了以上式I化合物，其中X是F，R¹是吡啶基，R²不存在，R³是吡咯烷基，R^3’是甲基，并且Y是环丙基或二烷基氨基。

本申请提供了式I化合物，其选自：

8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[[5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基]氨基]-6,7-二氢-5H-苯并[1,2]环庚烷[6,7-d]吡啶-3-酮；

8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[[5-[(2S)-1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶-2-基]氨基]-6,7-二氢-5H-苯并[1,2]环庚烷[6,7-d]吡啶-3-酮；

(6S)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[[5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基]氨基]-6,7-二氢-5H-苯并[1,2]环庚烷[6,7-d]吡啶-3-酮；

(6R)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[[5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基]氨基]-6,7-二氢-5H-苯并[1,2]环庚烷[6,7-d]吡啶-3-酮；

8-(8-氟-1-氧代酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[[5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基]氨基]-6,7-二氢-5H-苯并[1,2]环庚烷[6,7-d]吡啶-3-酮；

(6S)-8-(8-氟-1-氧代酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[[5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基]氨基]-6,7-二氢-5H-苯并[1,2]环庚烷[6,7-d]吡啶-3-酮；和

(6R)-8-(8-氟-1-氧代酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[[5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基]氨基]-6,7-二氢-5H-苯并[1,2]环庚烷[6,7-d]吡啶-3-酮。

本申请提供了治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I化合物。

本申请提供了治疗哮喘的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I化合物。

本申请提供了包含式I化合物的药物组合物。

本申请提供了式I化合物作为治疗活性物质的用途。

本申请提供了式I的化合物在制备用于治疗炎性障碍的药物中的用途。

本申请提供了式I化合物在制备用于治疗自身免疫障碍的药物中的用途。

本申请提供了式I化合物在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。

本申请提供了式I化合物在制备用于治疗哮喘的药物中的用途。

本申请提供了上述化合物在治疗炎性和/或自身免疫病症中的用途。

本申请提供了上述化合物在治疗类风湿性关节炎中的用途。

本申请提供了上述化合物在治疗哮喘中的用途。

本申请提供了如本文所述的化合物、方法或组合物。

化合物和制备

在下面的表中提供了由本发明包含并且在本发明范围内的代表性化合物的实例。提供下面的这些实施例和制备以使本领域技术人员能够更清楚地理解并且实践本发明。它们不应当被认为是限制本发明的范围，而仅为示例性的并且是其代表。

通常，本申请中使用的命名法基于AUTONOM^TMv.4.0，一种用于产生IUPAC***命名的BeilsteinInstitute计算机化的***。如果在画出的结构和给出该结构的名称之间有差异，则画出的结构将给予更大的权重。此外，如果结构或结构的一部分的立体化学没有用例如粗体或虚线指示，则所述结构或结构的一部分将解释为包含其全部立体异构体。

表I描述了通式I化合物的实例：

表I.

通用合成流程图

本发明化合物可以通过任何常规方法制备。用于合成这些化合物的适合的方法在实施例中提供。通常，本发明化合物可以根据以下流程图制备。

通用流程图1

在以上通用流程图1中，R2可以是-C(＝O)或不存在，R3可以是杂环烷基，其任选被一个或多个R^3’取代，每个R^3’可以独立地是低级烷基、卤素、低级烷氧基或低级卤代烷基，并且Y可以是H或低级烷基。

通用流程图2

在以上通用流程图2中，R2可以是-C(＝O)或不存在，R3可以是杂环烷基，其任选被一个或多个R^3’取代，每个R^3’可以独立地是低级烷基、卤素、低级烷氧基或低级卤代烷基，并且Y可以是H、低级烷基。

药物组合物和施用

可以以广泛种类的口服施用剂型和载体配制本发明化合物。口服施用可以是片剂、包衣片剂、糖衣丸、硬和软明胶胶囊剂、溶液剂、乳剂、糖浆或混悬剂的形式。在其它施用途径中，当由包括持续(静脉内滴注)局部非肠道、肌内、静脉内、皮下、透皮(其可以包含渗透增强剂)、含服、经鼻、吸入和栓剂施用的其它施用途径施用时，本发明化合物是有效的。优选的施用方式通常是使用常规日服剂量方案进行口服，所述日服剂量方案可以根据痛苦的程度和患者对活性成分的响应进行调节。

本发明的一种化合物或多种化合物以及它们的药用盐，与一种或多种常用赋形剂、载体或稀释剂一起可以被置于药物组合物和单位剂量的形式中。药物组合物和单位剂量形式可以包括常规比例的常用的成分，存在另外的活性化合物或要素，或不存在另外的活性化合物或要素，并且所述单位剂量形式可以包含与所意欲使用的日剂量范围相当的任何适合的有效量的活性成分。药物组合物可以以固体例如片剂或填充胶囊剂、半固体、散剂、持续释放制剂或液体例如溶液剂、混悬剂、乳剂、酏剂或填充胶囊剂使用，进行口服应用；或以用于直肠或***施用的栓剂形式使用；或以用于非肠道使用的无菌可注射溶液剂的形式使用。典型的制剂包含约5％至约95％的一种活性化合物或多种活性化合物(w/w)。术语“制剂”或“剂量形式”意欲包括活性化合物的固体和液体制剂并且本领域技术人员将理解活性成分可以取决于靶器官或组织并且取决于需要的剂量和药物代谢动力学参数而以不同制剂存在。

术语“赋形剂”用于本文时指用于制备药物组合物的、通常是安全无毒并且没有生物学上或其它方面不适合的化合物，并且包括可用于兽医使用以及人药物应用的赋形剂。本发明化合物可以单独施用，但是通常与一种或多种根据意欲施用的途径和标准的药物实践选择的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用。

“可药用”是指其可用于制备通常安全、无毒并且在生物学上和其它方面都没有不适合的药物组合物，并且包括其对于兽医以及人类药物用途是可接受的。

活性成分的“可药用盐”形式也可以在开始赋予活性成分需要的药物代谢动力学性质，所述药物代谢动力学性质在非盐形式中是缺乏的，并且就其体内治疗活性而论，可能甚至正面影响活性成分的药效学。短语化合物的“可药用盐”指药学上可接受的并且具有母体化合物的需要的药理活性的盐。所述盐包括：(1)酸加成盐，与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与有机酸例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡糖庚酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成；或(2)当在母体化合物中存在的酸质子被金属离子例如碱金属离子、碱土离子或铝离子替换时形成的盐；或与有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等配位形成的盐。

固体形式制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散的颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，其也可以充当稀释剂、矫味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。在粉末中，所述载体通常是细碎固体，其是与细碎活性组分的混合物。在片剂中，活性组分通常与具有必要的结合能力的载体以适合比例混合，并且被压制成需要的形状和大小。适合的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。除了活性组分之外，固体形式的制剂可以包含着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然的甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。

液体制剂也适合于口服施用，包括液体制剂，包括乳剂、糖浆剂、酏剂、水溶液剂、水混悬剂。这些包括意欲在即将使用前转化为液体形式制剂的固体形式制剂。乳剂可以以溶液形式例如以丙二醇水溶液的形式制备或可以包含乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或***胶。可以通过将活性组分溶解在水中并且加入适合的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂来制备水溶液。可以通过将细碎的活性组分与粘性物质例如天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠及其它的熟知的助悬剂一起分散在水中来制备水混悬剂。

本发明化合物可以配制用于非肠道施用(例如通过注射例如推注，或连续输注)并且可以以单位剂型在安瓿、预填充注射器、小体积的输注液中或在多剂量容器中与加入的防腐剂一起存在。组合物可以采用这样的形式，例如在油性或水性介质中的混悬剂、溶液剂或乳剂形式，例如在水性聚乙二醇中的溶液剂。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或介质的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)，并且可以包含配制剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂或助悬剂、稳定剂和/或分散剂。可选择的是，活性成分可以以粉末形式存在，所述粉末通过无菌分离灭菌固体获得或通过从溶液中冻干获得，其在使用前用适合的介质例如无菌的无热原的水进行重构。

可以配制本发明化合物，作为软膏剂、乳膏剂或洗剂，或作为透皮贴片用于给表皮的局部施用。软膏剂和乳膏剂例如可以用水性或油性基质，在加入适合的增稠剂和/或胶凝剂的情况下配制。洗剂可以用水性或油性基质配制，并且通常也将含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、增稠剂或着色剂。适合于口中局部施用的制剂包括：锭剂，其在矫味基质中包含活性剂，所述的矫味基质通常是蔗糖和***胶或黄蓍胶；软锭剂，其在惰性基质中包含活性成分，所述的惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和***胶；以及漱口剂，其在适合液体载体中包含活性成分。

可以将本发明化合物配制作为栓剂施用。首先将低熔点蜡，例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物熔化，并且例如通过搅拌均匀分散活性组分。接着，将熔化的均匀混合物倾入适合尺寸的模具中，使其冷却并且固化。

可以将本发明化合物配制用于***施用。***栓剂、棉球、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂除了活性成分外，还包含如本领域已知是合适的载体。

可以配制本发明化合物用于经鼻施用。由常规装置例如用滴管、吸管或喷雾器将溶液剂或混悬剂直接应用至鼻腔。制剂可以以单剂量或多剂量形式提供。在滴管或吸管的后一种情况下，这可以通过患者施用适合的、预定体积的溶液剂或混悬剂来实现。在喷雾器的情况下，这可以通过例如计量的雾化喷雾泵来实现。

可以配制本发明化合物用于气雾剂施用，特别是对呼吸道施用，并且包括鼻内施用。该化合物通常具有小的粒子大小，例如约五(5)微米或更小数量级。这样的粒子大小可以通过本领域中已知的方式获得，例如通过微粉化获得。将活性成分提供在具有适合抛射剂的加压容器中，所述的推进剂例如氯氟烃(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，或二氧化碳或其它适合的气体。气雾剂还可以方便地含有表面活性剂例如卵磷脂。药物的剂量可以通过计量阀来控制。可选择的是，活性成分可以以干粉的形式提供，例如化合物在适合的粉末基质中的粉末混合物，所述的粉末基质例如乳糖、淀粉、淀粉衍生物例如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂量形式存在，例如在如明胶的胶囊或药筒中，或泡罩包装中，这些包装中的粉末剂可以通过吸入器施用。

当需要时，可以用适合于活性成分的持续或控制释放施用的肠溶衣制备制剂。例如，本发明化合物可以在透皮或皮下药物递送装置中配制。当化合物的持续释放是需要的时并且当患者顺应治疗方案是重要的时，这些递送***是有利的。在透皮递送***中的化合物经常附着于皮肤粘附性固体支持物。目的化合物还可以与渗透增强剂例如氮酮(Azone)(1-十二烷基氮杂-环庚-2-酮)组合。将持续释放递送***通过外科手术或注射皮下***皮下层。皮下植入物在脂溶性膜例如硅橡胶或可生物降解的聚合物例如聚乳酸(polyacticacid)中包封化合物。

Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy1995，由E.W.Martin编辑，MackPublishingCompany，第19版，Easton，Pennsylvania中描述了适合的制剂以及药物载体、稀释剂和赋形剂。有经验的制剂科学家可以在本发明说明书教导的范围内修饰制剂以提供多种制剂，其用于施用的具体途径，而不使本发明的组合物不稳定或有损它们的治疗活性。

使本发明化合物在水或其它介质中的溶解度增高的它们的修饰，例如可以容易地通过较小的修饰实现(形成盐，酯化等)，这都在本领域普通技能的范围内。也在本领域普通技能范围内的是，修饰施用途径和具体化合物的剂量方案从而使本发明化合物的药物代谢动力学在患者中获得最大的有益效果。

用于本文时，术语“治疗有效量”是指减轻个体中的疾病的症状所需要的量。将在每个具体病例中，根据个体需要调整剂量。取决于多种因素，该剂量可以在广泛范围内变化，所述因素例如待治疗的疾病的严重性，患者的年龄和一般健康状况，治疗患者的其它药物，施用的途径和形式，和涉及的执业医生的偏好和经验。对于口服施用，在每天约0.01至约1000mg/kg体重之间的日剂量应该在单一治疗和/或组合治疗情况中是适合的。优选的日剂量在每天约0.1至约500mg/kg体重之间，更优选在每天0.1至约100mg/kg体重之间，并且最优选在每天1.0至约10mg/kg体重之间。因此，对于给70kg的人施用，剂量范围是每天约7mg至0.7g。日剂量可以以单一剂量或以分剂量进行施用，典型地在每天1-5个剂量。一般而言，用比化合物的最佳剂量少的较小剂量开始治疗。随后，通过小增量增加剂量直到达到个体患者的最佳效果。治疗本文所述疾病的本领域普通技术人员能够不经过过度试验和根据个人的知识经验和本申请的公开内容来确定本发明化合物对于给定疾病和患者的治疗有效量。

药物制剂优选为单位剂量形式。在这种形式下，将制剂再分成含有适合量的活性组分的单位剂量。单位剂量形式可以是包装制剂，该包装含有离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊剂和在管瓶或安瓿中的散剂。此外，单位剂量形式可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是适合数量的包装形式的这些中的任何一种。

治疗适应证和方法

通式I化合物抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)。用上游激酶活化BTK导致磷酸酶-Cγ活化，由此刺激促炎介质释放。式I化合物可用于治疗关节炎和其它抗炎和自身免疫疾病。因此，式I化合物可用于治疗关节炎。式I化合物可用于抑制细胞中的BTK并且调节B-细胞发育。本发明还包含药物组合物，其包含式I化合物与可药用载体、赋形剂或稀释剂混合。

本文描述的化合物是激酶抑制剂，特别是BTK抑制剂。这些抑制剂可以用于治疗哺乳动物中的一种或多种响应激酶抑制的疾病，包括响应BTK抑制和/或B-细胞增殖的抑制的疾病。不希望束缚于任何特定的理论，相信本发明化合物与BTK的相互作用导致BTK活性的抑制，并且因此得到这些化合物药学应用。因此，本发明包括用于治疗具有响应BTK活性的抑制和/或抑制B-细胞增殖的疾病的哺乳动物，例如人的方法，该方法包括给具有这样的疾病的哺乳动物施用有效量的至少一种在本文中提供的化学实体。可以在试验上例如通过测定化合物的血液浓度，或理论上通过计算生物利用度，确定有效浓度。除了BTK之外，还可能受到影响的其它激酶包括但不限于，其它酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶。

激酶在控制基本细胞过程例如增殖、分化和死亡(细胞凋亡)的信号传导途径方面起着重要作用。异常的激酶活性已经涉及到多种疾病，所述的疾病包括多种癌症、自身免疫疾病和/或炎性疾病以及急性炎性反应。激酶在关键细胞信号传导途径中的多面性作用提供了识别靶向激酶和信号传导途径的新药物的显著机会。

一个实施方案包括治疗具有响应BTK活性和/或B细胞增殖的抑制的自身免疫疾病和/或炎性疾病或急性炎性反应的患者的方法。

使用本发明化合物和组合物可以影响的自身免疫疾病和/或炎性疾病包括但不限于：银屑病、***反应、克隆病、肠易激惹综合征、舍格伦病、组织移植物排斥和移植器官的超急性排斥、哮喘、***性红斑狼疮(和相关的肾小球肾炎)、皮肌炎、多发性硬化、硬皮病、血管炎(ANCA-相关的和其它的血管炎)、自身免疫溶血性和血小板减少性症状、古德帕斯综合征(和相关的肾小球肾炎和肺出血)、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)、艾迪生病、帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病、脓毒性休克和重症肌无力。

本文中包括的是治疗方法，其中将本文中提供的至少一种化学实体与抗炎剂组合施用。抗炎剂包括但不限于：NSAID、非特异性和COX-2特异性的环氧合酶酶抑制剂、金化合物、皮质类固醇类、甲氨蝶呤、肿瘤坏死因子受体(TNF)受体拮抗剂、免疫抑制剂和甲氨蝶呤。

NSAID的实例包括但不限于布洛芬、氟比洛芬、萘普生和萘普生钠、双氯芬酸、双氯芬酸钠和米索前列醇的组合、舒林酸、奥沙普秦、二氟尼柳、吡罗昔康、吲哚美辛、依托度酸、非诺洛芬钙、酮洛芬、萘丁美酮钠、柳氮磺吡啶、托美丁钠和羟氯喹。NSAID的实例还包括COX-2特异性抑制剂例如塞来考昔、伐地考昔、芦米考昔和/或艾托考昔。

在一些实施方案中，抗炎剂是水杨酸酯或盐。水杨酸酯或盐包括但不限于乙酰基水杨酸或阿斯匹林、水杨酸钠以及水杨酸胆碱和水杨酸镁。

抗炎剂还可以是皮质类固醇。例如，皮质类固醇可以是可的松、***、甲泼尼龙、***龙、***龙磷酸钠或***。

在另外的实施方案中，抗炎剂是金化合物例如硫代苹果酸金钠或金诺芬。

本发明还包括其中抗炎剂是代谢抑制剂例如二氢叶酸还原酶抑制剂例如甲氨蝶呤或二氢乳清酸盐脱氢酶抑制剂例如来氟米特的实施方案。

本发明的其它实施方案涉及其中至少一种抗炎化合物是抗-C5单克隆抗体(例如依库珠单抗或培克珠单抗)、TNF拮抗剂例如依那西普(entanercept)或英利昔单抗的组合，所述英利昔单抗是一种抗-TNFα单克隆抗体。

本发明的再其它的实施方案涉及其中至少一种活性剂是免疫抑制剂化合物例如选自甲氨蝶呤、来氟米特、环胞素、他克莫司、硫唑嘌呤和吗替麦考酚酯中的免疫抑制剂化合物的组合。

表达BTK的B-细胞和B-细胞前体已经涉及B细胞恶性的病理学中，B细胞恶性包括但不限于B细胞淋巴瘤、淋巴瘤(包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、毛细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性和急性髓性白血病以及慢性和急性淋巴细胞白血病。

已经表明BTK是在B-系淋巴样细胞中Fas/APO-1(CD-95)死亡诱导信号传导复合物(DISC)的抑制剂。白血病/淋巴瘤细胞的命运可能在于由DISC活化的半胱天冬蛋白酶的反向前细胞凋亡作用和涉及BTK和/或其底物的上游抗细胞凋亡调节机理之间的平衡(Vassilev等人,J.Biol.Chem.1998,274,1646-1656)。

还发现BTK抑制剂可以用作化学敏化剂，因此可以用于与其它化学治疗药组合，所述的化学治疗药特别是诱导细胞凋亡的药。可以与化学敏化BTK抑制剂组合使用的其它化学治疗药的实例包括拓扑异构酶I抑制剂(喜树碱或托泊替康)、拓扑异构酶II抑制剂(例如道诺霉素和依托泊苷)、烷化剂(例如环磷酰胺、美法仑和BCNU)、微管蛋白导向的活性剂(例如泰素和长春碱)和生物活性剂(例如抗体例如抗CD20抗体、IDEC8、免疫毒素和细胞因子)。

BTK活性还与一些表达由部分染色体9和22的易位导致的bcr-abl融合基因的白血病相关。这种异常通常在慢性髓性白血病中观察到。BTK本质上由bcr-abl激酶磷酸化，这引发在bcr-abl细胞中防止细胞凋亡的下游生存信号(N.Feldhahn等人，J.Exp.Med.2005201(11):1837-1852)。

治疗方法

本申请提供了治疗炎性病症的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I化合物。

本申请提供了治疗哮喘的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I。

本申请提供了治疗炎性病症和/或自身免疫病症的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I的BTK抑制剂化合物。

本申请提供了治疗关节炎的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I的BTK抑制剂化合物。

本申请提供了治疗哮喘的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I的BTK抑制剂化合物。

本申请提供了抑制B-细胞增殖的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的式I的BTK抑制剂化合物。

本申请提供了抑制BTK活性的方法，该方法包括施用式I的任一种BTK抑制剂化合物，其中BTK抑制剂化合物在BTK活性的体外生化试验中显示50微摩尔或以下的IC₅₀。

在上述方法的一个变通实施方案中，BTK抑制剂化合物在BTK活性的体外生化试验中显示100纳摩尔或以下的IC₅₀。

在上述方法的另一个变通实施方案中，化合物在BTK活性的体外生化试验中显示10纳摩尔或以下的IC₅₀。

本申请提供了治疗炎性病症的方法，该方法包括给需要的患者共同施用治疗有效量的抗炎化合物与式I的BTK抑制剂化合物。

本申请提供了治疗关节炎的方法，该方法包括给需要的患者共同施用治疗有效量的抗炎化合物与式I的BTK抑制剂化合物。

本申请提供了治疗淋巴瘤或BCR-ABL1⁺白血病细胞的方法，该方法通过给需要的患者施用治疗有效量的式I的BTK抑制剂化合物来进行。

本发明提供了上述化合物在治疗炎性和/或自身免疫病症中的用途。

本发明提供了上述化合物在制备用于治疗炎性病症和/或自身免疫病症的药物中的用途。

本发明提供了上述化合物，其用于治疗炎性病症和/或自身免疫病症。

本发明提供了上述化合物，其用于治疗类风湿性关节炎。

本发明提供了上述化合物，其用于治疗哮喘。

本发明提供了如上所述的本发明。

实施例

通用缩略语

通常使用的缩略语包括：乙酰基(Ac)，偶氮二异丁腈(AIBN)，大气压(Atm)，9-硼杂二环[3.3.1]壬烷(9-BBN或BBN)，2,2’-双(二苯基膦基)-1,1’-联萘(BINAP)，叔丁氧基羰基(Boc)，焦碳酸二叔丁酯或boc酸酐(BOC₂O)，苄基(Bn)，丁基(Bu)，化学文摘登记号(CASRN)，苄基氧基羰基(CBZ或Z)，羰基二咪唑(CDI)，1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)，二乙基氨基三氟化硫(DAST)，二亚苄基丙酮(dba)，1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)，1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)，N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，1,2-二氯乙烷(DCE)，二氯甲烷(DCM)，2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)，偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)，偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，二异丁基氢化铝(DIBAL或DIBAL-H)，二异丙基乙基胺(DIPEA)，N,N-二甲基乙酰胺(DMA)，4-N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，1,1’-双-(二苯基膦基)乙烷(dppe)，1,1’-双-(二苯基膦基)二茂铁(dppf)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)，乙基(Et)，乙酸乙酯(EtOAc)，乙醇(EtOH)，2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(EEDQ)，***(Et₂O)，乙基异丙基醚(EtOiPr)、O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)，乙酸(HOAc)，1-N-羟基苯并***(HOBt)，高压液相色谱(HPLC)，异丙醇(IPA)，异丙基氯化镁(iPrMgCl)，六甲基二硅烷胺(HMDS)，液相色谱质谱(LCMS)，六甲基二硅烷胺锂(LiHMDS)，间-氯过氧基苯甲酸(m-CPBA)，甲醇(MeOH)，熔点(mp)，MeSO₂-(甲磺酰基或Ms)，甲基(Me)，乙腈(MeCN)，间氯过苯甲酸(MCPBA)，质谱(ms)，甲基叔丁基醚(MTBE)，甲基四氢呋喃(MeTHF)、N-溴琥珀酰亚胺(NBS)，正丁基锂(nBuLi)，N-羧基酸酐(NCA)，N-氯琥珀酰亚胺(NCS)，N-甲基吗啉(NMM)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，氯铬酸吡啶(PCC)，二氯-((双-二苯基膦基)二茂铁基)钯(II)(Pd(dppf)Cl₂)，乙酸钯(II)(Pd(OAc)₂)，三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(Pd₂(dba)₃)，重铬酸吡啶(PDC)，苯基(Ph)，丙基(Pr)，异丙基(i-Pr)，磅/平方英寸(psi)，吡啶(pyr)，1,2,3,4,5-五苯基-1’-(二叔丁基膦基)二茂铁(Q-Phos)，室温(环境温度，rt或RT)，仲丁基锂(sBuLi)，叔丁基二甲基甲硅烷基或t-BuMe₂Si(TBDMS)，四正丁基氟化铵(TBAF)，三乙胺(TEA或Et₃N)，2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)，三甲基甲硅烷基乙氧基甲基(SEM)，三氟甲磺酸根或CF₃SO₂-(Tf)，三氟乙酸(TFA)，1,1’-双-2,2,6,6-四甲基庚-2,6-二酮(TMHD)，O-苯并***-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)，薄层色谱(TLC)，四氢呋喃(THF)，三甲基甲硅烷基或Me₃Si(TMS)，一水合对甲苯磺酸(TsOH或pTsOH)，4-Me-C₆H₄SO₂-或甲苯磺酰基(Ts)，和N-尿烷基-N-羧基酸酐(UNCA)。当用于烷基部分时，包括前缀正(n)、异(i-)、仲(sec-)、叔(tert-)和新(neo)的常规命名法具有它们的惯用含义(J.Rigaudy和D.P.Klesney,NomenclatureinOrganicChemistry,IUPAC1979PergamonPress,Oxford.)。

一般条件

可以从商购原料开始，通过使用本领域技术人员公知的一般合成技术和方法制备本发明化合物。下文概述了适合于制备这种化合物的反应流程图。另外的示例可以在具体实施例中找到。

具体缩略语

boc叔丁氧基羰基

CH₂Cl₂二氯甲烷

Cs₂CO₃碳酸铯

DCM二氯甲烷

DMFN,N-二甲基甲酰胺

DMSO二甲亚砜

EtOAc乙酸乙酯

HATUO-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基

脲六氟磷酸盐

Hunig’sBaseN,N-二异丙基乙基胺

HCl氯化氢

LC-MS液相色谱质谱

HPLC高压液相色谱

MeOH甲醇

MgSO₄硫酸镁

nBuLi正丁基锂

NaCl氯化钠

Na₂CO₃碳酸钠

NaOMe甲醇钠

Na₂SO₄硫酸钠

NH₄OH氢氧化铵

NMP1-甲基-2-吡咯烷酮

NMR核磁共振

Pd(OAc)₂乙酸钯(II)

TFA三氟乙酸

THF四氢呋喃

TLC薄层色谱

TMSCl三甲基甲硅烷基氯

通用试验细节

试剂购自Aldrich、Oakwood、Matrix或其它供应商并且无需进一步纯化而应用。应用微波辐射来加热的反应应用PersonalChemistryEmrysOptimizerSystem或CEMDiscoverySystem进行。多毫克至多克范围的纯化通过本领域技术人员已知的方法进行，例如硅胶快速柱洗脱；制备型快速柱纯化在某些情况下也是有效的，通过应用处理的预填充多克硅胶柱(RediSep)，用CombiFlash***洗脱。Biotage^TM和ISCO^TM也是快速柱装置，其可以用于本发明来纯化中间体。

为了判断化合物的鉴别和纯化，LC/MS(液相色谱/质谱)谱应用以下***记录。对于质谱测定，该***由以下组成：MicromassPlatformII谱仪：ES电离阳极模式(质量范围：150-1200)。用以下HPLC***获得同时的色谱分离：ESIndustriesChromegabondWRC-183u(3.2×30mm)柱；流动相A：水(0.02％TFA)和相B：乙腈(0.02％TFA)；梯度10％B至90％B，在3分钟内；平衡时间1分钟；流速2mL/分钟。

很多式I化合物也通过反相HPLC纯化，应用本领域技术人员已知的方法。在某些情况中，制备型HPLC纯化应用PESciex150EXMassSpec控制Gilson215收集器连接Shimadzu制备型HPLC***和Leap自动进样器进行。化合物从洗脱流收集，应用LC/MS检测，阳离子检测。历经10分钟，从C-18柱(2.0×10cm，在20mL/分钟洗脱)洗脱化合物应用适合的线性梯度模式，溶剂(A)0.05％TFA/H₂O和溶剂(B)0.035％TFA/乙腈。对于注入HPLC***，将粗样品溶于甲醇、乙腈和DMSO的混合物中。

化合物通过¹H-NMR应用Bruker400MHzNMR谱仪表征。

本发明化合物可以根据已知的技术合成。提供以下实施例和参考以有助于理解本发明。但是，实施例不旨在限制本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中列出。实施例中终产物的名称应用IsisAutoNom2000产生。

制备实施例

实施例3、4、6和7的绝对立体化学是基于比较预期的生物效力和/或在手性超临界流体色谱上的相对保留时间并且没有被证实。

制备中间体A

步骤1.制备2-二甲氧基甲基-6-氟-苯甲酸

在N₂下，将1-二甲氧基甲基-3-氟-苯(100g，588mmol)的四氢呋喃(1L)溶液冷却至60℃。在60℃加入s-BuLi(1.4M，664mmol，475mL)。将产生的红色溶液在-60℃搅拌1小时。在2L烧瓶中在N₂下，加入干净的干冰(355g，5.88mol)和四氢呋喃(300mL)，然后加入n-BuLi(5mL)以除去残留水份。历经2小时，将以上红色阴离子溶液加入至在四氢呋喃中的干冰混合物中。将产生的淡棕色溶液再搅拌20分钟。反应完成后，加入水(1L)，然后将反应混合物用浓HCl水溶液(70mL)中和至pH＝2。将有机层分离并且保持并且将水层用乙酸乙酯(500mL)萃取。将合并的有机层用水(2×300mL)洗涤。将溶剂除去，然后将产生的粗产物结晶，提供2-二甲氧基甲基-6-氟苯甲酸，为淡棕色固体(84g，66％产率)。

步骤2.制备8-氟-2H-酞嗪-1-酮

将2-(二甲氧基甲基)-6-氟苯甲酸(60g，280mmol)、乙酸(39.8g，38mL)和肼(16.8g，16.3mL，420mmol)的异丙醇(150mL)溶液在100℃和N₂回流。2小时后，反应完成。加入乙酸乙酯(200mL)，然后加入水(400mL)以形成两相。将水相用乙酸乙酯(6×200mL)萃取。将有机层合并。将溶剂除去，提供8-氟-2H-酞嗪-1-酮，为黄色固体(32g，68％产率)。

步骤3.制备2-氯-6-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-苯甲醛

将8-氟-2H-酞嗪-1-酮(32g，195mmol)、2-氯-6-氟苯甲醛(40.1g，254mmol)和碳酸铯(63.7g，195mmol)的N,N-二甲基乙酰胺(200mL)溶液在55℃加热24小时。将水(100mL)加入至反应混合物中。将浆液搅拌1小时。将固体过滤并且用IPA/水(1:2，300mL)洗涤，然后用水(2×200mL)洗涤，得到2-氯-6-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-苯甲醛，为黄色固体(50g，84％产率)。

步骤4.制备2-(3-氯-2-羟基甲基-苯基)-8-氟-2H-酞嗪-1-酮

在硼氢化钠(1.19g，29.7mmol)的异丙醇(130mL)浆液中缓慢加入2-氯-6-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-苯甲醛(30g，99.1mmol)的N,N-二甲基乙酰胺(220mL)溶液。将混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物在冰浴下冷却，并且缓慢加入饱和的NH₄Cl溶液(220mL)。将浆液过滤并且用IPA/水(1:2，200mL)洗涤，提供2-(3-氯-2-羟基甲基-苯基)-8-氟-2H-酞嗪-1-酮，为黄色固体(27g，88％)。

步骤5.制备乙酸2-氯-6-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-苄基酯

在2-(3-氯-2-羟基甲基-苯基)-8-氟-2H-酞嗪-1-酮(26g，85.3mmol)的CH₂Cl₂(300mL)溶液中加入三乙胺(11.2g，111mmol)、乙酸酐(11.0g，111mmol)，然后加入DMAP(5.21g，4.26mmol)。将产生的混合物在室温搅拌直至完成。将反应用水(200mL)猝灭。将有机层用饱和的NaHCO₃水溶液(200mL)洗涤，然后用盐水(200mL)洗涤。除去溶剂，并且加入庚烷/乙酸乙酯(7:1，240mL)。将浆液在60℃加热2小时。缓慢冷却至室温过夜。通过过滤收集固体并且用庚烷洗涤，得到乙酸2-氯-6-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-苄基酯，为黄色固体(28.5g，96％)。

中间体A

步骤6.制备(2-(乙氧基甲基)-3-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)苯基)三氟硼酸钾

将乙酸2-氯-6-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-苄基酯(27g，77.9mmol)、二(频哪醇)二硼(29.7g，117mmol)、Pd(OAc)₂(719mg，3.36mmol)、X-PHOS(3.19g，6.72mmol)和乙酸钾(16.6g，169mmol)在甲基四氢呋喃(200mL)中的混合物脱气。将产生的混合物在75℃加热过夜。将混合物冷却后，加入2NHCl(100mL)并且将混合物搅拌1小时并且通过硅藻土饼过滤。将滤液的有机层分离，用水(180mL)洗涤并且浓缩，提供重油。将油状物溶于甲醇(300mL)中并且用氢氟化钾溶液(3M，77.9mL，234mmol)处理。将产生的浆液在45℃温热3小时，然后在室温搅拌过夜。将固体通过过滤收集并且用甲醇洗涤，提供(2-(乙氧基甲基)-3-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)苯基)三氟硼酸钾，为黄色固体(26g，92％产率)。

制备I-1

步骤1.制备2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-6-(6-甲氧基-2-甲基吡啶-3-基)苄基乙酸酯

在氩气下，在3-溴-6-甲氧基-2-甲基吡啶(830mg，4.11mmol)的正丁醇(56.0mL)溶液中加入(2-(乙氧基甲基)-3-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)苯基)三氟硼酸钾(其可以如Berthel,S.J.等人，US2011-497093P中描述的制备，实施例I-30中的中间体；1.95g，4.11mmol)、水(14.0mL)、磷酸钾(1.74g，8.22mmol)、X-PHOS(196mg，411μmol)和双(二亚苯基丙酮)钯(118mg，205μmol)。将反应混合物在100℃油浴中加热2小时直至通过LCMS和TLC(7:3己烷/乙酸乙酯)检测不到原料。将反应混合物冷却至室温；加入水并且将混合物用乙酸乙酯(2×)萃取。将有机萃取物用盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并且浓缩至干燥。通过快速柱纯化(AnalogixIntelliFlash280，AnalogixSF25-80g柱，己烷/乙酸乙酯0-60％梯度，45分钟)，得到2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-6-(6-甲氧基-2-甲基吡啶-3-基)苄基乙酸酯(1.63g，3.33mmol，81.1％产率)，为白色泡沫状物。LC/MS观察值[M+H]⁺490。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm1.42(s,9H)1.77(s,3H)2.28(s,3H)3.97(s,3H)4.68-5.00(m,2H)6.63(d,J＝8.31Hz,1H)7.29(dd,J＝7.55,1.51Hz,1H)7.37-7.62(m,5H)8.21(d,J＝2.64Hz,1H)。

步骤2.制备6-叔丁基-8-氟-2-[2-羟基甲基-3-(6-甲氧基-2-甲基-吡啶-3-基)-苯基]-2H-酞嗪-1-酮

在2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-6-(6-甲氧基-2-甲基吡啶-3-基)苄基乙酸酯(2.54g，5.19mmol)的甲醇(50mL)和四氢呋喃(10mL)溶液中加入碳酸钾(143mg，1.04mmol)。将反应混合物搅拌过夜。LCMS显示完全转化。在反应混合物中加入pH2缓冲液(10％KHSO₄/Na₂SO₄水溶液)，然后加入水并且将混合物用二氯甲烷(2×)萃取。将合并的有机萃取物用水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并且浓缩至干燥，得到定量产率或粗6-叔丁基-8-氟-2-(2-(羟基甲基)-3-(6-甲氧基-2-甲基吡啶-3-基)苯基)酞嗪-1(2H)-酮(2.45g)，为淡黄色泡沫状物，将其用于下面的步骤。LC/MS观察值[M+H]⁺448。

步骤3.制备2-[2-溴甲基-3-(6-甲氧基-2-甲基-吡啶-3-基)-苯基]-6-叔丁基-8-氟-2H-酞嗪-1-酮

在6-叔丁基-8-氟-2-(2-(羟基甲基)-3-(6-甲氧基-2-甲基吡啶-3-基)苯基)酞嗪-1(2H)-酮(2.18g，4.87mmol)的二氯甲烷(42.5mL)溶液中加入咪唑(348mg，5.12mmol)。将反应混合物冷却至0℃。在氩气气氛下，在该反应混合物中加入三苯膦(1.41g，5.36mmol)和溴(817mg，264μL，5.12mmol)。将反应混合物温至室温并且在该温度搅拌3小时。TLC(7:3己烷/EtOAc)显示无起始的醇。加入水并且将混合物用二氯甲烷(2×)萃取。将合并的有机萃取物干燥(Na₂SO₄)并且浓缩至干燥。通过快速柱纯化(AnalogixIntelliFlash280，AnalogixSF25-80g柱，己烷/乙酸乙酯0-30％梯度，10分钟，然后维持在30％乙酸乙酯，10分钟)，得到纯2-(2-(溴甲基)-3-(6-甲氧基-2-甲基吡啶-3-基)苯基)-6-叔丁基-8-氟酞嗪-1(2H)-酮(2.05g，4.02mmol，82.4％产率)。LC/MS观察值[M+H]⁺510、512。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm1.43(s,9H)2.31(s,3H)3.99(s,3H)4.17(d,J＝10.58Hz,1H)4.36(d,J＝10.58Hz,1H)6.67(d,J＝8.31Hz,1H)7.21-7.27(m,1H)7.37-7.45(m,1H)7.46-7.59(m,4H)8.29(d,J＝2.64Hz,1H)。

步骤4.制备2-[2-溴甲基-3-(2-溴甲基-6-甲氧基-吡啶-3-基)-苯基]-6-叔丁基-8-氟-2H-酞嗪-1-酮

将2-(2-(溴甲基)-3-(6-甲氧基-2-甲基吡啶-3-基)苯基)-6-叔丁基-8-氟酞嗪-1(2H)-酮(2.05g，4.02mmol)的四氯化碳(363mL)悬浮液加热至50℃直至大部分溶解，然后在氮气气氛下加入AIBN(33.0mg，201μmol)和N-溴琥珀酰亚胺(751mg，4.22mmol)。将混合物在回流下加热3.5小时。冷却至室温后，将混合物过滤。将固体用四氯化碳洗涤。将合并的滤液和洗涤液浓缩至小体积。通过快速柱纯化(AnalogixIntelliFlash280，ThompsonSF25-80g柱，己烷/(1:1乙酸乙酯/二氯甲烷)，10-30％梯度，10分钟，然后保持在30％乙酸乙酯/二氯甲烷，10分钟)，得到纯级分和混合的级分。将混合的级分再进行色谱并且将纯产物合并，得到2-(2-(溴甲基)-3-(2-(溴甲基)-6-甲氧基吡啶-3-基)苯基)-6-叔丁基-8-氟酞嗪-1(2H)-酮(1.79g，3.04mmol，75.6％产率)，为白色泡沫状物，211mg(10％)回收的原料。产物LC/MS观察值[M+H]⁺590。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm1.43(s,9H)4.02(s,3H)4.08-4.45(m,4H)6.78(d,J＝8.31Hz,1H)7.39-7.64(m,6H)8.29(d,J＝2.27Hz,1H)。

步骤5.制备8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-3-甲氧基-5H,7H-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-6-酮

在0℃，在氢氧化钠(1.3g，32.4mmol)和四丁基碘化铵(239mg，648μmol)在水(12mL)和二氯甲烷(30mL)中的混合物中滴加甲苯磺酰基甲基异氰化物(1.27g，6.48mmol)的二氯甲烷(18.0mL)溶液，然后是2-(2-(溴甲基)-3-(2-(溴甲基)-6-甲氧基吡啶-3-基)苯基)-6-叔丁基-8-氟酞嗪-1(2H)-酮(1.91g，3.24mmol)的二氯甲烷(18.0mL)溶液。除去冰浴，并且将混合物在室温剧烈搅拌24小时。TLC(二氧化硅，7:3己烷/乙酸乙酯)显示仅痕量的原料剩余。加入水并且将混合物用二氯甲烷(2×)萃取。将合并的有机萃取物用水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并且浓缩至干燥，得到粗6-叔丁基-8-氟-2-[6-异氰基-3-甲氧基-6-(甲苯-4-磺酰基)-6,7-二氢-5H-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-8-基]-2H-酞嗪-1-酮(2.97g)，将其直接用于下面的步骤。在粗6-叔丁基-8-氟-2-[6-异氰基-3-甲氧基-6-(甲苯-4-磺酰基)-6,7-二氢-5H-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-8-基]-2H-酞嗪-1-酮(2.97g)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入浓盐酸(15.9mL，191mmol)。将产生的混合物在室温搅拌3小时，直至通过TLC(7:3己烷/乙酸乙酯)显示原料完全消耗。小心加入10％碳酸氢钠直至观察不到起泡。再加入水，并且将混合物用乙酸乙酯(2×)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并且浓缩至干燥。通过快速柱纯化(AnalogixIntelliFlash280,AnalogixSF25-40g柱，己烷/乙酸乙酯0-25％梯度，15分钟，然后保持在25％己烷/乙酸乙酯，15分钟)，提供795mg的8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-3-甲氧基-5H,7H-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-6-酮(54％产率)。产物LC/MS观察值[M+H]⁺458。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm1.43(s,9H)3.38(br.s.,2H)3.80(br.s.,2H)3.98(s,3H)6.83(d,J＝8.31Hz,1H)7.37-7.66(m,5H)7.84(d,J＝8.31Hz,1H)8.23(d,J＝2.27Hz,1H)。

步骤6.制备8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-5,7-二氢-4H-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3,6-二酮

在氩气下，在8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-3-甲氧基-5H,7H-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-6-酮(795mg，1.74mmol)的乙腈(16.1mL)溶液中加入碘化钠(521mg，3.48mmol)和氯三甲基硅烷(378mg，440μL，3.48mmol)。将混合物在82-83℃加热3小时。TLC(6:4己烷/乙酸乙酯)显示没有原料，并且LCMS显示只有一个峰。冷却后，加入冷的10％硫代硫酸钠水溶液。产生的混悬液变为溶液，然后沉淀。加入一些乙酸乙酯并且将固体产物通过过滤收集并且用水洗涤数次，然后用乙酸乙酯洗涤，然后用醚洗涤，得到纯产物(约600mg)，通过LCMS确证。将滤液和洗涤液置于分液漏斗中。将混合物用乙酸乙酯(2×)萃取。将合并的有机层经MgSO₄干燥，过滤并且将滤液浓缩至小体积。通过过滤收集固体，用小体积的乙酸乙酯和醚洗涤。LCMS显示其是干净的产物。将该固体与第一次的固体合并，得到688mg的8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-5,7-二氢-4H-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3,6-二酮(90％产率)，为乳膏状有色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺444。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm1.43(s,9H)3.01-3.96(m,4H)6.71(d,J＝9.44Hz,1H)7.35-7.67(m,5H)7.80(d,J＝9.44Hz,1H)8.23(d,J＝2.64Hz,1H)。

步骤7.制备8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

在250mL圆底烧瓶中，将8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-5,7-二氢-4H-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3,6-二酮(824mg，1.86mmol)与二氯甲烷(50mL)和甲醇(2mL)合并，得到无色溶液。加入硼氢化钠(105mg，2.79mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时直至LCMS确定反应完成。加入NH₄Cl饱和溶液(10mL)。将反应混合物在室温搅拌10分钟，然后用水和二氯甲烷稀释并且将产生的固体通过过滤收集。将固体用水洗涤多次，然后用二氯甲烷/醚，然后用醚洗涤。将产生的乳膏状固体在泵上干燥，得到762mg纯产物8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮。将滤液和洗涤液置于分液漏斗并且用二氯甲烷(3×)萃取。将有机层经Na₂SO₄干燥并且真空浓缩。将粗物质通过快速色谱纯化(硅胶，24g，在DCM中的1.5％至4％MeOH)，得到另外的39mg纯产物8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮。将两批次合并，得到801mg(97％产率)纯产物，为乳膏状有色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺445.9。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δppm1.37(s,9H)2.07(d,J＝11.33Hz,1H)2.30-2.45(m,1H)2.61(br.s.,2H)4.18-4.51(m,1H)6.34(d,J＝9.06Hz,1H)7.29(br.s.,1H)7.43(d,J＝2.27Hz,2H)7.63(t,J＝7.93Hz,1H)7.76(d,J＝13.60Hz,1H)7.88(br.s.,1H)8.52(d,J＝4.91Hz,1H)11.89(br.s.,1H)。

步骤8.制备6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

在25mL圆底烧瓶中，将8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(636mg，1.43mmol)与DMF(18mL)合并，得到无色溶液。将反应混合物在冰浴中冷却。在反应混合物中加入2,6-二甲基吡啶(337mg，366μL，3.14mmol)并且通过滴加加入叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(830mg，721μL，3.14mmol)。将反应混合物历经40分钟温至室温。通过LCMS确定反应完成。加入甲醇，然后加入NH₄Cl饱和溶液。继续搅拌5分钟。将反应混合物倾倒至150mLH₂O中并且用二氯甲烷(3×75mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄干燥并且真空浓缩，得到0.79g的6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(98％产率)。将该产物与先前批次的产物(0.17g)合并，得到0.96g标题化合物。产物LC/MS观察值[M+H]⁺560.1。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm-0.11(s,3H)-0.01(br.s.,3H)0.69(s,9H)1.43(s,9H)2.23(dd,J＝13.22,9.44Hz,1H)2.44-2.88(m,3H)4.54-4.97(m,1H)6.60(d,J＝9.44Hz,1H)7.28-7.56(m,6H)7.65(br.s.,1H)8.22(d,J＝2.64Hz,1H)。

步骤9.制备6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

在25℃和氩气下，在6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(0.96g，1.72mmol)的四氢呋喃(25mL)混悬液中加入1M在四氢呋喃中的六甲基二硅烷胺锂(1.8mL，1.8mmol)。将混合物在室温搅拌10分钟。加入碘甲烷(487mg，214μL，3.43mmol)。90分钟后，反应完成90％。加入另外2滴碘甲烷(2滴)并且将反应混合物在室温搅拌30分钟。没有形成进一步的产物。加入另外的1M在四氢呋喃中的六甲基二硅烷胺锂(0.2mL)并且将反应混合物在室温搅拌30分钟。没有形成进一步的产物。将反应混合物用饱和NH₄Cl溶液猝灭。将反应混合物倾倒至150mLH₂O中并且用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，然后用二氯甲烷(1×)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经MgSO₄干燥并且真空浓缩。将粗物质通过快速色谱纯化(硅胶，40g，1.5％至3％在二氯甲烷中的甲醇)，得到759mg的6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(77％产率)，为乳膏状有色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺574.1。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm-0.13(s,3H)-0.02(s,3H)0.76(br.s.,9H)1.44(s,9H)2.22(br.s.,1H)2.65(d,J＝6.80Hz,2H)3.04(d,J＝14.73Hz,1H)3.76(s,3H)4.60-5.08(m,1H)6.63(d,J＝9.44Hz,1H)7.28-7.60(m,6H)8.23(d,J＝2.27Hz,1H)。

步骤10.制备2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

在10mL圆底烧瓶中，将6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(260mg，453μmol)与二氯甲烷(10mL)合并，得到无色溶液。加入氢溴酸(80.2mg，53.8μL，476μmol)，然后立即加入亚硝酸异戊酯(111mg，128μL，952μmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时。通过LCMS确定反应完成。将反应混合物倾倒至75mL饱和的NaHCO₃/H₂O中并且用二氯甲烷(3×50mL)萃取。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥并且真空浓缩。将粗物质通过快速色谱纯化(硅胶，24g，15％至50％在己烷中的乙酸乙酯)，得到278mg的2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，为白色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺652、654。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm-0.13(s,3H)-0.02(s,3H)0.77(s,9H)1.44(s,9H)2.19(br.s.,1H)2.66(br.s.,2H)3.02(d,J＝13.97Hz,1H)3.84(s,3H)4.60-5.06(m,1H)7.27-7.61(m,5H)7.90(s,1H)8.23(br.s.,1H)。

步骤11.制备6-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

在氩气下，在(6-氨基吡啶-3-基)(吗啉代)甲酮(87.0mg，420μmol)和2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(274mg，420μmol)的二烷(7mL)溶液中加入碳酸铯(410mg，1.26mmol)、4,5-二(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(36.4mg，63.0μmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(19.2mg，21.0μmol)。将反应混合物在100℃加热14小时，然后使其冷却至室温。将反应混合物用二氯甲烷稀释，经Na₂SO₄干燥并且通过硅藻土过滤。将硅藻土垫用二氯甲烷洗涤。将合并的滤液和洗涤液浓缩并且将粗物质通过快速色谱纯化(硅胶，40g，1％在二氯甲烷中的甲醇；然后1％至4％在二氯甲烷中的甲醇梯度)，得到270mg的6-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(83％产率)。产品LC/MS观察值[M+H]⁺779。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm-0.14(s,3H)-0.02(s,3H)0.76(s,9H)1.44(s,9H)2.25(br.s.,1H)2.64(br.s.,2H)3.00(d,J＝14.35Hz,1H)3.71(d,J＝8.69Hz,8H)3.86(s,3H)4.58-5.08(m,1H)6.84(d,J＝8.31Hz,1H)7.28-7.75(m,6H)8.23(d,J＝2.27Hz和覆盖br.S.,2H)8.35(br.s.,1H)8.77(br.s.,1H)。

实施例1

步骤12.制备8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

在100mL圆底烧瓶中，将6-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮与四氢呋喃(6.0mL)合并，得到黄色溶液。加入四丁基氟化铵溶液(514μL，1M，在四氢呋喃中，514μmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，倾倒至75mLH₂O中并且用乙酸乙酯(2×75mL)和二氯甲烷(1×)萃取。将合并的有机层经MgSO₄干燥并且真空浓缩。将粗物质通过快速色谱纯化(硅胶，40g，5％至30％(60:10:1二氯甲烷:甲醇:NH₄OH)，在二氯甲烷中)，得到玻璃状物。将该玻璃状物溶于少量的二氯甲烷中并且加入醚。将产生的沉淀的固体通过过滤收集并且用醚研磨，得到135mg纯产物8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，为白色粉末。产物LC/MS观察值[M+H]⁺665。¹HNMR(300MHz,氯仿-d)δppm1.43(s,9H)2.14-2.88(m,3H)3.17(d,J＝12.46Hz,1H)3.71(d,J＝9.06Hz,8H)3.83(s,3H)3.95-4.20(m,1H)4.39(br.s.,1H)6.83(d,J＝8.31Hz,1H)7.32(d,J＝7.18Hz,1H)7.45-7.73(m,5H)8.03-8.43(m,3H)8.77(s,1H)。浓缩滤液，得到另外的84mg纯产物，为白色固体。总产率为219mg(96％产率)。

实施例2

8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-((S)-1-甲基-吡咯烷-2-基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

通过实施例1的类似方法制备，除了在步骤11中用5-((S)-1-甲基-吡咯烷-2-基)-吡啶-2-基胺((其可以如Berthel,S.J.等人US2011-497093P描述的制备，实施例I-18中的中间体)代替(6-氨基吡啶-3-基)(吗啉代)甲酮，得到55mg标题化合物，为白色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺635。

实施例3

(S)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

在10mL圆底烧瓶中，将6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(490mg，854μmol)与二氯甲烷(18.8mL)合并，得到无色溶液。加入HBr(151mg，101μL，897μmol)，然后立即加入亚硝酸异戊酯(210mg，241μL，1.79mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时，直至通过TLC显示完成。将反应混合物倾倒至75mL饱和的NaHCO₃/H₂O中并且用二氯甲烷(3×50mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并且将滤液真空浓缩。将物质溶于乙酸乙酯并且再次浓缩，得到560mg(100％)的2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，为淡黄色固体。将该外消旋2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(360mg)用于手性分离。

手性分离应用超临界流体色谱，应用KROMASILOD柱(30％甲醇，在CO₂洗脱中)，得到170mg的(S)-2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，为第一洗脱峰和173mg的(R)-2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，为第二洗脱峰。

在氩气下，在(6-氨基吡啶-3-基)(吗啉代)甲酮(8.89mg，42.9μmol)和(S)-2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(28mg，42.9μmol)的二烷(715μL)溶液中加入碳酸铯(41.9mg，129μmol)、4,5二(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(3.72mg，6.44μmol)和三(二亚苯基丙酮)二钯(0)(1.96mg，2.15μmol)。将混合物在100℃加热14小时，然后将其冷却至室温。将粗反应混合物用二氯甲烷(15mL)稀释并且用Na₂SO₄干燥。将固体过滤并且用二氯甲烷洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩。将粗产物通过快速色谱纯化(硅胶，12g，1％，然后1％至4％在二氯甲烷中的甲醇)，得到24.5mg的(S)-6-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，其本身用于下面的步骤。产物LC/MS观察值[M+H]⁺779。在50mL圆底烧瓶中，将(S)-6-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(24.5mg，31.5μmol)与THF(1.5mL)合并，得到黄色溶液。加入四丁基氟化铵溶液(47.2μL，1M，在四氢呋喃中，47.2μmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，直至通过LCMS显示完成。将反应混合物倾倒至75mLH₂O中并且用乙酸乙酯(2×75mL)和1×二氯甲烷萃取。将有机层经MgSO₄干燥并且真空浓缩。将粗物质通过快速色谱纯化(硅胶，40g，5％至30％(60:10:1二氯甲烷:甲醇:NH₄OH)，在二氯甲烷中)，得到纯产物，为玻璃状物。将产物溶于小体积的二氯甲烷中并且加入醚。白色固体沉淀出来，得到18mg(63％)的(S)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，为白色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺665。

实施例4

(R)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

在氩气下，在(6-氨基吡啶-3-基)(吗啉代)甲酮(7.94mg，38.3μmol)和(R)-2-溴-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(在实施例3中制备，25mg，38.3μmol)的二烷(638μL)溶液中加入碳酸铯(37.4mg，115μmol)、4,5二(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(3.32mg，5.75μmol)和三(二亚苯基丙酮)二钯(0)(1.75mg，1.92μmol)。将混合物在100℃加热14小时，然后将其冷却至室温。将粗反应混合物用二氯甲烷(15mL)稀释并且用Na₂SO₄干燥。将固体过滤并且用二氯甲烷洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩。将粗产物通过快速色谱纯化(硅胶，12g，1％，然后1％至4％在二氯甲烷中的甲醇)，得到21.3mg的(R)-6-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，其本身用于下面的步骤。产物LC/MS观察值[M+H]⁺779。

在50mL圆底烧瓶中，将(R)-6-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮(21.3mg，27.3μmol)与THF(1.5mL)合并，得到黄色溶液。加入四丁基氟化铵溶液(41.0μL，1M在四氢呋喃中，41.0μmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，直至通过LCMS显示完成。将反应混合物倾倒至75mLH₂O中并且用乙酸乙酯(2×75mL)和1×二氯甲烷萃取。将有机层经MgSO₄干燥并且真空浓缩。将粗物质通过快速色谱纯化(硅胶，40g，5％至30％(60:10:1二氯甲烷:甲醇:NH₄OH)，在二氯甲烷中)，得到纯产物，为玻璃状物。将产物溶于小体积的二氯甲烷中并且加入醚。白色固体沉淀出来，得到15mg(59％)的(R)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，为白色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺665。

实施例5

8-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

通过实施例1的类似方法制备，除了在步骤1中用(2-(乙氧基甲基)-3-(8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)苯基)三氟硼酸钾代替(2-(乙氧基甲基)-3-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)苯基)三氟硼酸钾，得到60mg的标题化合物，为淡棕色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺609。

实施例6

(S)-8-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

通过实施例3的类似方法制备，除了用6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮代替6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，得到87mg的标题化合物，为淡棕色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺609。

实施例7

(R)-8-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-6-羟基-4-甲基-2-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基氨基]-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮

通过实施例4的类似方法制备，除了用(R)-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮代替(R)-6-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-8-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[3,4]环庚烷[1,2-b]吡啶-3-酮，得到11mg的标题化合物，为淡棕色固体。产物LC/MS观察值[M+H]⁺609。

生物学实施例

布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制测定

该测定是通过过滤捕获放射性³³P磷酸化产物。BTK、生物素化的SH₂肽底物(Src同源性)与ATP的相互作用导致肽底物的磷酸化。生物素化的产物是结合的链霉亲和素琼脂糖珠。所有结合的、放射性标记的产物通过闪烁计数器检测。

测定的板是96-孔聚丙烯(Greiner)和96孔1.2μm亲水性PVDF过滤板(Millipore)。在此处报道的浓度是最终测定浓度：在DMSO(Burdick和Jackson)中的10-100μM化合物、5-10nMBTK酶(His-标记的，全长)、30μM肽底物(生物素-Aca-AAAEEIYGEI-NH₂)、100μMATP(Sigma)、8mM咪唑(Sigma，pH7.2)、8mM甘油-2-磷酸(Sigma)、200μMEGTA(RocheDiagnostics)，1mMMnCl₂(Sigma)，20mMMgCl₂(Sigma)，0.1mg/mLBSA(Sigma)，2mMDTT(Sigma)、1μCi³³PATP(Amersham)、20％链霉亲和素琼脂糖珠(Amersham)、50mMEDTA(Gibco)、2MNaCl(Gibco)、2MNaClw/1％磷酸(Gibco)，microscint-20(PerkinElmer)。

使用从标准的96孔板测定模板产生的数据，从每个化合物的10个数据点计算IC₅₀测定值。在每个板上测试一种对照化合物和七种未知抑制剂，并且每个板进行两次。典型地，以半对数(half-log)稀释化合物，从100μM开始并且以3nM结束。对照化合物是星形孢菌素。在不存在肽底物时计数背景。在存在肽底物时，测定总活性。使用下列方法来测定BTK抑制。

1)样品制备：将试验化合物以半对数增量，在测定缓冲液(咪唑，甘油-2-磷酸，EGTA，MnCl₂，MgCl₂，BSA)中稀释。

2)珠制备

a.)通过在500g离心冲洗珠

b.)用PBS和EDTA重构所述珠，产生20％珠的浆液

3)在30℃预温育不含底物的反应混合物(测定缓冲液，DTT，ATP，³³PATP)和具有底物的混合物(测定缓冲液，DTT，ATP，³³PATP，肽底物)达15分钟。

4)为了起始测定，在室温预温育10μL在酶缓冲液(咪唑，甘油-2-磷酸，BSA)中的BTK和10μL的试验化合物达10分钟。

5)将30μL不含有或含有底物的反应混合物加入到BTK和化合物中。

6)在30℃温育50μL的总测定混合物达30分钟。

7)将40μL的测定物转移到过滤板中的150μL珠浆液中来终止反应。

8)在30分钟后，用下列步骤洗涤过滤板：

a.3×250μLNaCl

b.3×250μL含1％磷酸的NaCl

c.1×250μLH₂O

9)在65℃干燥板1小时或在室温干燥板过夜。

10)加入50μLmicroscint-20并且在闪烁计数器上计数³³Pcpm。

从以cpm表示的原始数据计算百分比活性

百分比活性＝(样品-bkg)/(总活性-bkg)×100

使用一位点(one-site)剂量响应S形曲线模型从百分比活性计算IC₅₀

y＝A+((B-A)/(1+((x/C)^D))))

x＝化合物浓度，y＝％活性，A＝min，B＝max，C＝IC₅₀，D＝1(hill斜率)

布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制TR-FRET(时间分辨FRET)测定

应用FRET(ResonanceEnergyTransfer)技术，该BTK竞争测定测量了化合物对布鲁顿氏酪氨酸激酶灭活状态的效力(IC50)。将BTK-Eu复合物在冰上温育1小时，然后以起始浓度50nMBTK-Bioease^Tm:10nMEu-链霉亲和素(Perkin-ElmerCatalog#AD0062)应用。测定缓冲液由20mMHEPES(pH7.15)、0.1mMDTT、10mMMgCl₂、0.5mg/mLBSA，含3％KinaseStabilizer(FremontBiosolutions,Catalog#STB-K02)组成。1小时后，将上述反应混合物在测定缓冲液中稀释10倍成为5nMBTK:1nMEu-链霉亲和素复合物(宿主荧光团)。将18μL0.11nMBTK-Eu和0.11nMKinaseTracer178(Invitrogen,Catalog#PV5593)的混合物与BTK-Eu单独作为阴性对照，然后将其分散在384-孔平底板(Greiner,784076)中。在测定中的试验化合物制备为10×浓度并且在DMSO中以半对数递增系列稀释，以便产生10点曲线。为了引发FRET反应，将在DMSO中制备的10×化合物加入至板中并且将板在14℃温育18-24小时。

温育后，将板在BMGPherastarFluorescent读板仪(或等价装置)上读取并且用于测定铕宿主荧光团(620nm发射)和FRET(665nm发射)的发射能量。将阴性对照孔的值平均得到平均最小值。将阳性“无抑制剂”对照孔平均得到平均最大值。最大FRET的百分比应用下式计算：

％最大FRET＝100×[(FSR_化合物-FSR_{平均最小值})/(FSR_{平均最大值}-FSR_平均最小 _值)]

其中FSR＝FRET信号比例。％最大FRET曲线在ActivityBase(Excel)中作图并且确定IC50(％)、hill斜率、z’和％CV。平均IC50和标准差应用MicrosoftExcel得自一式两份曲线(来自两个独立稀释的单抑制曲线)。

通过CD69表达测量的全血中的B细胞活化的抑制

用于试验BTK抑制剂抑制在人血液中B细胞的B细胞受体介导的活化的能力的程序如下：

人全血(HWB)获自健康志愿者，满足以下限制：24hr不用药，不吸烟者。通过静脉穿刺将血液收集到用肝素钠抗凝化的Vacutainer管中。试验化合物在PBS中稀释至10倍所需初始药物浓度(20x)，接着在10％的在PBS中的DMSO中三倍系列稀释，得到9点的剂量响应曲线。将5.5μL的每种化合物稀释液一式两份添加到2mL96孔V型底的板(AnalyticalSales和Services，#59623-23)上；向对照和无刺激孔中添加5.5μL的10％在PBS中的DMSO。向每孔添加HWB(100μL)，在混合后将板在37C、5％CO₂、100％湿度温育30分钟。在混合下向每孔(无刺激孔除外)添加羊F(ab’)2抗人IgM(SouthernBiotech，#2022-14)(10μL的500μg/mL溶液，50μg/mL最终浓度)，并且将板温育另外20小时。

在20小时温育结束时，将样品与荧光探针标记的抗体(15μLPE小鼠抗人CD20，BDPharmingen，#555623，和/或20μLAPC小鼠抗人CD69，BDPharmingen#555533)在37℃、5％CO₂、100％湿度温育30分钟。包括用于补偿调节和初始电压设置的诱导对照、未染色的和单染色剂。然后将样品用1mL的1×PharmingenLyseBuffer(BDPharmingen#555899)裂解，并且将板在1800rpm离心5分钟。通过抽吸除去上清液，并且将残留的沉淀用另外1mL的1×PharmingenLyseBuffer再次裂解，并且将板如前离心(spundown)。吸出上清液，并且将残留的沉淀在FACs缓冲液(PBS+1％FBS)中洗涤。在最后旋转后，除去上清液，并且将沉淀重悬浮在180μL的FACs缓冲液中。将样品转移至适于在BDLSRII流式细胞器的HTS96孔体系上运行的96孔板。

采用适合所用荧光团的激发和发射波长，获取数据并且采用CellQuestSoftware获得百分比阳性细胞值。结果最初用FACS分析软件(FlowJo)分析。试验化合物的IC50定义为使CD69阳性细胞的百分比下降50％的浓度，所述CD69阳性细胞在用抗IgM刺激后也是CD20阳性的(8个对照孔的平均，在扣除8个无刺激背景的孔的平均值后)。IC50值是使用XLfit软件版本3，公式201计算的。

该测定的代表性化合物的数据列于下表II中。

表II.

化合物	FRET IC50(μmol)	HWB IC50(μM)
			1	0.00092	0.013
2	0.00082	0.049
			3	0.00091	0.026
4	0.0013	0.148
			5	0.41418
6	0.23485	4.383
			7	3.09028

B-细胞活化的抑制-在Ramos细胞中的B细胞FLIPR测定

通过测定试验化合物对于抗-IgM刺激的B细胞响应的影响，证明本发明化合物对B细胞活化的抑制。

B细胞FLIPR测定是测定潜在抑制剂对于由抗-IgM抗体刺激导致的细胞内钙增加的影响的、基于细胞的功能方法。将Ramos细胞(人Burkitt’s淋巴瘤细胞系。ATCC-No.CRL-1596)培养在生长培养基(下述)中。在测定前一天，将Ramos细胞重悬浮在新鲜的生长培养基(与上相同)中并且以0.5×10⁶/mL的浓度放置在组织培养瓶中。在测定当天，对细胞计数并且将其以1×10⁶/mL的浓度放入在组织培养瓶中补充了1μMFLUO-3AM(TefLabs目录号0116，在无水DMSO和10％Pluronicacid中制备)的生长培养基中，并且在37℃(4％CO₂)温育1小时。为了去除细胞外染料，通过离心(5分钟，1000rpm)收集细胞，以1×10⁶个细胞/mL重新悬浮在FLIPR缓冲液(下述)中，接着以1×10⁵个细胞/孔分配在96-孔聚-D-赖氨酸包被的黑色/透明的板(BD目录号356692)中。加入从100μM到0.03μM范围内的多个浓度(7个浓度，下面详述)的试验化合物，并且使其与细胞一起在室温温育30分钟。通过加入10μg/mL抗-IgM(SouthernBiotech，目录号2020-01)刺激Ramos细胞Ca²⁺信号传导并且在FLIPR(MolecularDevices，使用具有在480nM激发的氩激光器的CCD照相机捕获96孔板的图像)上测量。

介质/缓冲液：

生长培养基：RPMI1640培养基，其含有L-谷氨酰胺(Invitrogen，目录号61870-010)，10％胎牛血清(FBS，SummitBiotechnology目录号FP-100-05)；1mM丙酮酸钠(Invitrogen目录号11360-070)。

FLIPR缓冲液：HBSS(Invitrogen，目录号141175-079)，2mMCaCl₂(Sigma，目录号C-4901)，HEPES(Invitrogen，目录号15630-080)，2.5mM丙磺舒(Sigma，目录号P-8761)，0.1％BSA(Sigma，目录号A-7906)，11mM葡萄糖(Sigma，目录号G-7528)。

化合物稀释细节：

为了获得100μM的最高最终测定浓度，将24μL的10mM化合物储备溶液(在DMSO中制备)直接加入到576μL的FLIPR缓冲液中。将试验化合物稀释在FLIPR缓冲液中(使用Biomek2000自动移液器)得到下列稀释方案：溶剂，1.00×10^-4M，1.00×10^-5，3.16×10^-6，1.00×10^-6，3.16×10^-7，1.00×10^-7，3.16×10^-8。

测定和分析：

使用最大-最小统计(使用MolecularDevicesFLIPR对照和统计输出软件，从由加入所述刺激抗体导致的峰减去静止的基线)报道钙的细胞内增加。使用非线性曲线拟合(GraphPadPrism软件)确定IC₅₀。

小鼠胶原-诱导的关节炎(mCIA)

在第0天，将小鼠用II型胶原在完全弗氏佐剂(CFA)中的乳剂注射，在尾巴基部或在背部上的几个位置注射(皮内)。在胶原免疫之后，动物将在约21至35天出现关节炎。关节炎的发作通过在第21天***施用在不完全弗氏佐剂(IFA；皮内)中的胶原而同步(增强)。在第20天之后每天检查动物轻微关节炎(1或2分；参考下面的评分描述)的任何发作，这是增强的信号。在增强后，将小鼠评分并且将候选的治疗剂以预定的时间(典型地2-3周)和给药频率给药，每天一次(QD)或每天两次(BID)。

大鼠胶原-诱导的关节炎(rCIA)

在第0天，将大鼠用II型牛胶原在不完全弗氏佐剂(IFA)中的乳剂注射，在背部上的几个位置皮内注射(皮内)。在约第7天在尾巴基部或背部的备选位点提供胶原乳剂的加强注射(皮内)。在初始胶原注射之后的12-14天通常观察到关节炎。从第14天起，如下面所述(关节炎的评价)可以评价动物的关节炎的进展。将动物用候选的治疗剂以预防的方式，开始于二次激发时给药，并且以预定的时间(典型地2-3周)和给药频率给药，每天一次(QD)或每天两次(BID)。

关节炎的评价:

在两种模型中，使用评分***对爪和肢关节的炎症发展进行定量，所述的评分***包括按照下面所述的标准对4个爪的评估：

评分：1＝爪或一个趾的肿胀和/或发红。

2＝两个或更多个关节肿胀。

3＝爪的总体肿胀，涉及多于两个关节。

4＝整个爪和趾的严重关节炎。

如下进行评估：在第0天进行基线测量，并且在第一个征候或肿胀时再次开始，每周至多三次，直至试验结束。通过将四个单爪评分加和来获得每只小鼠的关节炎指数，每只动物的最大分数为16。

大鼠体内哮喘模型

将雄性Brown-Norway大鼠用在0.2mL明矾中的100μgOA(卵清蛋白)每周腹膜内致敏一次，致敏三周(第0、7和14天)。在第21天(最后致敏后一周)，将大鼠用介质或化合物制剂皮下每日给药一次，0.5小时后进行OA气溶胶激发(1％OA，达45分钟)并且在激发4或24小时后终止。在处死时，从所有动物收集血清和血浆用于分别进行血清学研究和PK。***气管套管并且将肺用PBS灌洗3×。分析BAL流体的总白细胞数和差别白细胞计数。细胞等份试样(20-100μL)中的总白细胞数是通过CoulterCounter确定的。对于差别白细胞计数，将50-200μL样品在Cytospin中离心并且用Diff-Quik将载玻片染色。采用标准形态学标准，在光学显微镜下计数单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性白细胞和淋巴细胞的比例，并且用百分比表示。代表性的BTK抑制剂显示：OA致敏的和激发的大鼠的BAL中总白细胞计数与对照水平相比下降。

已经通过举例说明和实施例的方式比较详细地描述了上述发明，以用于清楚和理解的目的。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行改变和修饰。因此，应该理解上述描述意在是举例说明性的而不是限制性的。因此，本发明的范围不应该参考上述描述而确定，而应该参考下列所附的权利要求以及由权利要求授权的等价物的全部范围而确定。

将本申请中引用的全部专利、专利申请和出版物的全部内容通过引用并入本文作为参考以满足全部目的到这样的程度，就如同每个专利、专利申请或出版物是分别指明的一样。

Claims

1.式I化合物，

其中：

X是卤素；

Y是H或低级烷基；

R是-R¹-R²-R³；

R¹是杂芳基；

R²是-C(＝O)或不存在；

R³是杂环烷基，其任选被一个或多个R^3’取代；并且

或其可药用盐。

2.权利要求1的化合物，其中X是F。

3.权利要求1或2的化合物，其中R¹是吡啶基。

4.权利要求1-3任意一项的化合物，其中R²是-C(＝O)。

5.权利要求1-4任意一项的化合物，其中R³是吗啉基。

6.权利要求1-5任意一项的化合物，其中Y是H。

7.权利要求1-5任意一项的化合物，其中Y是叔丁基。

8.权利要求3的化合物，其中R²不存在。

9.权利要求8的化合物，其中R³是吡咯烷基，其任选被一个或多个R^3’取代。

10.权利要求9的化合物，其中R^3’是甲基。

11.权利要求8-10任意一项的化合物，其中Y是H。

12.权利要求8-10任意一项的化合物，其中Y是叔丁基。

13.权利要求1-12任意一项的化合物，其选自：

14.治疗炎性病症和/或自身免疫病症的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-13任意一项的化合物。

15.治疗炎性病症的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-13任意一项的化合物。

16.治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-13任意一项的化合物。

17.治疗哮喘的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-13任意一项的化合物。

18.药物组合物，该药物组合物包含权利要求1-13任意一项的化合物与至少一种可药用载体、赋形剂或稀释剂混合。

19.权利要求1-13任意一项的化合物在治疗炎性病症和/或自身免疫病症中的用途。

20.权利要求1-13任意一项的化合物在制备用于治疗炎性病症和/或自身免疫病症的药物中的用途。

21.权利要求1-13任意一项的化合物，其用于治疗炎性病症和/或自身免疫病症。

22.如上所述的本发明。