CN105018542B - 烟曲霉teqa在制备奥沙西泮中的应用 - Google Patents

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本发明公开了烟曲霉TEQA的一种新用途，即烟曲霉TEQA在制备奥沙西泮中的应用。本发明要求保护烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC NO.3115在制备奥沙西泮中的应用。本发明还保护一种制备奥沙西泮的方法，包括如下步骤：发酵培养烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC NO.3115，得到奥沙西泮。本发明公开了烟曲霉TEQA的一种新用途，即烟曲霉TEQA发酵培养后可以得到奥沙西泮，操作简单、成本低廉、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为奥沙西泮类药物的资源开发提供了新途径。

Description

烟曲霉TEQA在制备奥沙西泮中的应用
技术领域
本发明涉及一种现有菌株的新用途，具体涉及烟曲霉TEQA在制备奥沙西泮中的应用。
背景技术
奥沙西泮，其物理形态为白色或类白色结晶性粉末，是一种短效苯二氮类药物，是多种苯二氮药物(如***、替马西泮、普拉西泮)的代谢产物。奥沙西泮作为药物于六十年代在欧美上市，临床上主要用于焦虑症、失眠症、酒精戒断的治疗。
奥沙西泮目前主要是以化学合成的方法进行生产，在制成片剂后，会有在合成过程中的副产物残留，从而影响疗效。利用微生物生产奥沙西泮，可以获得纯度较高的奥沙西泮单体，从而避免化学合成副产物的残留，并且微生物为活体为合成场所，利用生物自身的资源产生奥沙西泮药物，可以避免资源的浪费和对环境的破坏。微生物易于繁殖和大量培养，操作简单、成本低廉、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力，是生产奥沙西泮药物的理想途径。
发明内容
本发明的目的是提供烟曲霉TEQA的一种新用途，即烟曲霉TEQA在制备奥沙西泮中的应用。
本发明要求保护烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC NO.3115在制备奥沙西泮中的应用。
本发明还保护一种制备奥沙西泮的方法，包括如下步骤：发酵培养烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC NO.3115，得到奥沙西泮。
所述发酵培养的培养基具体可为马铃薯葡萄糖培养基。马铃薯葡萄糖培养基的组成具体可为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，加水定容至1000mL。马铃薯葡萄糖培养基的制备方法具体可为：将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，放入烧杯中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取滤液加入葡萄糖，再补足水，pH自然。
所述发酵培养的条件为：26-30℃、100-150r/min振荡培养5-9天。
所述发酵培养的条件具体可为：28℃、120r/min振荡培养7天。
所述方法中，具体可将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC NO.3115的单菌落接种至100ml马铃薯葡萄糖培养基，28℃、120r/min振荡培养7天。
所述方法还包括从所述发酵培养得到的发酵体系中分离菌丝体的步骤。具体可采用滤纸从所述发酵培养得到的发酵体系中分离菌丝体。所述滤纸具体可为：定性滤纸(102)中速。
所述方法还包括使用有机溶剂对所述菌丝体进行提取的步骤。所述有机溶剂具体可为甲醇和/或氯仿。
使用甲醇对所述菌丝体进行提取的步骤具体如下：
(1)取菌丝体，用甲醇悬浮，然后进行超声破碎(超声破碎的参数具体可为：功率150W，每工作20s停10s，3-4次循环)，然后室温静置1小时，然后用装有滤纸的抽滤器进行抽滤，分别收集滤液和破碎菌丝体；
(2)取步骤(1)得到的破碎菌丝体，加入甲醇，然后室温静置1小时，然后用装有滤纸的抽滤器进行抽滤，分别收集滤液和破碎菌丝体；
(3)取步骤(2)得到的破碎菌丝体，加入甲醇，然后室温静置1小时，然后用装有滤纸的抽滤器进行抽滤，分别收集滤液和破碎菌丝体；
(4)取步骤(3)得到的破碎菌丝体，加入甲醇，然后室温静置1小时，然后用装有滤纸的抽滤器进行抽滤，分别收集滤液和破碎菌丝体；
(5)取步骤(4)得到的破碎菌丝体，加入甲醇，然后室温静置1小时，然后用装有滤纸的抽滤器进行抽滤，收集滤液；
(6)将步骤(1)得到的滤液、步骤(2)得到的滤液、步骤(3)得到的滤液、步骤(4)得到的滤液和步骤(5)得到的滤液合并，减压蒸馏，得到浸膏；
(7)将步骤(6)所得到的浸膏用氯仿进行提取(具体可待氯仿充分渗透入浸膏后，室温静置1小时)，减压蒸馏，得到浸膏(又称粗提物)。
烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA已于2009年06月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.3115。烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQACGMCC NO.3115简称为烟曲霉TEQA。
本发明公开了烟曲霉TEQA的一种新用途，即烟曲霉TEQA发酵培养后可以得到奥沙西泮，操作简单、成本低廉、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为奥沙西泮类药物的资源开发提供了新途径。
附图说明
图1为GCMS总离子流图。
图2为保留时间为34.79min时的质谱图。
图3为与NIST数据库比对。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
滤纸：杭州特种纸业有限公司，定性滤纸(102)中速，直径9-15cm，根据需要裁减。奥沙西泮标准品：中检所,货号为171229-200603。
烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA已于2009年06月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.3115。烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQACGMCC NO.3115简称为烟曲霉TEQA。烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA记载于ZL200910086919.6中，公开(公告)号:CN101575576B，公开(公告)日:2010.12.01。
实施例1、利用烟曲霉TEQA制备奥沙西泮
一、培养烟曲霉TEQA
马铃薯葡萄糖液体培养基的组成为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，加水定容至1000mL。马铃薯葡萄糖液体培养基的制备方法：将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，放入烧杯中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取滤液加入葡萄糖，再补足水，pH自然。将100ml马铃薯葡萄糖液体培养基装于250ml三角瓶中，灭菌备用。
将烟曲霉TEQA的单菌落接种至100ml马铃薯葡萄糖液体培养基，28℃、120r/min振荡培养7天。
二、制备粗提物
1、取步骤一得到的发酵体系，采用滤纸分离并收集菌丝体。
2、取步骤1得到的菌丝体，用100ml甲醇悬浮，然后进行超声破碎(超声破碎的参数：功率150W，每工作20s停10s，3-4次循环)，然后室温静置1小时，然后用抽滤器(装有滤纸)进行抽滤，分别收集滤液和破碎菌丝体。
3、取步骤2得到的破碎菌丝体，加入100ml甲醇，然后室温静置1小时，然后用抽滤器(装有滤纸)进行抽滤，分别收集滤液和破碎菌丝体。
4、取步骤3得到的破碎菌丝体，加入100毫升甲醇，然后室温静置1小时，然后用抽滤器(装有滤纸)进行抽滤，分别收集滤液和破碎菌丝体。
5、取步骤4得到的破碎菌丝体，加入100毫升甲醇，然后室温静置1小时，然后用抽滤器(装有滤纸)进行抽滤，分别收集滤液和破碎菌丝体。
6、取步骤5得到的破碎菌丝体，加入100毫升甲醇，然后室温静置1小时，然后用抽滤器(装有滤纸)进行抽滤，收集滤液。
7、将步骤2得到的滤液、步骤3得到的滤液、步骤4得到的滤液、步骤5得到的滤液和步骤6得到的滤液合并，减压蒸馏，得到浸膏。
8、将步骤7所得到的浸膏用氯仿进行提取，氯仿充分渗透入浸膏后，室温静置1小时，减压蒸馏，得到浸膏(又称粗提物)。
三、GC-MS分析
取步骤二的8得到的粗提物，用甲醇溶解，然后用0.45μm微孔滤膜过滤并收集滤液，采用外标法进行GC-MS联机鉴定。以奥沙西泮标准品作为对照。
气相色谱条件：HP-5MS石英弹性毛细管柱(30.0m×250μm×0.25μm)，载气为高纯氦气(99.999％)，体积流量为1.0mL·min-1；进样口温度为250℃，色谱柱温度设置：初始温度为100℃，保持1min，以10℃/min升温至200℃，保持3min，最后以5℃/min升温至290℃，保持5min；进样量为1μL。
质谱条件：电离源为EI,电离能量70eV；传输线温度为290℃；离子源温度为250℃；电子倍增器电压1491V。质量扫描范围为50-650amu，扫描频率为5/sec。
GCMS总离子流图见图1。
保留时间为34.79min时的质谱图见图2。
与NIST数据库比对见图3。
步骤二的8得到的粗提物共分离出35个峰。色谱峰相应质谱图的鉴定通过NIST数据库质谱库正、反向检索法进行定性，在保留时间为34.79min的峰被鉴定为奥沙西泮。
奥沙西泮的结构式如下：

Claims (5)

1.烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC NO.3115在制备奥沙西泮中的应用。
2.一种制备奥沙西泮的方法，包括如下步骤：发酵培养烟曲霉(Aspergillusfumigatus)TEQA CGMCC NO.3115，得到奥沙西泮。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括从所述发酵培养得到的发酵体系中分离菌丝体的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括使用有机溶剂对所述菌丝体进行提取的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇和/或氯仿。
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