CN103393638A - 芒柄花黄素在制备抗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了芒柄花黄素在制药中的新用途,具体公开了芒柄花黄素在制备抗乳腺癌药物中的应用。申请人首次发现芒柄花黄素能显著抑制乳腺癌细胞增殖,并通过实验发现芒柄花黄素是通过失活IGF1/IGF1R-PI3K/AKT途径阻滞细胞周期,产生良好的抑制乳腺癌细胞增殖活性,可将其作为细胞周期阻滞剂代替他莫昔芬,抑制乳腺癌细胞增生从而预防和治疗乳腺癌;另外,申请人在实验中还发现芒柄花黄素具有对肿瘤细胞作为周期阻滞剂,同时对正常细胞作为激动剂的专一靶向性,具有很高的开发价值及现实应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种中草药单体的应用,具体涉及芒柄花黄素在制备抗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
乳腺癌为成年女性发病率较高的癌症之一,特别是在欧美发达国家,乳腺癌患者可以达到所有成年女性癌症患者的30%左右。我国过去属于乳腺癌发病率较低的国家之一,但是近二十年来,随着经济的快速增长,人们的饮食结构和生活方式都发生了极大的改变,乳腺癌的发病率在女性人群尤其是城市女性中呈爆发式增长。临床上常采取手术治疗,撤除***的内分泌治疗和选择性拮抗剂治疗,如他莫昔芬(Tamoxifen)、雷诺昔酚等,作为选择性***受体拮抗剂疗效显著,但其在杀伤肿瘤细胞的同时,对血管内皮细胞等人体正常细胞也有较大伤害,副作用较多,且价格昂贵。而大量的流行病学调查发现,在中国、日本和其他亚洲国家植物***摄入量高的人群,其乳腺癌、***癌、结肠癌和子宫癌等的发病率通常较低,一些病例对照实验也显示长期植物***摄入量较高的妇女,其乳腺癌发生率和危险性确实降低,因此开发植物***成为抗乳腺癌靶点药物成为热点。
植物***是一类天然存在于植物中的非甾体类化合物,结构及生物活性均类似于***。植物***为杂环多酚类化合物,依据分子结构的不同主要包括三大类:①异黄酮类(isoflavones),②木酚素(lignans),③香豆素类(coumestans)。芒柄花黄素又名刺芒柄花素,芒柄花素,是异黄酮类植物***中的一种,其结构式如下式所示:
已有的研究表明,芒柄花黄素具有调节体内血脂代谢,抑制肝脏脂肪沉积和预防动脑粥样硬化和***样作用,以及抑制新生血管形成并作为血管形成抑制剂使用等药理学活性。但目前还未见有芒柄花黄素具有抑制乳腺癌细胞增殖作用的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供芒柄花黄素在制药中的新用途,具体是提供其在制备抗乳腺癌药物中的应用。
本发明的技术方案为:芒柄花黄素在制备抗乳腺癌药物中的应用。
所述的抗乳腺癌药物的剂型可以是药物可接受的任意一种剂型,具体可以是片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、溶液剂或注射剂(包括混悬剂或乳剂等)。
所述抗乳腺癌药物的给药方式可以是注射、口服、腹膜内及静脉内给药、局部外用给药或肠胃外给药,或者是以缓释配方中的脂质体或毫微球包囊方式给药。当进行肠胃外给药时,需要对抗乳腺癌药物进行灭菌处理。
所述芒柄花黄素在体内、外抑制乳腺癌细胞增殖是通过阻滞细胞周期实现的。
与现有技术相比,本发明提供了芒柄花黄素在制药中的新用途,首次发现芒柄花黄素能显著抑制乳腺癌细胞增殖,并通过实验发现芒柄花黄素是通过失活IGF1/IGF1R-PI3K/AKT途径阻滞细胞周期,产生良好的抑制乳腺癌细胞增殖活性,可将其作为细胞周期阻滞剂代替他莫昔芬,抑制乳腺癌细胞增生从而预防和治疗乳腺癌;另外,申请人在实验中还发现芒柄花黄素具有对肿瘤细胞作为周期阻滞剂,同时对正常细胞作为激动剂的专一靶向性,具有很高的开发价值及现实应用意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中MTT比色法检测不同浓度芒柄花黄素(0、10、20、30、40、60、80、100μM)及阳性药他莫昔芬抑制MCF-7细胞增殖的示意图;
图2为本发明实施例2中流式细胞术检测不同浓度芒柄花黄素(0、20、40、80μM)及阳性药他莫昔芬对MCF-7细胞周期分布图;
图3为本发明实施例2中不同浓度芒柄花黄素(0、20、40、80μM)及阳性药他莫昔芬对MCF-7细胞周期影响的结果的百分比堆积柱状图;
图4为本发明实施例3中Western Blot检测不同浓度芒柄花黄素(0、20、40、80μM)及阳性药他莫昔芬对MCF-7细胞IGF1/IGF1R-PI3K/AKT-Cyclin D1蛋白信号通路的影响的表达图;
图5为本发明实施例3中不同浓度芒柄花黄素(0、20、40、80μM)及阳性药他莫昔芬对MCF-7细胞IGF1/IGF1R-PI3K/AKT-Cyclin D1蛋白信号通路的影响的簇状柱形图;
图6为本发明实施例4中颈椎脱臼法处死裸鼠后,空白对照组的裸鼠乳腺癌细胞瘤及高剂量药物处理组裸鼠乳腺癌细胞瘤的形貌图片,其中左侧图为空白对照组的裸鼠乳腺癌细胞瘤的形貌图片,右侧图为高剂量药物处理组(60mg/kg)裸鼠乳腺癌细胞瘤的形貌图片;
具体实施方式
以下通过实验及附图进一步描述本发明中芒柄花黄素的新用途。所有数据用mean±SEM表示,统计学比较采用单因素方差分析并用SNK’q-test进行组间比较。
以下各实施例中用到的实验药物、实验试剂及MCF-7细胞的培养方法分别如下:
1、实验药物:
芒柄花黄素购于天津马克生物技术有限公司(>98%),溶于DMSO中制成浓度为200mM的储备液,保存于4℃。Tamoxifen(>98%,购于Sigma公司)溶解于DMSO保存于4℃。DMSO作用于细胞时终浓度小于0.1%。
50只雌性裸鼠购于四川大学实验动物中心。
2、实验试剂:
RPMI-1640培养基,小牛血清(FBS),磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4),青霉素-链霉素(P/S)和0.25%(W/V)胰蛋白酶均购于Invitrogen公司(USA)。
MTT,PCR逆转录试剂盒分别购于Sigma公司(USA)和碧云天公司(Jiangsu,China)。
磷酸化p38抗体,p38抗体及辣根过氧化酶(HRP)标记的抗兔IgG二抗均从Cell Signaling Technology(Beverly,MA)购得。
人乳腺癌细胞系MCF-7来源于中国科学院上海生命科学研究所。
3、细胞培养方法:人乳腺癌细胞MCF-7在含10%小牛血清的RPMI-1640中采用开放式单层贴壁培养,培养条件为37℃,5%二氧化碳,饱和湿度,待细胞生长至80%密度时,胰酶消化传代。
实施例1:芒柄花黄素对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。
将MCF-7细胞消化后计数,按每孔4×103个细胞分别接种至96孔细胞培养板中,置于37℃、5%CO2孵箱中孵育培养。24h后更换为含终浓度依次为0、10、20、30、40、60、80、100μM芒柄花黄素的培养基,每个浓度均设3个平行复孔,继续培养48h后,倒置显微镜下观察细胞形态,加入MTT溶液(5mg/mL),37℃孵育4小时,避光振荡10min,用Bio-Rad酶联免疫检测仪于570nm波长检测各孔吸光度(OD)值。
MTT结果显示,芒柄花黄素能够剂量依赖的抑制MCF-7细胞的增殖。其中药物浓度为100μM时,抑制效果最为明显,与空白对照相比,100μM芒柄花黄素48h对MCF-7细胞的抑制率达76.12%(P<0.05),图1为MTT比色法检测不同浓度芒柄花黄素(0、10、20、30、40、60、80、100μM)抑制MCF-7细胞增殖的示意图。
实施例2:芒柄花黄素对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响
收集对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞,调整细胞浓度,以每孔1×106个细胞接种到6孔板中。待细胞贴壁后,加入不同浓度芒柄花黄素(20,40,80μM),继续培养48小时后,收集各组细胞,预冷的PBS洗涤2次后,70%的乙醇4℃固定过夜,碘化丙啶(PI)(50μg/ml)室温避光染色,15分钟后,用流式细胞仪检测细胞周期。结果如图2和图3所示。
由图2和图3可知,芒柄花黄素对人乳腺癌细胞MCF-7具有明显细胞周期阻滞作用。空白组细胞G0/G1期为42%,S期为33%,G2/M期为25%,而经过不同浓度芒柄花黄素(20,40,80μM)处理的48h的细胞,G0/G1期分别为48%,55%,70%;S期为29%,20%,15%;G2/M期为23%,25%,15%(p<0.05)。
实施例3:免疫印记杂交(Western Blot)检测芒柄花黄素对对人乳腺癌MCF-7细胞IGF1/IGF1R-PI3K/AKT-Cyclin D1通路变化情况
用含20,40,80μM芒柄花黄素培养液分别处理48h,同时0.1%DMSO为空白对照。PBS洗涤,用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液消化并裂解细胞,4℃离心20min,取上清液,测定蛋白浓度。加入5X上样缓冲液,95℃加热5min,制备成为待测样品。SDS-PAGE电泳分离上述蛋白样品后,转至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST溶液室温下封闭膜1h。将膜置于含有一抗的5%脱脂牛奶TBST中,4℃孵育过夜,一抗(IGF1R、p-IGF1R、AKT、p-AKT、Cyclin D1)稀释度均为1∶1000。用TBST洗膜3次,每次10min。膜放入含HRP标记二抗的5%脱脂牛奶中(稀释度1∶4000),室温中缓慢摇晃,孵育1h。用TBST洗膜3次,每次10min。ECL超敏发光试剂检测并拍照。结果如图4和5所示。
Western Blot结果显示,不同浓度的芒柄花黄素(20,40,80μM)能够减少MCF-7细胞中IGF1R、AKT磷酸化水平,并且减少Cyclin D1蛋白表达,其中80μM药物最为明显,但其对MCF-7细胞中总IGF1R、AKT蛋白表达量无影响。
实施例4:芒柄花黄素对异体移植人乳腺癌细胞瘤的裸鼠的抗乳腺癌活性检测
将人乳腺癌细胞MCF-7用PBS洗涤,用含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化1分钟左右。4℃,1000rpm离心5分钟后,细胞沉淀重悬于PBS中并且将浓度调节至1×107细胞/ml,得到肿瘤细胞悬液。在用于SPF级实验动物饲育的屏障环境动物实验室,将0.1ml肿瘤细胞悬液经皮下注射接种于裸鼠乳垫上。10天后,当肿瘤体积为0.2cm3左右,将裸鼠随机分为5组,每组10只,空白对照组、药物处理组(高、中、低剂量),阳性对照组(tamoxifen),药物组每天分别以15,30,60mg/kg芒柄花黄素的剂量腹腔注射测试体内抑瘤作用。每隔4天用游标刻度卡尺测量肿瘤大小,利用如下公式测算肿瘤体积:π/6×a2×b(a表示长轴,b表示短轴)。芒柄花黄素注射20天后,颈椎脱臼法处死所有裸鼠(图6为空白对照组的裸鼠乳腺癌细胞瘤及高剂量药物处理组裸鼠乳腺癌细胞瘤的形貌图片)。迅速取下肿瘤标本,称重。所有动物实验操作均遵守《实验动物管理条例》(中华人民共和国国家科学技术委员会令第2号,1988)。抑制率的计算公式为:抑制率=(1-实验组平均瘤重(体积)/对照组平均瘤重(体积))×100%,各组的抑制率结果如下述表1所示,各组的抑制率曲线如图7所示。
与对照组比较,*p<0.05
由图6、图7以及表1可知,与对照组相比,在实验过程中,给药组肿瘤生长(肿瘤体积和肿瘤重量)受到显著的抑制,但裸鼠表征指标之一的体重随给药时间的变化并不明显,初步提示在高剂量长期给药情况下,表现出毒性较低、安全性较高的特点。
结论:***是一种甾体类激素,它在女性生殖***的生长,成熟都扮演一个关键角色,并且它可以调节乳腺癌细胞的一系列生理过程,包括增殖,侵袭以及细胞结构的改变。***的许多作用是通过***受体-配位子的转录因子来实现的。***1(insulin-like growth factor1,IGF1)促进乳腺癌细胞增殖并抑制凋亡,在乳腺肿瘤发生中的作用越来越受关注。IGF1的生物功能由***1受体(insulin-like growth factor1receptor,IGF1R)介导。IGF1R在包括乳腺在内的很多组织中对细胞转化和肿瘤发生起重要作用。它能激活MAPK和P I3K/AKT信号通路。AKT即蛋白激酶B(PKB),对细胞增殖、凋亡和细胞周期起调控作用。而Cyclin D1是细胞周期的关键调控点,研究表明***通过快速非基因组作用刺激乳腺癌细胞中的IGF1R,进而活化PI3K/Akt通路,诱导Cyclin D1表达增高,促进细胞增殖。MTT实验表明芒柄花黄素能抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖,其中100μM效果最明显。另外芒柄花黄素能剂量依赖性诱导MCF-7细胞周期阻滞,其中100μM效果最明显。免疫印记杂交的结果显示芒柄花黄素能抑制IGF1/IGF1R-PI3K/AKT信号通路的蛋白磷酸化水平,并且减少Cyclin D1蛋白表达,本研究发现芒柄花黄素这一作用呈剂量依赖性,进而影响乳腺癌细胞的细胞周期。同时荷瘤裸鼠实验结果显示,芒柄花黄素在裸鼠上具有很强的抑制肿瘤生长作用,能够剂量依赖性抑制肿瘤体积增加,减少瘤重,这与体外实验结果一致。故体外、体内结果均说明芒柄花黄素有抑制乳腺癌细胞生长,阻滞细胞周期的作用。
Claims (5)
1.芒柄花黄素在制备抗乳腺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗乳腺癌药物的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、溶液剂或注射剂。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:取芒柄花黄素,加入或不加入药用辅料,按常规方法制备成各种药物制剂。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗乳腺癌药物的给药方式为注射、口服、腹膜内及静脉内给药、局部外用给药或肠胃外给药,或者是以缓释配方中的脂质体或毫微球包囊方式给药。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的应用,其特征在于:所述芒柄花黄素通过阻滞细胞周期来抑制乳腺癌增殖。
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---|---|
CN (1) | CN103393638A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104926774A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-09-23 | 南京大学 | 刺芒柄花素席夫碱类衍生物及其合成方法与应用 |
CN105311013A (zh) * | 2014-07-08 | 2016-02-10 | 南京中医药大学 | 芒柄花素在制药中的应用 |
CN106906184A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-06-30 | 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 | 一种促进肿瘤细胞生长的方法 |
CN110141565A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-08-20 | 丽水市中心医院 | 芒柄花黄素在制备治疗肺动脉高压药物中的应用及治疗肺动脉高压药物 |
CN114081879A (zh) * | 2021-09-28 | 2022-02-25 | 江西普正制药股份有限公司 | 红花逍遥制剂单体活性成分的新医药用途 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102002030A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-04-06 | 天津市佰斯康科技有限公司 | 刺芒柄花素的合成方法 |
CN102070593A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-05-25 | 陕西嘉禾植物化工有限责任公司 | 一种刺芒柄花素的合成方法 |
CN102241657A (zh) * | 2011-05-04 | 2011-11-16 | 陕西师范大学 | Stille交叉偶联反应合成异黄酮 |
-
2013
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102002030A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-04-06 | 天津市佰斯康科技有限公司 | 刺芒柄花素的合成方法 |
CN102070593A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-05-25 | 陕西嘉禾植物化工有限责任公司 | 一种刺芒柄花素的合成方法 |
CN102241657A (zh) * | 2011-05-04 | 2011-11-16 | 陕西师范大学 | Stille交叉偶联反应合成异黄酮 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
邓樱等: "黄芪注射液及其有效成分对乳腺癌细胞增殖和Akt磷酸化的影响", 《中西医结合学报》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105311013A (zh) * | 2014-07-08 | 2016-02-10 | 南京中医药大学 | 芒柄花素在制药中的应用 |
CN104926774A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-09-23 | 南京大学 | 刺芒柄花素席夫碱类衍生物及其合成方法与应用 |
CN104926774B (zh) * | 2015-07-10 | 2021-02-23 | 南京大学 | 刺芒柄花素席夫碱类衍生物及其合成方法与应用 |
CN106906184A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-06-30 | 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 | 一种促进肿瘤细胞生长的方法 |
CN110141565A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-08-20 | 丽水市中心医院 | 芒柄花黄素在制备治疗肺动脉高压药物中的应用及治疗肺动脉高压药物 |
CN114081879A (zh) * | 2021-09-28 | 2022-02-25 | 江西普正制药股份有限公司 | 红花逍遥制剂单体活性成分的新医药用途 |
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