CN105007936B - 无细胞百日咳疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无细胞百日咳(aP)疫苗组合物，包含百日咳博德特氏菌抗原百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、以及2型和3型菌毛(FIM)、和任选地百日咳杆菌粘附素(PRN)，其中FIM是以每一人类剂量12‑100μg的一个量存在。

Description

无细胞百日咳疫苗
本发明涉及健康护理领域。更确切地说，本发明涉及无细胞百日咳疫苗领域。
发明背景
百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)是百日咳的病原体。在1940年代引入已杀死的全细胞百日咳博德特氏菌(wP)疫苗已成功降低了儿童和婴儿因百日咳所导致的发病率和死亡率[http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/pert.pdf；比斯加德(Bisgard)，K.M.http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pertussisguide/downloads/chapter1.pdf.2000；爱德华(Edwards)，K.M.和德克尔(Decker)，M.D.百日咳疫苗(Pertussis vaccines)，见《疫苗》(Vaccines)(编辑普洛特金(Plotkin)，S.A.，奥伦斯坦(Orenstein)，W.A.以及奥菲特(Offit)，P.A.)爱思唯尔健康科学出版社(Elsevier HealthSciences)，2008.467-517；这一读本在下文被称为“《疫苗》，普洛特金2008”]。尽管如此，在世界范围内，百日咳仍为儿童中的一个重要问题。来自WHO的评估表明，在2008年发生了约1,600万例百日咳，并且约195,000名儿童死于这一疾病。
自1990年代以来，wP疫苗已在大部分高收入国家并且近年来也在一些中等收入国家被无细胞百日咳(aP)疫苗替换。无细胞百日咳疫苗与wP疫苗相比诱发相对更少的副作用，这些wP疫苗与发烧(≥38℃)、在注射部位的反应原性以及(尽管程度较小)惊厥和低渗性低应答间期(hypotonic-hyporesponsive episode)的高风险相关[张(Zhang)，科克伦***综述数据库(Cochrane Database Syst Rev)2011]。
在引入aP疫苗后十到二十年，青少年和成人百日咳通报升高已被若干国家报导，包括US、UK、澳大利亚、挪威以及荷兰。可能的解释包括已改善的诊断和监测、循环百日咳博德特氏菌菌株适应成疫苗、和/或与aP疫苗相关的免疫性减弱的增加[田中(Tanaka)，《美国医学会杂志》(Jama)2003,290:2968-2975；佐藤(Satoh)，《比较免疫学、微生物学与传染病》(Comp Immunol Microbiol Infect Dis)2010,33:e81-88；策普(Zepp)，《柳叶刀传染病》(Lancet Infect Dis)2011；德格里夫(De Greeff)，《第一公共科学图书馆》(PLoS One)2010,:e14183；谈(Tan)，《儿科传染病杂志》(Pediatr Infect Dis J)2005,24(5增刊):S10-18]。
目前，所有被许可的aP疫苗由最少一种、但多数情况是多种、直到最多五种(已被脱毒的)百日咳博德特氏菌毒力因子组成。所有aP疫苗含有百日咳类毒素(PT)。多组分aP疫苗至少包括PT和百日咳博德特氏菌表面粘附素丝状血凝素(FHA)。在价数增加的情况下，另外存在粘附素百日咳杆菌粘附素(PRN)和2型和3型菌毛(FIM2和FIM3，在此合起来称为FIM或FIM2/3)中的一种或多种[爱德华，见《疫苗》，普洛特金，2008.467-517]。
WO 96/34883描述了每一人类剂量1-10μg FIM的剂量，以aP疫苗中每一人类剂量10和5μg的剂量为例，而实际上仅测试每一人类剂量5μg的剂量，并且测试疫苗被认为有效。
普遍认为aP5疫苗(具有五种组分PT、FHA、PRN、FIM2/3的无细胞百日咳疫苗；DTaP5为进一步包含破伤风类毒素和白喉类毒素的aP5疫苗)为当前可获得的最有效的aP疫苗。可购得的已注册aP5疫苗中存在的aP组分的单独量(以每一人类剂量的微克数为单位)：2.5-20PT、5-20FHA、3PRN以及5FIM。
在1990年代中期欧洲进行的若干无细胞百日咳疫苗功效试验中，尝试测定单独aP疫苗组分的保护的免疫相关性。使用来自瑞典DTaP5(PT+FHA+PRN+FIM2/3)试验的数据，证明了临床保护与暴露前血清中的针对PRN、FIM2以及PT(而不是针对FHA)的IgG抗体的存在之间的统计学上显著的相关性[斯托萨特(Storsaeter)，《疫苗》1998,16:1907-1916]。FIM3似乎为DTaP5内的非保护组分[波曼(Poolman)，《疫苗专家评论》(Expert ReviewsVaccines)2007,6:47-56]。
在德国从来自疫苗试验的受试者所采集的血清允许评估与保护相关的针对PT、FHA、PRN以及FIM2的抗体的具体水平，它显示仅针对PRN和PT的抗体与保护显著相关[斯蒂尔(Stehr)，1998，《儿科学》(Pediatrics)101:1-11；彻丽(Cherry)，1998，《疫苗》16:1901-1906]。此外，临床前研究已显示，添加PRN增强了在鼠类鼻内感染模型中由含有PT和FHA的疫苗所赋予的保护水平[吉索(Guiso)，1999，《疫苗》17:2366-2376；德诺埃(DeNoel)，2005，《疫苗》23:5333-5341]并且针对PRN的抗体是调理吞噬百日咳博德特氏菌的关键[赫尔维希(Hellwig)，2003，《传染病杂志》(JID)188:738-742]。这些数据合起来表明PT和PRN为当前无细胞百日咳疫苗的主要保护性抗原。
作为前瞻性aP疫苗功效试验的一部分，历经18个月的时间，测量了从参与者获得的连续血清样品中的针对PT、FHA、PRN以及FIM2/3的保护性IgG。历经18个月，针对PT的IgG衰减的百分比最强(几何平均IgG效价减少73％)并且显著高于针对PRN、FHA以及FIM的抗体减少的百分比。相比之下，针对PRN的IgG抗体具有最低衰减率(几何平均IgG效价减少56％)[莱(Le)，2004，《传染病杂志》，190:535-544]。
组合1)PT和PRN为aP疫苗中的主要保护性抗原和2)针对PT的抗体具有比针对PRN的抗体显著更高的衰减率这两个观察结果，突出了抗PRN抗体为提供aP介导的针对百日咳博德特氏菌感染的长期保护的关键。
然而，在过去的几年中，已在全世界观察到不表达PRN的百日咳博德特氏菌菌株的出现，例如在法国、日本、荷兰、USA、芬兰、挪威以及瑞典[布歇(Bouchez)，2009，《疫苗》27:6034-41；黑格勒(Hegerle)，2012，《临床微生物学和感染》(Clin.Microbiol.Infect.)18:E340-346；大冢(Otsuka)，2012，《第一公共科学图书馆》7:e31985；阿德瓦尼(Advani)，2013，《临床微生物学杂志》(J.Clin.Micro)51:422-428]。美国最近一项研究显示，在2011年和2012年间由来自在费城就医的儿童的样本所培养的百日咳博德特氏菌的12种分离株中的11种事实上为PRN阴性[昆南(Queenan)，2013，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)368:583-4]。目前不了解此菌株适应是否主要为疫苗推动的。有可能这些PRN阴性菌株可以避开疫苗诱发的免疫性，尤其在抗PT效价已衰退时，并且这已造成所观察到的百日咳博德特氏菌疾病增加。
目前已被许可并销售的aP疫苗因此似乎不够有效，尤其针对新近出现的PRN阴性菌株。仍需要其他aP疫苗，这些aP疫苗具有特别是针对这些PRN阴性百日咳博德特氏菌菌株的改善的功效。
发明概述
我们已意外发现包含高剂量FIM2/3的aP疫苗显示显著改善的抵抗PRN阴性百日咳博德特氏菌菌株的保护。本发明提供一种无细胞百日咳(aP)疫苗组合物，该疫苗组合物包含百日咳博德特氏菌抗原百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)以及2型和3型菌毛(FIM)、和任选地百日咳杆菌粘附素(PRN)，其中FIM是以每一人类剂量12-100μg的一个量存在。
在某些实施例中，FIM是以每一人类剂量15-80、15-60、20-60、或12-50、15-50、20-50、20-30、20-25、或12-30、或12-25、或约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25μg的一个量存在。
在优选实施例中，本发明的aP疫苗包含百日咳杆菌粘附素(PRN)。
在某些实施例中，PT被基因地脱毒。
在某些实施例中，本发明的组合物进一步包含来自除百日咳博德特氏菌以外的一种或多种病原体的抗原。
在其某些实施例中，这些组合物包含以下一者或多者：
a)破伤风类毒素；b)白喉类毒素；c)b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)寡糖或多糖结合物；d)B型肝炎病毒表面抗原(HBSAg)；以及e)失活的脊髓灰质炎病毒(IPV)。在某些实施例中，本发明的组合物包含据本发明的无细胞百日咳疫苗组合物、破伤风类毒素以及白喉类毒素。
在某些实施例中，根据本发明的组合物进一步包含一种佐剂。在某些实施例中，该佐剂包含铝盐，如磷酸铝、氢氧化铝、或磷酸铝和氢氧化铝两者。
本发明还提供了一种在受试者中诱发抵抗百日咳博德特氏菌的免疫反应或对该受试者进行疫苗接种以抵抗百日咳博德特氏菌的方法，该方法包括给予该受试者根据本发明的组合物。
本发明还提供了一种保护受试者免受由百日咳博德特氏菌的一种PRN阴性菌株感染所引起的百日咳的方法，该方法包括给予该受试者根据本发明的组合物。
本发明还提供了根据本发明的组合物，用于通过给予受试者该组合物在受试者中诱发抵抗百日咳博德特氏菌的免疫反应或对该受试者进行疫苗接种以抵抗百日咳博德特氏菌。本发明还提供了根据本发明的组合物，用于制备通过给予受试者该组合物在受试者中诱发抵抗百日咳博德特氏菌的免疫反应或对该受试者进行疫苗接种以抵抗百日咳博德特氏菌的药剂。在某些实施例中，需要免疫反应来抵抗的百日咳博德特氏菌包括PRN阴性菌株。
本发明还提供了一种对人类受试者进行疫苗接种以抵抗百日咳博德特氏菌、任选地百日咳博德特氏菌的一种PRN阴性菌株的方法，该方法包括给予该受试者以下百日咳博德特氏菌抗原：百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)以及2型和3型菌毛(FIM)、和任选地百日咳杆菌粘附素(PRN)，其中FIM是以12-100μg的一个量给予。
附图简要说明
图1.接种DTaP5疫苗(aP5)或aP5+FIM的小鼠在鼻内激发后第0天、第2天、第5天以及第8天每一个肺的百日咳博德特氏菌的平均log10CFU。小鼠在4周和7周龄时进行疫苗接种并且在9周时用不同的百日咳博德特氏菌菌株经鼻内激发：WHO 18323(图1A)、一种临床PRN阴性分离株PRN-STOP(图1B)以及一种临床PRN阴性分离株PRN-IS(图1C)。
*p<0.05使用威尔科克森精确检验(Wilcoxon Exact Test)，比较在接种aP5和aP5+FIM后在每一特定时间点的平均log10CFU计数。
#p<0.01使用协方差分析，比较接种aP5和aP5+FIM后从第0天到第8天的log10CFU反应-时间概况。
图2.在4周和7周龄时接种1/10人类剂量的aP2疫苗外加渐增量的FIM后，在第9周用PRN阴性百日咳博德特氏菌菌株I195激发的小鼠的肺的平均Log10CFU计数。关于详情，参见实例2。
图3.在4周和7周龄时接种添加或未添加5μg FIM的1/10人类剂量的aP5疫苗后，在第9周用4种百日咳博德特氏菌菌株激发后5天的小鼠的肺的平均Log10CFU计数。关于详情，参见实例3。
发明的详细说明
本发明涉及组合物，这些组合物包含已脱毒的百日咳博德特氏菌毒力因子，特别是百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)以及2型和3型菌毛(FIM)、和任选地百日咳杆菌粘附素(PRN)，其中FIM是以每一人类剂量12-100μg的一个量存在。这些组合物可被用作无细胞百日咳(aP)疫苗，并且在此被证明意外地比当前可获得的业界最好aP5疫苗更有效。
具体来说，增加剂量的FIM与这一组分先前描述和推荐的剂量相比，产生与已销售的aP5疫苗和其他已销售的aP疫苗相比改善的针对新近出现的百日咳博德特氏菌PRN阴性菌株的疫苗效力。这是非常令人惊讶的，因为现有技术并未提供增加每一人类剂量的FIM的量超过推荐量5μg的任何建议，并且该技术实际上提供了增加这一组分的量并不产生改善功效的建议。
已例如在人类和动物模型中研究增加疫苗中FIM的剂量的作用。在17-19个月大的婴儿中，显示出在具有10μg PT、5μg FHA、3μg PRN以及5μg FIM2/3或包括两倍量的所有这些抗原的两种5组分aP疫苗之间不存在不良反应频率、抗体效价或免疫后平均倍数效价升高的差异(哈尔珀林(Halperin)，《儿童和青少年医学文献》(Arch Pedi Adol Med)1994,148:1220-1224)。
在动物模型中，发现当小鼠接种三个种类的含有不同量FIM的百日咳疫苗时，体重、脾脏重量、外周白细胞计数以及肺的百日咳博德特氏菌的清除率不存在差异(诸熊(Morokuma)，《生物学标准化的发展》(Devel Biol Stand)1991,73:223-232)。
另一研究显示，接受高剂量(20μg)或低剂量(4μg)的重组FIM2或FIM3的小鼠之间的IgG抗体水平不存在差异。鼻内激发七天后，对照小鼠、接种FIM2的小鼠或接种FIM3的小鼠的肺的细菌接种量不存在差异(徐(Xu)，《BMC微生物学》(BMC Microbiology)2009,9:274-281)。
我们关于在小鼠鼻咽激发模型中使用高剂量FIM接种的功效增加的发现因此非常令人惊讶。
因此，现有技术中不存在增加aP疫苗中FIM的量超过常用量会产生针对新近出现的PRN阴性突变体菌株的改善功效的指示或建议。
如在此使用的“人类剂量”(有时称为“单次人类剂量”)意思指在单次给药中给予人类的疫苗的量。典型地，这一量是以0.1-2ml，例如0.2-1ml，典型地0.5ml的体积存在。指定量可因此例如以每0.5ml原液疫苗的微克数的浓度存在。在某些实施例中，(单次)人类剂量因此等于0.5ml。
正在销售或已销售的若干aP疫苗的组分描述于“《疫苗》第5版.S.普洛特金，W.奥伦斯坦，P.奥菲特，2008，第2部分，第21章“百日咳疫苗”，K.M.爱德华和M.D.德克尔.第467-517页的表21-3和21-4中，该文献是通过引用结合在此。本发明的aP疫苗组合物包含PT、FHA以及FIM2/3，且优选是PRN。这些组分是多种已销售aP疫苗的标准组分，并且可购自不同制造商(参见例如《疫苗》，普洛特金2008的第21章的表21-3)，并且例如可购自李斯特生物实验室公司(List Biological Laboratories,Inc)(加利福尼亚州坎贝尔(Campbell,California))。本发明的组合物包含已脱毒的百日咳毒素，也称为百日咳类毒素(PT)。PT可被化学地或基因地脱毒。化学地脱毒可例如通过多种常规化学脱毒方法中的任一种来进行，如用甲醛、过氧化氢、四硝基甲烷或戊二醛处理。举例来说，脱毒可如WO 96/34883第17页和实例3所述来进行，该文献是通过引用结合在此。在某些优选实施例中，PT被基因地脱毒。这可通过在百日咳毒素基因中进行突变以使百日咳毒素的催化亚单位S1的酶促活性失活来完成，并且已例如被描述于US 7,144,576、US 7,666,436以及US7,427,404中。使百日咳毒素脱毒的特别有利的突变被例如提供于US 7,427,404中，该文献是通过引用结合在此。一个特别有利的实施例是一种百日咳毒素，其中S1亚单位中百日咳全毒素氨基酸序列中的氨基酸残基Glu129被Gly取代(E129G)并且Arg9被Lys取代(R9K)(美国专利7,427,404；布斯里(Buasri)，《BMC微生物学》2012,12:61)。这些被基因地脱毒的PT(E129G、R9K)还可便利地从被基因工程改造的显示这一PT生产增强的菌株中分离出[布斯里，2012，同上]。使用被基因地脱毒的突变体的优势为不使用或较少使用脱毒所需的危险化学品、改善PT抗原的抗原决定基的保存并且因此与其的免疫反应更好、和/或可用于疫苗的抗原的量降低。在其他实施例中，PT被化学地脱毒。被化学地或基因地脱毒的PT被广泛用于aP疫苗中(参见例如《疫苗》，普洛特金2008的第21章的表21-3)。PT可例如如WO 96/34883的第16页和实例2中所述来获得并且纯化，该文献是通过引用结合在此。PT还可使用如例如US 5085862、WO 96/34623、US 4705868、EP 0336736、WO 9115505、EP 0306318、EP0322533、EP 0396964、EP0275689、WO 91/12020、EP 0427462、WO 9819702以及US 4784589中所述的方法来获得，这些文献各自是通过引用结合在此。
被化学地或基因地脱毒的PT可购自多种商业来源。在某些实施例中，根据本发明的疫苗中PT的量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)2-50μg、5-40μg、10-30μg或20-25μg。
根据本发明的组合物在某些实施例中包含百日咳杆菌粘附素(PRN)，百日咳博德特氏菌的一种69kD外膜蛋白(因此有时也称为69K抗原)。PRN可例如如WO 96/34883的第18-19页和实例2中所述来获得并且纯化，该文献是通过引用结合在此。它还可例如如EP0162639、EP 0484621、US 6444211、US 5276142、US 5101014、EP 0336736、WO 96/34623、WO90/16651以及WO 90/56076中所述来获得，这些文献都是通过引用结合在此。PRN也可便利地从已被基因工程改造以表达高水平的PRN的百日咳博德特氏菌菌株中分离出，如例如[布斯里，2012，同上]中所述。
在某些实施例中，根据本发明的疫苗中PRN的量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)0.5-100μg、1-50μg、2-20μg、3-30μg、5-20μg或6-10μg[参见例如EP 0928198]。
根据本发明的组合物包含丝状血凝素(FHA)；百日咳博德特氏菌的一种重要的230-kDa粘附素，该粘附素对于百日咳博德特氏菌粘附于呼吸道宿主睫状上皮细胞来说是重要的；以及已销售的多价aP疫苗中的一种确定组分。FHA可例如如WO 96/34883的第17-18页和实例2中所述来获得并且纯化，该文献是通过引用结合在此。FHA还可例如如WO9013313、EP 0484621、WO 9634623、EP 0336736、WO 9115505、US 4784589以及WO 9004641中所述来获得，这些文献都是通过引用结合在此。
在某些实施例中，根据本发明的疫苗中FHA的量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)2-50μg、5-40μg、10-30μg或20-25μg。
根据本发明的组合物包含菌毛凝集原2和3，也称为菌毛2和3或凝集原2和3或Agg2和3(在此称为FIM2和FIM3，或“FIM”或“FIM2/3”，它是呈混合物形式的FIM2和FIM3的一种组合)。典型地，在根据本发明的组合物中，FIM2与FIM3的重量比是从约1:3到约3:1，例如从约1:1到约3:1，例如从约1.5:1到约2:1。FIM的制备被详细描述于WO 96/34883的第12-13页和实例2中，该文献是通过引用结合在此。FIM还可例如如WO 9634623、US 4784589、US6475754、EP 0555894、WO 9858668以及WO 0207764中所述来获得，这些文献都是通过引用结合在此。
根据本发明的疫苗中FIM的量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)12-100μg。在某些实施例中，这一量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)12-50μg或12-30μg。在本发明的优选实施例中，FIM的量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)至少15μg。在某些实施例中，这一量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)15-100μg、15-80μg、15-60μg、15-50μg、15-30μg或15-25μg。在本发明的其他优选实施例中，FIM的量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)至少20μg。在某些实施例中，这一量为每一人类剂量(典型地为0.5ml)20-100μg、20-80μg、20-60μg、20-50μg、20-30μg、20-25μg或25-50μg。
FIM可从百日咳博德特氏菌中分离出，或可重组产生，或例如可购自李斯特生物实验室公司(加利福尼亚州坎贝尔；http://www.listlabs.com，在线目录中的产品号186)。
在某些优选实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含每一人类剂量(或每0.5ml原液疫苗)：10-25μg PT、10-25μg FHA、3-8μg PRN以及12-50μg FIM。在某些优选实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含每一人类剂量(或每0.5ml原液疫苗)：20-25μg PT、20-25μgFHA、3-8μg PRN以及12-50μg FIM。在某些优选实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含每一人类剂量(或每0.5ml原液疫苗)：20-25μg PT、20-25μg FHA、3-8μg PRN以及12-25μgFIM。在某一实施例中，本发明提供一种疫苗，该疫苗包含每一人类剂量(或每0.5ml原液疫苗)：约20μg PT、约20μg FHA、约3μg PRN以及约15-20μg FIM。
制备根据本发明的疫苗的一种简单方式是向一种可购得的aP5疫苗中添加可购得的FIM。本发明的疫苗还可简单地通过向一种可购得的包含PT和FHA但还没有FIM的aP疫苗(aP2)或一种可购得的包含PT、FHA以及PRN但还没有FIM的aP疫苗(aP3)中添加FIM来制备。在某些实施例中，FIM可首先被吸附于佐剂(如果需要这样的话)，例如氢氧化铝和/或磷酸铝，随后添加到其他组分。在其他实施例中，FIM在没有预先吸附到佐剂的情况下被添加到其他组分。
如本披露中所用的关于数值的术语‘约‘意思指值±10％。
在某些实施例中，本发明的组合物还可包含非百日咳蛋白质组分，例如以便获得组合疫苗[德克尔，M.D.，爱德华，K.M.以及博格茨(Bogaerts)，H.H.组合疫苗(Combinationvaccines)，见《疫苗》(编辑普洛特金，S.，奥伦斯坦，W.A.以及奥菲特，P.A.)爱思唯尔健康科学出版社，2008.1069-1101]。在某些实施例中，根据本发明的组合物可因此进一步包含来源于除百日咳博德特氏菌以外的一种或多种病原体的抗原。在某些实施例中，根据本发明的组合物包含以下一者或多者：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、b型流感嗜血杆菌寡糖或多糖结合物(Hib)、B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、失活的脊髓灰质炎病毒(IPV)。
aP与这些非百日咳组分的组合疫苗是已知并且被广泛使用的。组合疫苗的制备已例如被描述在WO 2010/046935、US 6013264、WO 2007/054820、WO 98/000167以及EP1946769中，这些文献都是通过引用结合。
在某些实施例中，根据本发明的aP5(或aP4：PT、FHA、FIM2/3)在进一步包含DT和TT的一种组合物中，从而提供根据本发明的DTaP5(或DTaP4)疫苗。DTaP5疫苗被广泛用于预防白喉、破伤风以及百日咳。根据本发明的疫苗具有比之前描述的DTaP5疫苗更高量的FIM，并且比常规DTaP5疫苗更有效地针对PRN阴性百日咳博德特氏菌菌株。
用于使DT分离、纯化以及脱毒的一种方式被描述在WO 96/34883的第33-34页，该文献是通过引用结合在此。DT还可例如如US 4709017、US 5843711、US 5601827、US5917017以及WO 96/34623中所述来获得，这些文献都是通过引用结合。
用于使TT分离、纯化以及脱毒的一种方式被描述在WO 96/34883的第34-36页，该文献是通过引用结合在此。TT还可例如如EP 0209281、EP 0478602以及WO 96/34623中所述来获得，这些文献都是通过引用结合。
Hib寡糖或多糖结合物可例如如WO 2007/054820、WO 2004/110480、US 6333036、WO 2010/046935、US 4372945、US 4474757、WO 95/08348、WO 2010/046935、US 4673574、EP0161188、EP 0208375以及EP 0477508中所述来获得，这些文献都是通过引用结合。Hib抗原可例如是Hib的荚膜多糖，或该多糖或其衍生寡糖与载体蛋白的结合物，该载体蛋白如DT、TT或CRM197(从白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)C7分离出的白喉毒素的一种无毒变异体(b197))。
HBsAg可例如如EP 0226846、EP 0299108、US 6013264、WO 2007/054820、WO 2010/046935以及WO 9324148中所述来获得，这些文献都是通过引用结合。
IPV可以是单价，含有一种类型的脊髓灰质炎病毒(1型、2型或3型)，或二价(含有两种类型的脊髓灰质炎病毒，例如1型和2型、1型和3型或2型和3型)，或三价(含有三种类型的脊髓灰质炎病毒，即1型、2型以及3型)。优选地，根据本发明的IPV含有失活的1型、2型以及3型脊髓灰质炎病毒。IPV可例如如US 4525349和WO 2011/006823中所述来获得，这些文献是通过引用结合在此。
这些非百日咳组分可从多个制造商获得。实例被描述在[《疫苗》第5版.S.普洛特金，W.奥伦斯坦，P.奥菲特，2008，第2部分，第38章(《组合疫苗》，M.D.德克尔，K.M.爱德华，H.H.博格茨，第1069-1101页)]中。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含一种组合物，该组合物包含根据上述实施例中的任何一个的百日咳组分(aP5或aP4疫苗)(即包含每一人类剂量12-100μg FIM，和PT、FHA以及任选地PRN；下文中称为“根据本发明的aP”、或简称为“aP5*”)和DT。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，和TT。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，和IPV(在此称为“aP5*-IPV”)。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，DT以及TT(在此称为“DTaP5*”)。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，DT、TT以及Hib(在此称为“DTaP5*-Hib)。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，DT、TT以及IPV(在此称为“DTaP5*-IPV”)。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，DT、TT以及HBSAg(在此称为“DTaP5*-HepB”)。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，DT、TT、Hib以及HBSAg(在此称为“DTaP5*-Hib-HepB”)。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，DT、TT、Hib以及IPV(在此称为“DTaP5*-Hib-IPV”)。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，DT、TT、HBSAg以及IPV(在此称为“DTaP5*-HepB-IPV”)。
在某些实施例中，根据本发明的组合物包含根据本发明的aP，DT、TT、Hib、HBSAg以及IPV(在此称为“DTaP5*-Hib-HepB-IPV”)。
可任选地添加其他非百日咳组分，例如有时在组合疫苗中与aP组合的组分，如来自脑膜炎球菌和/或肺炎双球菌的抗原。
关于组合疫苗，非百日咳组分的量可变化。一般来讲，可根据本发明使用如典型地存在于个别或组合疫苗中的这些组分的量。参见例如《疫苗》第5版.S.普洛特金，W.奥伦斯坦，P.奥菲特，2008，第2部分，关于各种组分和组合疫苗；具体地说，第38章描述了包含aP疫苗与上文提及的组分的组合疫苗[德克尔，第1069-1101页]；第10章描述了DT[维特克(Vitek)，第139-156页]；第31章描述了TT[瓦***(Wassilak)，第805-840页]；第25章描述了IPV疫苗[普洛特金，第605-630页]；第11章描述了Hib疫苗[钱德兰(Chandran)，第157-176页]；以及第13章描述了B型肝炎疫苗(基于HBsAg)[马斯特(Mast)，第205-242页]，这些都是通过引用结合。每一剂量的抗原的合适量(它也常以IU或Lf(絮凝单位)形式来表示DT和TT的量，参见例如[德克尔，见《疫苗》，第1069-1101页，同上]，但此处我们提供微克数)的非限制性实例将例如为：1-100μg、例如2-40μg、例如6-25μg、例如15-25μg DT；1-50μg、例如2-20μg、例如5-10μg TT；每毫升1-100μg、例如3到40μg HBsAg蛋白质；0.1-100μg、例如0.2到50μg、例如1到25μg、例如2-10μg呈与载体蛋白的结合物形式的Hib荚膜多糖或其寡糖；含有野生型衍生的IPV的产物(wt-IPV)一般被配制成每一剂量对应地含有40-8-32D-Ag单位的1型、2型以及3型脊髓灰质炎病毒。然而，这些量也可变化，对于1型IPV而言例如也可使用更低的量，如10-20D-Ag单位，并且也可改变2型和3型IPV的量(参见例如EP2066344)。量也可根据预定用途而改变，例如加强疫苗可在某些实施例中含有比初免疫苗更少单位的某些组分。
根据本发明的组合物中的蛋白质组分打算在给予合格受试者后诱发免疫反应。技术人员应清楚，本文中无论哪里提到蛋白质或其突变体(例如类毒素)，也可使用这些蛋白质的一部分并且这些蛋白质的一部分可具有等效的或在一些情况下优选的用于诱发免疫反应的性质。另外，这些蛋白质可含有(另外)突变，如缺失、***、取代等。因此，指定蛋白质组分的免疫原性片段和变异体被包括于在此指定的蛋白质的含义内。
根据本发明的组合物可用作无细胞百日咳疫苗，或用作组合疫苗的组分，这些组合物在给予合格的受试者后引起针对这些组合物中的一个或多个组分的免疫反应。免疫反应可包括细胞反应和/或体液反应。这些免疫反应优选地赋予抵抗病原体感染或抵抗疾病的保护，或至少降低由衍生出相应组分的病原体所引起的症状的严重程度(即在任何情况下优选地抵抗百日咳博德特氏菌，并且也优选地抵抗其PRN阴性突变体)。根据本发明的组合物可因此合适地称为疫苗。疫苗的剂量是在单次给药中给予受试者的量。受试者可合适地为动物或人类，并且在某些优选实施例中，该受试者为人类。许多疫苗合适地并且实际上优选地在足够的时间间隔下给予同一个体一次以上以便在该个体中获得加强作用，例如给药之间相隔至少四周、到若干年以至约二十年。多次免疫通常给予未处理的婴儿(naiveinfant)。根据本发明的组合物也可被给予一次以上，例如在一个非限制性实施例中，两次或三次或更多次，而每次给药之间相隔至少4周，例如相隔一个月或两个月的时间。一个非限制性实例是根据EPI时间表在6周、10周以及14周龄时给药。另一疗程将在2个月、4个月、6个月龄时。在某些实施例中，加强疫苗接种是在10-20年后，例如在***的时候给予。可给予其他十年一次的加强疫苗接种。在某些实施例中，根据本发明的aP在生命第一年被给予两次或三次，另一加强在生命第二年被给予，并且另一加强在四到五岁时被给予，之后在约十二岁时给予***加强。接下来也可以是Td(被给予青少年的含有TT-DT的疫苗)加强剂建议，即每十年一次并且用Tdap替换Td，其中该无细胞百日咳组分是根据本发明的aP。然而，技术人员应清楚，根据本发明的aP疫苗的疫苗接种方案可被适当地改变，这从不同国家管理机构的已销售aP疫苗的广泛多样的免疫时间表(疗程)中清楚地看出(例如《疫苗》第5版.S.普洛特金，W.奥伦斯坦，P.奥菲特，2008，第2部分，第21章“百日咳疫苗”，K.M.爱德华和M.D.德克尔第467-517页的表21-5)。
根据本发明的组合物还可合适地用作先前已接种其他疫苗的群体的加强疫苗，这些其他疫苗是那些具有与本发明的疫苗不同组成的wP或aP疫苗或具有与本发明的疫苗不同组成的包含wP或aP的组合疫苗。这些加强剂可例如被用于已未接种抵抗百日咳博德特氏菌的疫苗超过十年的成人或老年人的疫苗接种。重复这些加强剂疫苗接种(例如约每五年、十年或十五年一次)可为有用的。也已建议在每次怀孕时给予孕妇破伤风类毒素、减少的白喉类毒素以及无细胞百日咳疫苗(Tdap)而不考虑先前Tdap史。在某些实施例中，根据本发明的aP被给予婴儿、儿童、青少年、成人、老年人或孕妇，例如以aP形式或以Tdap形式。
根据本发明的组合物为药物组合物。这些组合物包含根据本发明的组合物和典型地药学上可接受的载体或赋形剂。在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”意思指载体或赋形剂在所用剂量和浓度下不会在给予它们的受试者中造成不希望有的或有害的影响。这些药学上可接受的载体和赋形剂在本领域中众所周知[雷明顿(Remington).《药学科学和实践》(The Science and Practise of Pharmacy)，麦克出版公司(Mack PublishingCompany)1990；福罗加尔(Frokjaer)，S.和霍夫高(Hovgaard)，L.《肽和蛋白质的药物制剂开发》(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins)，2000；《药用赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，英国医药出版社(Pharmaceutical Press)2000]。这些组合物优选地以无菌溶液形式配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中本身已知的其他方法来制备。这些溶液可接着被冻干或填充到药物剂量容器中。溶液的pH值一般在pH 3.0到9.5的范围内，例如pH 5.0到7.5。组合物的组分典型地在具有合适的药学上可接受的缓冲剂的溶液中，并且该溶液还可含有盐。在某些实施例中，清洁剂是存在的。在某些实施例中，疫苗可被配制成可注射制剂。这些配制品含有有效量的蛋白质组分，为无菌液体溶液、液体悬浮液或冻干版本，并且任选地含有稳定剂或赋形剂。用于aP疫苗或组合疫苗的储存和药物给予的合适配制品的若干实例是已知的(例如[《疫苗》第5版.S.普洛特金，等人，同上]中的表21-3和21-4)。合适稀释剂的实例为PBS或生理盐水。防腐剂可任选地存在，例如苯氧乙醇、硫柳汞或对羟基苯甲酸酯。如果存在一种防腐剂，那么它优选地以低水平存在。假如一种组合疫苗包含IPV，优选地避免使用硫柳汞，因为硫柳汞会导致IPV组分的效能损失(参见例如索耶(Sawyer)LA，1994，《疫苗》12:851-856；EP 2066344)。可任选地以痕量成分形式存在的其他组分为聚山梨醇酯-80、明胶以及化学毒化的残余物(例如，如果PT被化学地毒化)，如戊二醛、甲醛。
优选地，根据本发明的疫苗被储存在2℃-8℃之间。
在某些实施例中，本发明的组合物包含其他一种或多种佐剂。佐剂是本领域中已知进一步增加对一种已施加的抗原决定簇的免疫反应(关于对佐剂的综述，参见例如蒙特莫利(Montomoli)，2011，《疫苗专家评论》10:1053-1061)。合适佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物(或水包油型组合物)，包括角鯊烯-水乳液，如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂素配制品，如例如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US5,057,540、WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；Toll样受体(TLR)促效剂，例如TLR7激动剂(参见例如WO 2012/117377，例如第15-18页)，例如与铝盐(例如可吸附TLR激动剂的氢氧化铝)组合；细菌或微生物衍生物，它们的实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-去酰MPL(3dMPL)、含有CpG基序的寡核苷酸、ADP核糖基化细菌毒素或其突变体，如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT等。举例来说，PT和破伤风类毒素也具有它们自己的佐剂特性。在某些实施例中，本发明的组合物包含铝作为佐剂，例如呈氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钾铝或其组合的形式，浓度为每一剂量0.05-5mg(例如0.075-1.0mg)的铝含量。
在其他实施例中，本发明中所用的组合物不包含其他佐剂。
优选地，根据本发明的疫苗组合物包含一种佐剂。在某些优选实施例中，该佐剂为铝盐，如磷酸铝、氢氧化铝或其一种组合。优选地，一个、多个或全部aP抗原被吸附到铝盐上。其他抗原也可被吸附到铝盐上。在某些实施例中，一个、多个或全部aP抗原(PT、FHA、FIM、PRN(如果存在的话))被吸附到氢氧化铝上。在某些实施例中，一个、多个或全部aP抗原(PT、FHA、FIM、PRN(如果存在的话))被吸附到磷酸铝上。aP疫苗和aP组合疫苗与铝盐的配制品被例如描述在[德诺尔2002，《疫苗》20:2551-2555]。典型地，个别组分被单独地吸附到铝盐上，并且这些组分此后被混合形成疫苗配制品。这也允许制备某些组分被吸附到第一铝盐[例如Al(PO)4]，而其他组分被吸附到第二铝盐[例如Al(OH)3]的疫苗。组合疫苗的其他组分也可被吸附到铝盐上，例如DT和TT可被吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这些的组合上。DT和TT组分可被吸附到相同或不同的铝盐作为aP组分。具有增加价数的组合疫苗的其他组分也可被吸附到铝盐上，例如HBsAg、Hib和/或IPV可以或可以不被吸附到铝盐上。在其中组合疫苗包含HBsAg的某些优选实施例中，HBsAg被吸附到磷酸铝上(参见例如WO93/24148)。如果Hib被包含在组合疫苗中并且某些其他组分(如DT、TT或aP中的一个或多个)被吸附到氢氧化铝上，那么干扰(降低Hib组分的功效)的风险可例如通过以下而减小：将Hib吸附到磷酸铝上或使用不被吸附到铝佐剂上的Hib，并且通过同时(即刚好在给药之前)添加该Hib，或通过以氢氧化铝佐剂已被预饱和的方式与已被吸附到氢氧化铝佐剂上的其他组分混合而使这一Hib与其他组分组合，如WO 99/48525中所详细描述。技术人员因此意识到以合适方式配制根据本发明的组合疫苗的多种方式。
在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含PT、FHA、FIM2/3以及氢氧化铝，和任选地PRN。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含PT、FHA、FIM2/3以及磷酸铝，和任选地PRN。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含PT、FHA、FIM2/3、氢氧化铝以及磷酸铝，和任选地PRN。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*和氢氧化铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*和磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*、氢氧化铝以及磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含aP5*-IPV，和氢氧化铝或磷酸铝或氢氧化铝和磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*-IPV，和氢氧化铝或磷酸铝或氢氧化铝和磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*-Hib，和氢氧化铝或磷酸铝或氢氧化铝和磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*-HepB，和氢氧化铝或磷酸铝或氢氧化铝和磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*-Hib-HepB，和氢氧化铝或磷酸铝或氢氧化铝和磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*-Hib-IPV，和氢氧化铝或磷酸铝或氢氧化铝和磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*-HepB-IPV，和氢氧化铝或磷酸铝或氢氧化铝和磷酸铝。在某些实施例中，根据本发明的疫苗组合物包含DTaP5*-Hib-HepB-IPV，和氢氧化铝或磷酸铝或氢氧化铝和磷酸铝。
可使用标准给药途径进行根据本发明的组合物的给药。非限制性实施例包括不经肠给药，如通过例如皮内、肌肉内、经皮、鼻内注射等。在一个实施例中，疫苗是通过肌肉内注射到大腿中或注射到三角肌中而被给予。技术人员已知给予根据本发明的疫苗以便诱发对该疫苗中的至少一个抗原的免疫反应的多种可能性。一般来讲，百日咳疫苗的标准剂量为在前外侧大腿或(如果需要的话)三角肌中肌肉内给予的0.5mL。然而，在一次给药期间提供给患者的组合物中组分的量可如熟练的开业医师所已知的而变化。也可使佐剂(如果使用的话)适应于递送***。
虽然优选具有用于疫苗接种以抵抗百日咳的单一组合物，但技术人员应意识到如在此描述的本发明的作用也可通过接种aP疫苗的组分，即在12-100μg人类剂量下的PT、FHA、FIM，以及任选地PRN来获得，其中这些组分不一定都在同一组合物中，例如其中(一部分)FIM在单独的组合物中。举例来说，可购得的aP疫苗(具有在每一人类剂量0-5μg的剂量下的FIM)可通过以下来补充：以独立组分形式共给予FIM到给予12-100μg、例如15-80μg、20-60μg、20-50μg或20-25μg FIM的总剂量，例如通过注射包含PT、FHA、任选地5μg剂量的FIM以及任选地PRN的一个第一aP疫苗组合物，并且注射包含(其余部分的)FIM的一个独立组合物以补充到12-100μg、例如15-80μg、20-60μg、20-50μg或20-25μg FIM的总剂量。在这些实施例中，共给予意思指独立组合物在给药之间的一小时内、优选几分钟内被给予(例如注射)，优选它们基本上同时被给予(例如通过共注射或通过连续注射)。可替代地，化合物可刚好在给药之前被混合，以使得单次注射(在组合物是根据本发明的组合物的情况下)是足够的。本发明因此还提供了一种用于对人类受试者进行疫苗接种以抵抗百日咳博德特氏菌，任选地百日咳博德特氏菌的一种PRN阴性菌株的方法，该方法包括给予该受试者以下百日咳博德特氏菌抗原：百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)以及2型和3型菌毛(FIM)，和任选地百日咳杆菌粘附素(PRN)，其中FIM是以12-100μg的一个量被给予。在优选实施例中，这是通过给予根据本发明的一种单一组合物来完成的。
本发明进一步用以下实例解释。这些实例不以任何方式限制本发明。它们仅仅用来阐明本发明。
实例
实例1.aP5疫苗中的高剂量FIM改善了抵抗PRN阴性百日咳博德特氏菌的保护
方法：
已验证的与aP疫苗临床功效有关的小鼠百日咳博德特氏菌肺激发模型(吉索，1999，《疫苗》17；2366-2376；德诺埃，2005，《疫苗》23:5333-5341；戈弗雷(Godfroid)，2004，《国际医学微生物学杂志》(Int.J.Med.Microbiol.)294；269–276)被用以测试添加或未添加2μg已纯化的FIM2/3抗原(李斯特生物实验室公司)的在四分之一人类剂量下的被许可的5组分无细胞百日咳疫苗(ADACELTM，赛诺菲巴斯德(Sanofi Pasteur)；在这一实例中另外称为aP5)的功效。每一0.5mL剂量的ADACELTM含有5Lf破伤风类毒素、2Lf白喉类毒素以及5种无细胞百日咳抗原(2.5μg已脱毒的百日咳毒素、5μg丝状血凝素、3μg百日咳杆菌粘附素以及5μg 2型和3型菌毛)。简单地说，雌性Balb/c小鼠在4周和7周龄时以1/4人类剂量皮下接种有或无FIM2/3抗原的aP5。因此，动物接受1.25μg FIM2/3(aP5组)或3.25μg FIM2/3(aP5+FIM组)，对应地等于人类中的5μg和13μg。在9周龄时，小鼠经鼻内用约106cfu百日咳博德特氏菌WHO 18323(一种百日咳杆菌粘附素阳性菌株)、一种百日咳杆菌粘附素阴性菌株PRN-STOP以及一种百日咳杆菌粘附素阴性菌株PRN-IS激发[昆南，2013，《新英格兰医学杂志》368:583-4]。在激发后2小时、2天、5天以及8天(n＝5/组)，通过在涂覆肺匀浆连续稀释液后计数博-让二氏琼脂板(Bordet-Gengou agar plate)上生长的百日咳博德特氏菌菌落测定肺清除率。
结果：
在接种添加或未添加FIM2/3抗原的aP5后的治疗反应随时间推移的概况被描绘在图1中。为了测试在接种aP5或aP5+FIM的小鼠之间在第5天和第8天的平均log10CFU计数之间的统计学显著差异，使用威斯康星精确检验。此外，治疗反应随时间推移(从第0天到第8天)的概况数据是通过协方差分析来建模(米利肯(Milliken)GA等人《协方差分析》，统计学系(Dept of Statistics)，堪萨斯州州立大学(Kansas State University)，1989.；SAS软件研究所(SAS Institute Inc.)，《SAS/STAT用户指导》(SAS/STAT User's Guide)，版本6，第四版，第2卷.凯里(Cary)，NC:SAS软件研究所，1989)。
对于百日咳博德特氏菌WHO18323菌株(一种PRN阳性菌株，图1A)，在第5天使用单侧威斯康星精确非参数检验的log10CFU计数差异比较显示，在接种aP5+FIM后的平均log10CFU计数显著低于(p<0.05)仅接种aP5后的那些计数。样品治疗反应-时间概况数据由通过以天数作为斜率项并且以天数×天数作为二次曲率项的协方差分析的拟合建模，显示从第0天到第8天的治疗反应无统计学显著差异。
在用百日咳博德特氏菌PRN-STOP菌株激发后(图1B)，在第5天使用单侧威斯康星精确非参数检验的log10CFU计数差异比较显示，在接种aP5+FIM后的平均log10CFU计数显著低于(p<0.02)仅激发aP5后的那些计数。样品治疗反应-时间概况数据由通过协方差分析模型的拟合建模显示，从第0天到第8天治疗反应无统计学显著差异。
对于百日咳博德特氏菌PRN-IS菌株(图1C)，使用单侧威斯康星精确非参数检验在第5天的log10CFU计数的差异比较指示，疫苗治疗之间无显著差异。使用威斯康星精确非参数检验，在第8天存在接种aP5+FIM后的平均log10CFU计数与仅接种aP5的平均log10CFU计数相比更低(P<0.08)的一种趋势。威斯康星精确检验的渐近模拟显示出在第8天的一个显著疫苗差异(p<0.03)。样品治疗反应-时间概况数据由通过以天数作为斜率项并且以天数×天数×trt作为二次曲率项的协方差分析的拟合建模表明了从第0天到第8天的治疗反应差异。
为了检验治疗作用的差异，从第0天到第8天治疗概况之间的线性对比指示，接种aP5+FIM后的平均log10CFU计数显著低于(p<0.01)仅接种aP5后所测量的那些计数。
总而言之，这些结果显示添加2μg FIM2/3到1/4人类剂量的阿得赛(Adacel)疫苗显著增加了这一疫苗在小鼠鼻咽激发模型中针对一种PRN阴性百日咳博德特氏菌分离株的功效。这一发现是令人惊讶的，因为先前还没有任何增加百日咳疫苗中FIM的量将增加它的功效的提议。这一结果特别切合目前在全世界出现并且引发疾病的PRN阴性菌株的情形。
实例2.添加FIM后在小鼠激发模型中增加的疫苗功效具有剂量依赖性
方法：
为了研究增加的FIM剂量是否与增加的疫苗功效相关(这将表明该作用具有FIM特异性)，使用如上所述的已验证的小鼠百日咳博德特氏菌肺激发模型。给动物接种添加或未添加FIM2/3(李斯特生物实验室公司；材料另外称为FIM)的1/10人类剂量的被许可的2组分aP疫苗(赛诺菲巴斯德MSD；疫苗在下文称为aP2)。每一人类0.5mL剂量的含有：(至少)40IU破伤风类毒素(TT)；(至少)30IU白喉类毒素(DT)；对应地为40、8以及32D-抗原单位的1型、2型以及3型失活的脊髓灰质炎病毒(IPV)；10μg与TT结合的B型流感嗜血杆菌多糖(Hib-TT)；以及2种无细胞百日咳抗原(25μg已脱毒的百日咳毒素(PT)和25μg丝状血凝素(FHA))。对应地相当于每一人类剂量5、10、15、20、25或50μg FIM的0.5；1.0；1.5；2.0；2.5或5.0μg量的FIM被吸附到氢氧化铝并且与被许可的aP2疫苗共给予(以一种独立的注射形式)(由此模拟根据本发明的具有高剂量FIM的aP疫苗)。在9周大时，小鼠经鼻内用约106cfu的PRN阴性百日咳博德特氏菌菌株(I195)激发。在2小时(n＝5/组)和第5天(n＝10/组)，通过在涂覆肺匀浆连续稀释液后计数博-让二氏琼脂板上生长的百日咳博德特氏菌菌落测定肺清除率。
结果：
在FIM的量增加的情况下，观察到由已接种小鼠的肺培养的百日咳博德特氏菌菌落的数目呈剂量依赖性减少。类似地，在接种1/25稀释和增加量的FIM的小鼠中观察到，由已接种小鼠的肺培养的百日咳博德特氏菌菌落的数目呈剂量依赖性减少。图2示出了在用百日咳博德特氏菌菌株I195激发后5天，由在增加量的FIM存在下接种1/10人类剂量的aP2的小鼠的肺获得的log10CFU计数。表1示出了平均Log10CFU计数和使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)(绘制医学图表(GraphPad Prism))比较在以1/10人类剂量接种有或无FIM的aP2后的平均log10CFU计数所计算的p值。在添加2μg或更多FIM到1/10人类剂量(人类剂量等于20μg)的aP2后，疫苗功效显著增加。
结论：
增加的FIM剂量对于疫苗功效的剂量依赖性作用证明FIM的这一作用具有特异性。此外，包含高剂量FIM的疫苗比含有目前可购得的aP5疫苗中存在的最大量(每一人类剂量5μg)FIM的疫苗更加有效。这与实例1中的发现保持一致，显示增加aP疫苗中FIM的剂量超过每一人类剂量10μg改善功效，并且进一步将发现扩展到不同aP疫苗和额外的PRN阴性百日咳菌株。
实例3.观察到添加有FIM的aP5疫苗针对多种百日咳博德特氏菌菌株的增加功效
方法：
如上所述已验证的小鼠百日咳博德特氏菌肺激发模型被用以研究增加剂量的FIM是否改善针对多种百日咳博德特氏菌菌株的疫苗功效。使用1/10人类剂量的(赛诺菲巴斯德；每一人类剂量含有2.5μg PT、5μg FHA、3μg PRN以及5μg FIM2/3，也参见实例1；在此称为aP5)或(葛兰素史克生物制品有限公司(GlaxoSmithKlineBiologicals)；每一人类剂量含有5Lf破伤风类毒素、2.5Lf白喉类毒素、8μg PT、8μg FHA以及2.5μg PRN；在此称为aP3)，添加或未添加(以吸附到氢氧化铝后的独立注射形式)5μgFIM(李斯特生物实验室公司)，相当于每一人类剂量50μg。在4周和7周龄时被疫苗接种的动物在9周龄时用以下百日咳博德特氏菌菌株中的一种激发：WHO18323(PRN阳性)、24422(PRN阴性)、24421(PRN阴性)或I195(PRN阴性)。在2小时(n＝5/组)和第5天(n＝10/组)，通过在涂覆肺匀浆连续稀释液后计数博-让二氏琼脂板上生长的百日咳博德特氏菌菌落测定肺清除率。
结果：
添加5μg FIM到1/10人类剂量的aP5改善了针对所有百日咳博德特氏菌菌株的疫苗功效，这达到了针对3种所测试的百日咳菌株的统计显著性(WHO18323(p＝0.04)、PRN-24421(p＝0.03)以及PRN-I195(p＝0.001))(图3、表2)。
这一实验也使用aP3(1/10人类剂量)来进行。关于三种激发菌株(WHO18323、24422以及24421)，使用这一aP3疫苗在添加FIM后并未观察到减少，虽然这可能部分通过这一特定aP3在无FIM给予时对于这些激发菌株已经观察到高功效来解释。然而，当用百日咳博德特氏菌菌株I195激发时，在添加FIM到这一aP3的情况下观察到log10CFU计数显著减少。
总的来说，这些数据表明具有高剂量FIM的疫苗将具有针对一系列百日咳菌株的改善功效。
结论：
在用高水平FIM与可购得的aP5疫苗的组合免疫后观察到的针对一组百日咳博德特氏菌菌株的增加功效表明，所观察到的高FIM剂量的益处也针对不同百日咳菌株。因此，根据本发明的包含高剂量FIM的疫苗可有助于降低百日咳疾病率。
实例4.添加FIM对于目前可购得的不同aP疫苗的增加功效
方法：
如上所述已验证的小鼠百日咳博德特氏菌肺激发模型被用以研究增加剂量的FIM(李斯特生物实验室公司)是否改善(赛诺菲巴斯德；每一人类剂量含有2.5μgPT、5μg FHA、3μg PRN以及5μg FIM2+3作为aP组分)、(赛诺菲巴斯德MSD；每一人类剂量含有25μg PT和25μg FHA作为aP组分)或(葛兰素史克生物制品有限公司；每一人类剂量含有8μg PT、8μg FHA以及2.5μg PRN作为aP组分)的疫苗功效。
小鼠在4周和7周龄时接种1/10人类剂量添加或未添加5μg FIM的商业疫苗(相当于每一人类剂量添加50μg FIM)，在9周龄时用百日咳博德特氏菌百日咳杆菌粘附素阴性菌株I195激发，并且激发后5天(n＝10/组)通过计数博-让二氏琼脂板上生长的百日咳博德特氏菌菌落来测定肺清除率。
结果：
对于所有三种疫苗，添加FIM导致平均Log10CFU计数与仅接种商业疫苗后的平均Log10CFU计数相比显著更低(表3)。
结论：
所有三种疫苗的疫苗功效在添加FIM后显著改善。这表明FIM的作用可被推广到含有不同量百日咳抗原和不同量FIM的一系列商业aP疫苗。已包含FIM的疫苗或不包含FIM的疫苗(或)的功效改善，显示不仅FIM的存在有助于疫苗功效，而且FIM的剂量也是重要的。
实例5.在接种高剂量FIM后针对各种各样百日咳菌株的抗FIM抗体功能性增加
抗体针对百日咳组分的功能活性已被确定为有待考虑的重要附加参数，特别是在评估含有已知诱发抗体功能活性(对应地如毒素中和与细菌凝集)的PT和FIM的新配制品时。已建立测量全细胞百日咳博德特氏菌凝集抗体的分析。虽然不存在已被发现与百日咳疫苗的保护性功效直接相关的功能阈值，但尽管如此它们仍是作为新疫苗配制品与已证明那些是安全和有效的的那些(来自aP疫苗的WHO草案建议，WHO/BS/2011.2158，第C.2.1.2部分)总体比较的一部分要确定的重要免疫参数。因此，考虑到关于含有FIM的aP疫苗的这些分析的相关性，我们使用凝集分析来进一步针对多种百日咳博德特氏菌菌株测试本发明的疫苗。
方法：
从在4周和7周龄时接种添加或未添加FIM(李斯特生物实验室公司)的1/10人类剂量的(赛诺菲巴斯德MSD；每一人类剂量含有25μg PT和25μg FHA作为aP抗原；在此称为aP2)的小鼠采集血清。对应地相当于每一人类剂量5或20μg FIM的0.5或2.0μg量的FIM被吸附到氢氧化铝并且与可购得的aP2疫苗共给予(以独立注射形式)。在第9周，牺牲每一给药组的5只动物，并且集中从末端血液分离的血清用于抗FIM(功能)抗体水平的研究。为了评估功能抗体对FIM的反应，进行凝集分析。在这一分析中，在测试血清中功能抗体的存在导致在与百日咳博德特氏菌混合时抗原/抗体复合物的形成。阳性凝集被定义为孔中因抗原/抗体复合物的存在而存在不透明溶液。阴性凝集是以所定义的在孔底部的细菌沉降物形式被观察到。简单地说，50μl测试血清在PBS中被连续稀释并且与50μl的OD600为1.0的百日咳博德特氏菌悬浮液混合。这一混合物被培育过夜，并且次日使用倒镜测定存在或不存在细菌沉降物。凝集效价被定义为导致完全凝集的最高稀释度。
为了研究通过对小鼠进行疫苗接种所诱发的抗FIM抗体是否功能性针对一组百日咳博德特氏菌菌株，测试血清是否具有使10种表达FIM的不同百日咳博德特氏菌菌株凝集的能力。从一组30种最新临床百日咳博德特氏菌分离株(由费城圣·克里斯托弗儿童医院(St.Christopher's Hospital for Children)的艾伦埃万杰利斯塔医生(Dr.AlanEvangelista)好意地提供)，24种分离株在阳性对照商业抗FIM单克隆抗体(06/128,NIBSC,UK)下显示清楚的凝集读数，证实这些菌株表达FIM抗原。从这组24种菌株中选择5种PRN阴性菌株和5种PRN阳性菌株用于测试小鼠血清。
结果：
在FIM存在下的疫苗接种诱发功能抗体效价。在FIM存在下接种的小鼠的全部6个小鼠血清池观察到针对全部10种百日咳博德特氏菌菌株的阳性凝集。未接种的对照组和仅接受1/10人类剂量aP2(不包含FIM)的组不显示任何凝集(表4)。虽然在已验证的小鼠百日咳博德特氏菌肺激发模型中已显示高剂量的FIM比低剂量的FIM更加有效(实例2)，但是不存在明确的FIM剂量-反应相关性(未显示其他FIM剂量的数据)，这可能归因于这一WHO标准化分析的局限性，该分析并未敏感到足以检测到凝集中的小差异。
结论：
在FIM存在下接种商业疫苗导致诱发针对一大组百日咳博德特氏菌菌株(PRN阴性或PRN阳性菌株)的功能抗体。这一发现表明，包含高剂量FIM的疫苗将有效减少由各种各样的百日咳博德特氏菌菌株所引起的百日咳疾病。
表1.添加增加剂量的FIM到aP2疫苗对保护的影响
表1：如使用曼-惠特尼，比较在4周和7周龄时在接种添加FIM的在1/10人类剂量下的aP2与仅以1/10人类剂量给予的aP2后，在第9周用PRN阴性百日咳博德特氏菌菌株I195激发的小鼠的肺的平均Log10CFU计数的差异来确定P值。关于详情，参见实例2。
表2.添加FIM到aP5疫苗对针对不同菌株的保护的影响
表2：在4周和7周龄时接种添加或未添加5μg FIM的在1/10人类剂量下的aP5后，在第9周用4种不同百日咳博德特氏菌菌株激发后5天的小鼠的肺的平均Log10CFU计数。使用曼-惠特尼确定P值。关于详情，参见实例3。
表3.添加FIM到不同商业aP疫苗的影响
表3：在4周和7周龄时接种添加或未添加5μg FIM的在1/10人类剂量下的3种被许可的不同aP疫苗后，在第9周用百日咳博德特氏菌菌株I195激发后5天，小鼠的肺的平均Log10CFU计数。使用曼-惠特尼确定P值。关于详情，参见实例4。

Claims (14)

1.一种无细胞百日咳(aP)疫苗组合物在制备一种保护受试者免受由百日咳博德特氏菌的一种PRN阴性菌株感染所引起的百日咳的疫苗中的用途，其中所述无细胞百日咳(aP)疫苗组合物包含百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)抗原百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、以及2型和3型菌毛(FIM)，其中FIM是以每一人类剂量12-100μg的一个量存在。
2.根据权利要求1所述的用途，其中FIM是以每一人类剂量15-60μg的一个量存在。
3.根据以上权利要求中任一项所述的用途，其中FIM是以每一人类剂量20-60μg的一个量存在。
4.根据权利要求1所述的用途，其中FIM是以每一人类剂量20-50μg的一个量存在。
5.根据权利要求1所述的用途，其中FIM是以每一人类剂量20-25μg的一个量存在。
6.根据权利要求1所述的用途，进一步包含百日咳杆菌粘附素(PRN)。
7.根据权利要求1所述的用途，其中PT被基因地脱毒。
8.根据权利要求1所述的用途，进一步包含除百日咳博德特氏菌以外的一种或多种病原体的抗原。
9.根据权利要求8所述的用途，包含破伤风类毒素和白喉类毒素。
10.根据权利要求8或9所述的用途，包含以下一者或多者：
a)流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)寡糖或多糖结合物；
b)B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；以及
c)失活的脊髓灰质炎病毒(IPV)。
11.根据权利要求1所述的用途，进一步包含一种佐剂。
12.根据权利要求11所述的用途，其中该佐剂包含氢氧化铝、磷酸铝或其组合。
13.百日咳博德特氏菌抗原在制备一种对人类受试者进行疫苗接种以抵抗百日咳博德特氏菌的一种PRN阴性菌株的疫苗中的用途，其中所述百日咳博德特氏菌抗原为：百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、以及2型和3型菌毛(FIM)，其中FIM的量是12-100μg。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述百日咳博德特氏菌抗原进一步包含百日咳杆菌粘附素(PRN)。
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