CN111551732A

CN111551732A - 定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡pd-l1含量的方法、elisa试剂盒及使用方法

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Publication number: CN111551732A
Application number: CN202010475012.5A
Authority: CN
Inventors: 陈刚; 余自力; 刘金元; 吴敏; 赵怡芳
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Jiabi Biotechnology (Wuhan) Co.,Ltd.
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD‑L1含量的方法、ELISA试剂盒及使用方法，利用抗EGFR抗体特异性捕获肿瘤来源的细胞外囊泡，利用抗PD‑L1抗体检测细胞外囊泡中PD‑L1蛋白的含量，利用构建的EGFR‑PD‑L1融合蛋白作为标准品实现对肿瘤来源细胞外囊泡中PD‑L1的定量检测。现有的ELISA检测策略只能检测体液中总PD‑L1水平或者总细胞外囊泡上PD‑L1水平，本发明利用“双抗夹心”ELISA策略，实现了特异性和定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡所携带的PD‑L1的含量，具有明显的优势。

Description

定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法、 ELISA试剂盒及使用方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法、ELISA试剂盒及使用方法。

背景技术

最新的数据显示，全球每年新增恶性肿瘤患者1810万人，死亡960万人，恶性肿瘤已经是严重威胁人类健康和生命的疾病。大多数恶性肿瘤患者在确诊时已处于晚期，失去了手术机会，且对放化疗等保守治疗方式不敏感，因此预后普遍较差。然而，近几年来免疫治疗的兴起为晚期恶性肿瘤患者带来了希望，其中针对免疫检查点程序性凋亡配体-1/程序性死亡受体-1(PD-L1/PD-1)通路的抑制剂是目前肿瘤免疫治疗的代表性药物。尽管PD-L1/PD-1免疫治疗疗效显著，甚至可以完全消除肿瘤达到治愈效果，但PD-L1/PD-1免疫治疗并非对每一个患者都有效。临床试验结果表明，仅有不到30％的患者能够从PD-L1/PD-1免疫治疗中获益。加之不仅治疗费用高，且治疗周期长，若治疗无效，患者将丧失及时接受其他治疗的时机。更重要的是，免疫治疗引起的不良反应也不容忽视。因此寻找能够在治疗早期预测免疫治疗疗效的生物标志物是当务之急。

细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是由细胞分泌产生的一类直径介于50-1000nm的双层磷脂分子组成的膜结构的统称，其携带丰富的生物活性分子(如蛋白质、核酸等)，并可通过自分泌或旁分泌途径参与对局部或远处细胞的功能调控，影响细胞外微环境。发明人前期发表于Nature(Exosomal PD-L1contributes to immunosuppressionand is associated with anti-PD-1response,Gang Chen等，Nature,2018年560卷7718期382-386页)的一项研究显示，肿瘤细胞分泌富含PD-L1的细胞外囊泡进入机体外周循环***参与免疫抑制；更重要的是，发明人还发现肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞来源的细胞外囊泡携带的PD-L1水平，在肿瘤进展以及免疫治疗的不同阶段，呈现有规律的动态变化。因此，定量检测肿瘤患者体液(尤其是外周血)中肿瘤细胞外囊泡携带的PD-L1水平，将有望成为预测恶性肿瘤进展、预后以及免疫治疗疗效的液体活检的新标志物。

基于以上结果，发明人前期提出了一种基于肿瘤患者外周血细胞外囊泡上PD-L1浓度水平ELISA检测策略，并用于预测免疫治疗有效性。该ELISA策略，以抗PD-L1抗体作为捕获抗体，将细胞外囊泡固定于ELISA孔板中，利用抗PD-L1抗体来检测细胞外囊泡上的PD-L1水平，利用PD-L1标准蛋白对细胞外囊泡中PD-L1水平进行定量。然而，已有研究表明患者体液中既存在细胞外囊泡上的PD-L1，还存在大量游离的PD-L1蛋白。如果直接对体液进行针对PD-L1的ELISA检测，将受到游离PD-L1的干扰。因此，为了避免游离PD-L1的干扰，该策略需要预先利用超速离心法对体液中的细胞外囊泡进行分离和纯化。超速离心法不仅耗时费力，没有标准化的操作流程需要大型的超速离心设备，不利于临床推广应用；更重要的是，超速离心法分离细胞外囊泡的效率不足30％。这30％的细胞外囊泡中PD-L1的水平能否准确反映总细胞外囊泡中PD-L1水平目前仍然不清楚。更重要的是，目前已经证实正常细胞(如巨噬细胞、单核细胞等)也可以分泌携带PD-L1的细胞外囊泡。尽管现有的ELISA策略能检测位于细胞外囊泡上的PD-L1，显然无法准确判定PD-L1⁺的细胞外囊泡是否来自肿瘤细胞。正常细胞分泌的PD-L1⁺的细胞外囊泡对定量检测肿瘤来源细胞外囊泡中PD-L1带来了极大的干扰。因此，亟待建立一种可以特异性和定量检测体液中肿瘤来源的细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA策略，以提高免疫治疗疗效预测的准确率，促进免疫治疗的长足发展。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，不仅避免了体液中游离PD-L1的干扰，而且还避免了正常细胞分泌的PD-L1⁺细胞外囊泡的干扰，可以特异低和准确地定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡上PD-L1蛋白水平。

本发明的目的之二在于提供一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，可以快速特异性定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡中PD-1的含量。

本发明的目的之三在于提供一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒的使用方法。

本发明实现目的之一所采用的方案是：一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，利用抗EGFR抗体特异性捕获体液中肿瘤来源的细胞外囊泡，利用抗PD-L1抗体检测细胞外囊泡中PD-L1蛋白的含量，利用构建的EGFR-PD-L1融合蛋白作为标准品实现对肿瘤来源细胞外囊泡中PD-L1的定量检测。

研究表明，EGFR在多种上皮源性恶性肿瘤中表达水平均出现明显的升高，如口腔癌、肺癌、尿路上皮癌、肝癌、乳腺癌、脑胶质瘤等。已广泛用于肺癌、口腔癌临床的西妥昔单抗正是针对恶性肿瘤细胞这一特征开发的靶向治疗药物。根据细胞外囊泡形成机制，高表达EGFR的肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡则继承了母细胞的EGFR。基于上述研究现状，本发明中提出了一种体液PD-L1水平ELISA检测新方法，该方法以抗EGFR抗体作为体液细胞外囊泡的捕获抗体，以抗PD-L1抗体作为检测抗体，以本发明构建的EGFR-PD-L1融合蛋白作为标准品，从而实现定量检测体液中肿瘤来源的细胞外囊泡PD-L1含量。该方法与现有的ELISA检测方法相比，不仅避免了体液中游离PD-L1的干扰，而且还避免了正常细胞分泌的PD-L1⁺细胞外囊泡的干扰，可以特异地和准确地定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡上PD-L1蛋白水平。本方法将在恶性肿瘤的早期诊断、预后评估、免疫治疗疗效预测等方面有着广阔的应用前景。

优选地，所述EGFR-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQ ID No：1所示。

优选地，所述抗EGFR抗体可替换为抗EpCAM抗体或抗HER2抗体；利用构建的对应的EpCAM-PD-L1融合蛋白或HER2-PD-L1融合蛋白作为标准品。

本发明利用肿瘤特异性表达的标志分子作为肿瘤来源细胞外囊泡的捕获靶标，本发明以EGFR为例展示检测的策略和方法。根据不同肿瘤表达的标志物的差异，可根据实际检测要求和肿瘤类型，对捕获抗体进行选择和自主搭配，包括但不限于EpCAM、HER2等肿瘤标志分子对应的抗体作为捕获抗体。

优选地，所述体液包括血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、***、淋巴液中的任意一种；所述肿瘤包括口腔癌、肺癌、尿路上皮癌、肝癌、乳腺癌、脑胶质瘤中任意一种。

除血液为针对全身各型癌症外，所采集的其余体液为针对所检测癌症的特异性部位液体，如针对口腔及邻近部位癌症的唾液、针对尿路上皮癌的尿液、针对肺癌的胸腔积液、针对脑胶质瘤的脑脊液等。体液样本，包括但不局限于人、猴、小鼠、大鼠、兔、猪、猴、狗等动物。

本发明实现目的之二所采用的方案是：一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，包括ELISA酶标板、封板膜、标准蛋白、标准蛋白稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体A、酶标抗体B、显色剂A液、显色剂B液和终止液；

其中，所述ELISA酶标板为按1-5μg/mL浓度提前包被好抗EGFR抗体的酶标板；

所述标准蛋白为构建的EGFR-PD-L1融合蛋白。

所述ELISA试剂盒选用的ELISA酶标板为Biolegend公司的Nunc型号酶标板，所述封板膜为Corning公司的封板膜，货号UC-500；所述标准蛋白稀释液包括缓冲液100～300mmol/L、稳定剂5～20g/L、防腐剂2～6g/L，所述浓缩洗涤液为含0.01～0.05mol/L PBS、1‰～5‰的Tween-20的水溶液。

其构建方法为：构建EGFR-连接蛋白-PD-L1质粒；采用蛋白表达标准方法合成、分离和纯化。

优选地，所述ELISA酶标板可替换为按1-5μg/mL浓度提前包被好抗EpCAM抗体或抗HER2抗体的酶标板；所述标准蛋白为构建的对应的EpCAM-PD-L1融合蛋白或HER2-PD-L1融合蛋白。

优选地，所述抗EGFR抗体为R&D system公司的EGFR抗体，货号AF231。

所选择的EGFR捕获抗体为市售，经过对市售多种抗体筛选后，选择R&D system公司的EGFR抗体，货号AF231。

优选地，所述酶标抗体A为1μg/mL PD-L1检测抗体，所述酶标抗体B为1μg/mL辣根过氧化物酶耦联显色抗体；所述显色剂A液按质量百分数计包括醋酸钠2.72％、柠檬酸0.32％、双氧水0.02％，余量为蒸馏水；所述显色剂B液按质量百分数计包括乙二胺四乙酸二钠0.04％、柠檬酸0.19％、甘油9％、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺0.03％，余量为蒸馏水；所述终止液为2mol/L稀硫酸。

所述酶标抗体A为1μg/mL PD-L1检测抗体，为对市售多种PD-L1检测抗体筛选后，选择eBioscience公司的PD-L1抗体，货号13-5983-82。所述酶标抗体B为1μg/mL辣根过氧化物酶耦联显色抗体，为对市售多种辣根过氧化物酶显色抗体筛选后，选择BD公司辣根过氧化物酶显色抗体，货号554066。

本发明实现目的之三所采用的方案是：一种所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)在室温条件下平衡后取出ELISA酶标板，在ELISA酶标板上设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度梯度的标准蛋白，样本孔中加入待测体液样本，37℃培养1小时；

(2)弃去孔内液体，注入洗涤液，反复洗涤多次，倒置于吸水纸上拍干；

(3)在ELISA酶标板孔加入100μL预先混合好的酶标抗体A液、酶标抗体B液，用封板膜封住酶标板孔，37℃孵育1小时；

(4)弃去孔内液体，注入洗涤液，反复洗涤多次，倒置于吸水纸上拍干；

(5)将显色剂A液、显色剂B液按体积比为1:1混合，每孔加入100μL，室温避光显色；

(6)观察标准品孔10-30分钟内出现颜色梯度改变后加入50μL终止液终止显色，轻轻摇动至孔内终止完全，15分钟内分别在450nm和570nm波长处测定各孔OD值，计算450nm处OD值减去570nm处OD值即为样品的最终OD值，并计算待测样本浓度。

本发明在步骤1中所提及的体液样本需经过初步离心处理，针对不同体液主要有三种离心条件：一种为对唾液和其他粘稠体液的方法，离心力2600g，离心温度4℃，离心时间15分钟，收集上清，共离心两次；第二种为对血液的离心方法，离心力1550g，离心温度25℃，离心时间20分钟，收集上方透明血浆，共离心两次；第三种为针对尿液等相对清亮体液的离心方法，离心力1550g，离心温度4℃，离心时间15分钟，取上清，共离心两次。

本发明在步骤1中建议的优选标准品浓度梯度为16ng/mL、12ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL八个浓度梯度，每个标准孔加入100μL。

本发明在步骤1和步骤3中所提及的水浴锅或温箱，孵育温度为37℃，孵育时间为1小时。

本发明在步骤2和步骤4所提及的洗涤方法为，吸净孔内反应液，将洗涤液注满孔，放置2分钟，略作摇动，吸净孔内洗涤液后放在吸水纸上拍干。

本发明在步骤2到步骤6使用8或12道移液器加液，以减少操作误差和上样误差。

作为一种优选的技术方案，本发明步骤6所提及的OD值为吸光度值，需要用450nm波长处的OD值减去570nm波长处的OD值进行校正，最终根据标准品的线性关系计算样本浓度。

本发明具有以下优点和有益效果：

现有的ELISA检测策略只能检测体液中总PD-L1水平或者总细胞外囊泡上PD-L1水平，本发明利用“双抗夹心”ELISA策略，实现了特异性和定量检测体液中肿瘤细胞来源细胞外囊泡所携带的PD-L1的含量，具有明显的优势。另外，本发明还具有以下特点：1.首次提出了一种定量检测肿瘤细胞来源细胞外囊泡携带的PD-L1含量的ELISA策略；2.首次构建EGFR-PD-L1融合蛋白作为标准蛋白，并可以被市售EGFR捕获抗体和PD-L1检测抗体所识别；3.改变了传统“A-A-A三明治”ELISA检测游离单一蛋白分子的模式，利用“A-AB-B”策略检测细胞外囊泡复杂结构。

本发明的ELISA试剂盒以特异性定量检测肿瘤细胞来源细胞外囊泡上PD-L1，可以在包括肿瘤在内的多种疾病的早期诊断、预后评估、疗效预测方面中进行广泛应用。

附图说明

图1为本发明实施例二中正常细胞系(HUVEC)和癌症细胞系(Cal27、H1975)细胞外囊泡粒径分析(a-c)；

图2为本发明实施例二中癌症细胞系分析中EGFR-PD-L1重组蛋白标准曲线；

图3为本发明实施例二中正常细胞系(HUVEC)和癌症细胞系(Cal27、H1975)的细胞上清(Supernatant)、细胞外囊泡(EVs)、超速离心后上清(EVs-Free Supernatant)ELISA检测结果；

图4为本发明实施例三中H1975移植瘤裸鼠细胞外囊泡中PD-L1蛋白水平与肿瘤体积变化趋势；

图5为本发明实施例四中血液分析中EGFR-PD-L1重组蛋白标准曲线；

图6为本发明实施例四中正常受试者(HD)、口腔癌患者(OSCC)、非小细胞肺癌患者(NSCLC)、骨肉瘤患者(OS)的血浆(Plasma)、细胞外囊泡(EVs)、超速离心后上清(EVs-Freeplasma)ELISA检测结果。

具体实施方式

为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例一：EGFR-PD-L1融合蛋白的构建

1.根据Pubmed Gene查询到人源EGFR基因序列(Gene ID:1956)，选取其中Met1到Ser645翻译片段；以及人源PD-L1基因序列(Gene ID:29126)，选取其中Phe19到Thr239翻译片段；在两端序列间***连接蛋白序列(GGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGCGGTAGTGGTGGTGGTGGTAGC)，在尾端添加一段His标签序列(CATCACCATCATCATCAT)，引入EcoRl、Xhol双酶切位点，设计一对正反引物(表1)，进行PCR扩增获得EGFR-Linker-PD-L1基因片段。

表1.EGFR引物

2.将EGFR-Linker-PD-L1基因片段与经过Ecorl、Xhol双酶切后的Pet28a质粒通过Exnase重组酶(诺唯赞公司，货号C113-01)进行连接，经过转化筛选后得到重组质粒EGFR-Linker-PD-L1，其核酸序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

3.将重组质粒EGFR-Linker-PD-L1转入E.coli DH5α感受态细菌中，经过Kanamycin抗性的琼脂糖培养基(K⁺LB)大量扩增后，抽提质粒。

4.将抽提的重组质粒EGFR-Linker-PD-L1转入Rosetta(DE3)感受态细菌中，均匀涂布于K⁺LB平板获得目的克隆菌株。

5.挑选单菌落至50mL K⁺LB培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5～1mmol/L刺激蛋白表达，连续培养4～8h，12000r/分钟离心15分钟分别收取上清和沉淀，经PBS稀释或重悬后每100μL加入20μL6×蛋白上样缓冲液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色分析鉴定。

6.将收取的细菌沉淀加入8mL细菌裂解液(TRIS-HCl 50mmol/L，NaCl 300mmol/L，TritonX-1000.5％，pH＝8.0)，在冰上混合30分钟，在4℃12000g条件下离心10分钟，用15倍体积包涵体溶解缓冲液(TRIS-HCl 50mmol/L，NaCl 100mmol/L，EDTA 1mmol/L，TritonX-100 0.5％，尿素8mol/L，pH＝8.0)重悬沉淀。

7.将以上重悬液加入10mmol/L咪唑后加入层析柱，控制流苏0.5～1ml/分钟，以流速为1ml/分钟的洗涤缓冲液(TRIS-HCl 50mmol/L；Nacl 300mmol/L；咪唑10mmol/L；pH＝8.0)洗涤柱子以去除杂蛋白，重复洗涤6次后使用洗脱缓冲液(TRIS-HCl 50mmol/L；Nacl300mmol/L；咪唑250mmol/L；pH＝8.0)分4次洗脱，收集洗脱液。

8.将收集到的洗脱液使用半透膜透析到PBS中，4℃透析过夜，收集到膜内溶液，获得即为EGFR-PD-L1融合蛋白。

实施例二：口腔癌和肺癌细胞系来源细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA检测

1.使用无外泌体胎牛血清(100000g，4℃过夜离心)培养的人正常细胞系HUVEC、人口腔癌Cal27细胞系以及人肺癌H1975细胞系，收集经过48小时低浓度胎牛血清(5％)饥饿培养的细胞上清。

2.将收集的10mL细胞上清在4℃2000g条件下离心30分钟，保留上清以除去细胞和细胞碎片，取1mL上清待检测，剩余9mL上清在4℃，100000g条件下离心70分钟，收集离心上清，并以20μL PBS重悬沉淀获得细胞外囊泡。

3.将重悬得到的细胞外囊泡进行纳米粒子跟踪分析(nanoparticle trackinganalysis,NTA)检测，发现HVUEC、Cal27和H1975来源的细胞外囊泡平均粒径均在100nm左右(图1，a-c)。

4.取100μL上述HUVEC、Cal27和H1975细胞系收集到的上清、细胞外囊泡(稀释20倍)、超速离心得到的上清加入样本孔，同时取实施例一中获得的EGFR-PD-L1标准蛋白按照16ng/mL、12ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL设置八个浓度梯度，每个标准品孔加入100μL，封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1小时。

5.操作步骤5的同时将酶标抗体A、B液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1小时。

6.弃去酶标板孔内液体，注入300μL PBST洗涤液，反复洗涤4次，倒置于吸水纸上拍干，加入100μL步骤6的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1小时。

7.弃去酶标板孔内液体，注入300μL PBST洗涤液，反复洗涤4次，倒置于吸水纸上拍干；将显色液A、B液按1:1混合，每孔加入100μL，避光显色。

8.至标准孔出现颜色线性改变后(10-30分钟)，每孔加入50μL终止液，轻轻摇动至孔内液体呈黄色，15分钟内用酶标仪测定450nm和570nm波长处测定OD值(450nm处OD值减去570nm处OD值即为样品的最终OD值)。

9.根据标准品结果绘制标准曲线(图2)，计算各细胞系样品PD-L1浓度(图3)，结果显示：肿瘤细胞系Cal27和H1975细胞上清和离心得到的细胞外囊泡结果相似，而超速离心后得到的上清中几乎无PD-L1，提示用本ELISA试剂盒可以直接定量检测培养上清中细胞外囊泡上的PD-L1；而正常细胞系HUVEC中无论细胞上清还是离心得到的细胞外囊泡上几乎检测不到PD-L1，表明可以使用本ELISA试剂盒，通过抓取EGFR来检测肿瘤细胞来源的细胞外囊泡的PD-L1含量。

实施例三：一种特异性定量检测肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒和检测方在动态监测肿瘤进展中的应用

1.取正常培养的对数期H1975细胞接种到8周龄裸鼠后背皮下，每只注射5×10⁶个细胞(100μL)，共接种20只；培养三周，拍照并测量肿瘤体积，肿瘤体积计算按照宽²×长/2进行计算。

2.对裸鼠行安乐死，采集裸鼠眼动脉血500μL，25℃1550g条件下离心10分钟，收集上层血浆；同样条件下离心10分钟，收集上层血浆。

3.取100μL裸鼠血浆加入样本孔，同时取实施例一中获得的EGFR-PD-L1标准蛋白按照16ng/mL、12ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL设置八个浓度梯度，每个标准品孔加入100μL，封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1小时。

4.操作步骤3的同时将酶标抗体A、B液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1小时。

5.弃去酶标板孔内液体，注入300μL PBST洗涤液，反复洗涤4次，倒置于吸水纸上拍干，加入100μL步骤4的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1小时。

6.弃去酶标板孔内液体，注入300μL PBST洗涤液，反复洗涤4次，倒置于吸水纸上拍干；将显色液A、B液按1:1混合，每孔加入100μL，避光显色。

7.待标准孔出现颜色线性改变后(10-30分钟)，每孔加入50μL终止液，轻轻摇动至孔内终止完全，15分钟内用酶标仪测定450nm和570nm波长处测定OD值(450nm处OD值减去570nm处OD值即为样品的最终OD值)。

8.根据标准品结果计算每只移植瘤裸鼠血浆内恶性肿瘤来源细胞外囊泡上PD-L1含量，并结合肿瘤体积进行分析(图4)。结果显示：PD-L1含量随着肿瘤体积增大而升高，提示恶性肿瘤来源细胞外囊泡上PD-L1含量可以提示肿瘤的进展。

实施例四：一种特异性定量检测肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒和检测方法在恶性肿瘤诊疗中的应用

1.收集五例正常受试者(HD)、五例口腔癌(OSCC)患者、五例非小细胞肺癌(NSCLC)患者、五例骨肉瘤(OS)患者的血液2mL，25℃1550g条件下离心10分钟，收集上层血浆；同样条件下离心10分钟，收集上层血浆；保留部分血浆检测用，剩余部分4℃16000g条件下离心10分钟，收集上清；4℃120000g条件下离心70分钟，收集上清并用20μL PBS重悬沉淀获得细胞外囊泡。

2.取100μL上述收集到的血浆、细胞外囊泡(稀释25倍)、超速离心得到的上清加入样本孔，同时取实施例一中获得的EGFR-PD-L1标准蛋白按照16ng/mL、12ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL设置八个浓度梯度，每个标准品孔加入100μL，封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1小时。

3.操作步骤2的同时将酶标抗体A、B液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1小时。

4.弃去酶标板孔内液体，注入300μL PBST洗涤液，反复洗涤4次，倒置于吸水纸上拍干，加入100μL步骤3的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1小时。

5.弃去酶标板孔内液体，注入300μL PBST洗涤液，反复洗涤4次，倒置于吸水纸上拍干；将显色液A、B液按1:1混合，每孔加入100μL，避光显色。

6.至标准孔出现颜色线性改变后(10-30分钟)，每孔加入50μL终止液，轻轻摇动至孔内终止完全，15分钟内用酶标仪测定450nm和570nm波长处测定OD值(450nm处OD值减去570nm处OD值即为样品的最终OD值)。

7.根据标准品结果绘制标准曲线(图5)，计算HD、OSCC、NSCLC、OS血液样品PD-L1浓度(图6)。结果显示：血浆和离心得到的细胞外囊泡结果相似，而超速离心后得到的上清中几乎无PD-L1，进一步提示可以直接用本ELISA试剂盒定量检测培养上清中细胞外囊泡上的PD-L1；而表达EGFR的上皮源性恶性肿瘤OSCC和NSCLC的血浆、细胞外囊泡中PD-L1含量明显高于HD，同样高于不表达EGFR的间质源性恶性肿瘤OS的结果，表明可以使用本ELISA试剂盒来检测上皮源性肿瘤来源的细胞外囊泡的PD-L1含量。

本方法在上皮源性恶性肿瘤的早期诊断、免疫治疗疗效预测、疾病转归等方面具有极大的应用潜能。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法、ELISA试剂盒及使用方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2664

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60

gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120

ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180

gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240

accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300

ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360

gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420

caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480

agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540

cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600

ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660

gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720

acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780

aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840

cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg 900

gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960

gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata 1020

ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080

aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140

ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200

atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260

gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320

gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380

gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440

tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500

gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560

agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaag 1620

cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680

gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740

cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800

ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860

catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920

cctaagatcc cgtccggtgg tggtggtagc ggtggtggcg gtagtggtgg tggtggtagc 1980

tttaccgtga ccgtgccgaa agatctgtat gttgttgaat atggtagcaa tatgacaatt 2040

gaatgtaaat ttccggtgga aaaacagctg gatctggcag cgctgattgt ttattgggaa 2100

atggaagata aaaacattat tcagtttgtg catggtgaag aagatctgaa agtgcagcat 2160

agctcatatc gccagcgtgc ccgtctgctg aaagatcagc tgagcctggg caatgccgcc 2220

ttacagatta ccgatgttaa attgcaggat gcgggtgtgt atcgttgcat gattagctat 2280

ggtggcgcag attataaacg cattaccgtg aaagttaatg caccgtataa taaaattaat 2340

cagcgtattc tggtggttga tccggtgacc tccgaacatg aactgacctg ccaggccgaa 2400

ggctatccga aagccgaagt gatttggacc agcagcgatc atcaggtgct gagcggtaaa 2460

accaccacca ccaatagcaa acgtgaagaa aaactgttta atgttaccag caccctgcgt 2520

attaatacca ccaccaatga aatcttttat tgcacctttc gccgtctgga tccggaagaa 2580

aatcataccg cagaactggt tattccggaa ctgccgctgg cccatccgcc gaatgaacgc 2640

acccatcacc atcatcatca ttaa 2664

<210> 2

<211> 887

<212> PRT

<213> EGFR-PD-L1(EGFR-PD-L1)

<400> 2

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Lys Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

645 650 655

Gly Gly Gly Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val

660 665 670

Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys

675 680 685

Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys

690 695 700

Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His

705 710 715 720

Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu

725 730 735

Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly

740 745 750

Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile

755 760 765

Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu

770 775 780

Val Val Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu

785 790 795 800

Gly Tyr Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val

805 810 815

Leu Ser Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu

820 825 830

Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile

835 840 845

Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala

850 855 860

Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg

865 870 875 880

Thr His His His His His His

885

Claims

1.一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：利用抗EGFR抗体特异性捕获体液中肿瘤来源的细胞外囊泡，利用抗PD-L1抗体检测细胞外囊泡中PD-L1蛋白的含量，利用构建的EGFR-PD-L1融合蛋白作为标准品实现对肿瘤来源细胞外囊泡中PD-L1的定量检测。

2.根据权利要求1所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：所述EGFR-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQ ID No：1所示。

3.根据权利要求1所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：所述抗EGFR抗体可替换为抗EpCAM抗体或抗HER2抗体；利用构建的对应的EpCAM-PD-L1融合蛋白或HER2-PD-L1融合蛋白作为标准品。

4.根据权利要求1所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：所述体液包括血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、***、淋巴液中的任意一种；所述肿瘤包括口腔癌、肺癌、尿路上皮癌、肝癌、乳腺癌、脑胶质瘤中任意一种。

5.一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，其特征在于：包括ELISA酶标板、封板膜、标准蛋白、标准蛋白稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体A、酶标抗体B、显色剂A液、显色剂B液和终止液；

所述标准蛋白为构建的EGFR-PD-L1融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，其特征在于：所述EGFR-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQ ID No：1所示。

7.根据权利要求5所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA酶标板可替换为按1-5μg/mL浓度提前包被好抗EpCAM抗体或抗HER2抗体的酶标板；所述标准蛋白为构建的对应的EpCAM-PD-L1融合蛋白或HER2-PD-L1融合蛋白。

8.根据权利要求5所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，其特征在于：所述抗EGFR抗体为R&D system公司的EGFR抗体，货号AF231。

9.根据权利要求5所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体A为1μg/mL PD-L1检测抗体，所述酶标抗体B为1μg/mL辣根过氧化物酶耦联显色抗体；所述显色剂A液按质量百分数计包括醋酸钠2.72％、柠檬酸0.32％、双氧水0.02％，余量为蒸馏水；所述显色剂B液按质量百分数计包括乙二胺四乙酸二钠0.04％、柠檬酸0.19％、甘油9％、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺0.03％，余量为蒸馏水；所述终止液为2mol/L稀硫酸。

10.一种权利要求5-9任一项所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：