CN105002267A - 一种日本对虾分子标记方法及应用 - Google Patents

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李瑞雪
廖妙飞
相兴伟
周宇芳
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract

本发明涉及一种日本对虾分子标记方法及应用，包括：提取DNA基因组、PCR扩增及产物鉴定，应用为筛选日本对虾种质资源多样性分析、遗传多样性分析、家系鉴定、分子群体遗传学研究、遗传图谱构建、重要经济性状定位、功能基因研究、辅助日本对虾分子遗传育种或养殖。本发明可快速的获得日本对虾的遗传标记基因座位的遗传变异多态性图谱，方法简便快捷，可直观的观察到结果；本发明主要应用于日本对虾群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建；本发明检测迅速、费用低，用途更为广泛。

Description

一种日本对虾分子标记方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学DNA分子遗传标记技术，具体涉及海洋经济动物日本对虾分子标记方法及应用。
背景技术
日本对虾又名花虾、竹节虾、花尾虾、斑节虾、车虾，广泛分布在印度洋、太平洋地区，中国江苏省以南沿海也有分布。日本对虾具有生长迅速、抗病力强、离水长时间不死，适合长途干运活销，是重要的创汇渔业虾类。日本对虾营养丰富，含蛋白质是鱼、蛋、奶的几倍到几十倍；还含有丰富的碘、钾、镁、磷等矿物质及维生素A、氨茶碱等成分，且其肉质和鱼一样松软，易消化，不失为老年人使用的营养佳品，对健康极有裨益；对身体虚弱以及病后需要调养的人也是极好的食物。故养殖日本对虾对于养殖户来说是一个极好的收益。
但养殖的快速发展而产生的病害使得日本对虾资源迅速衰减，尤其自90年代虾病爆发以来，日本对虾养殖业受到重挫，虾病的流行使得对虾抗病品系选育成为必需要解决的问题。目前，国内的渔业遗传改良主要以群体选育为主，但群体选育获得的后代，其个体间亲缘关系不明确，选育过程中不可避免地造成近交和遗传多样性的丢失。因此，品系改良需要用更精确的选育方法来进行。这些方法急需找到一种能够有效鉴别出不同家系的标记，从而清楚选育群体的亲缘关系，了解系谱信息，有效减少近交，且合理高效地利用选育群体。
中国专利公告号CN 100532573C，公告日2009年8月26日，名称为太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，该申请案公开了一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，包括利用GeneBank公布的太平洋牡蛎的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星标记。其不足之处在于，不适用于日本对虾家系的标记的检测与应用。
发明内容
本发明的目的在于为了解决现有鉴别出不同日本对虾家系的标记复杂、耗时长的缺陷而提供一种方便快捷的日本对虾分子标记方法。
本发明的另一个目的在于提供一种日本对虾分子标记的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种日本对虾分子标记方法，所述日本对虾分子标记方法包括以下步骤：
1)提取DNA基因组：取日本对虾组织150-200mg，剪碎后按照苯酚氯仿提取法提取DNA基因组，在0-4℃下保存备用；
2)PCR扩增：以步骤1)得到的DNA基因组为模板进行PCR扩增，用于扩增的特异引物命名为L10985与H11563，得到PCR扩增产物；其中，L10985:5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’；
H11563:5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’；
3)产物鉴定：将步骤2)得到的PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像***下观察并拍照记录。
在本技术方案中，分子标记是以个体间生物的大分子，尤其是生物体的遗传物质DNA核苷酸序列变异为基础的遗传标记。其发展对动物遗传学产生了革命性的影响，与传统的遗传标记如形态标记、细胞学标记与同工酶标记相比，分子标记技术可以快速直接的观察和探究到整个基因组的基因变异。此外还具有共显性，数量极多，多态性高，不受发育时期、季节、环境限制等优点。
在辅助育种过程中，利用DNA分子标记技术可以对日本对虾的重要经济性状(包括抗病、抗逆和选育高产品种)紧密连锁的基因进行辅助选择，缩短育种年限，大大提高效率。
作为优选，步骤2)中PCR反应体系总体积为50μL，包括DNA基因组50-100mg、10×Buffer 5-10μL、dNTP 0.2-0.3mmol/L、特异引物L10985、H11563各0.2-0.4μmol/L、Taq plus DNA聚合酶2-4U和氯化镁1.5-1.8mmol/L。
作为优选，PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、50℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环后，在72℃延伸7min。
作为优选，PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，其pH为8.0，电泳时间为1-1.5h，加入溴化乙锭至终浓度500ng/mL染色，然后在凝胶成像***下观察并拍照记录。
一种日本对虾分子标记的应用，所述应用为筛选日本对虾种质资源多样性分析、遗传多样性分析、家系鉴定、分子群体遗传学研究、遗传图谱构建、重要经济性状定位、功能基因研究与辅助日本对虾分子遗传育种或养殖。
在本技术方案中，分子标记技术可以在DNA水平上寻找和检测与疾病相关的基因，在辅助育种过程中，利用DNA分子标记技术可以对日本对虾的重要经济性状(包括抗病、抗逆和选育高产品种)紧密连锁的基因进行辅助选择，缩短育种年限，大大提高效率。从而对某些疾病做出检测，并作出判断。分子标记技术也可以对病原菌进行检测、分类以及遗传 关系的鉴定，掌握致病菌不同时期的存活情况，从而有效的控制和避免日本对虾大规模病害的爆发。
对遗传多样性及***发育研究来说，培养优良性状品种的前提条件是丰富的遗传多样性资源，而丰富的遗传多样性资源也会为养殖业带来巨大的经济效益，应用分子标记技术，能有效的分析日本对虾种内或中间的***发育和遗传多样性。
DNA分子标记可以使高密度和高覆盖率的日本对虾遗传连锁图谱不断完善，对基因定位、遗传育种等领域具有重大意义，而重要经济性状基因的标记和克隆，对培育日本对虾遗传优良，培育优质高产健康品种具有很大的意义。
本发明的有益效果：
1）本发明可快速的获得日本对虾的遗传标记基因座位的遗传变异多态性图谱，方法简便快捷，可直观的观察到结果；
2）本发明主要应用于日本对虾群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建；
3）本发明检测迅速、费用低，用途更为广泛。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步的解释：
实施例1
一种日本对虾分子标记方法，所述日本对虾分子标记方法包括以下步骤：
1)提取DNA基因组：取日本对虾组织150mg，剪碎后放入1.5mL离心管中，加入500μl缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；50mmol/L EDTA，pH 8.0)，混匀后加入终浓度为1％的SDS和200μg/ml的蛋白酶K，55℃水浴3h；12000转/min离心5min，取上清；向上清液中加入与上清液等体积的Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇混合液抽提一次，Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1，然后12000转/min离心5min，取上清液，向上清液中加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提一次，氯仿:异戊醇的体积比为24:1，5000转/min离心5min，取上清液；向上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇沉淀，然后70％乙醇洗涤沉淀两次，用TBE溶解；紫外分光光度计测定样品DNA的OD260、OD280值，确定其浓度和纯度，4℃保存备用；共17个样品；
2)PCR扩增：以步骤1)得到的DNA基因组为模板进行PCR扩增，用于扩增的特异引物命 名为L10985与H11563，得到PCR扩增产物；其中，L10985:5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’；
H11563:5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’；其中，PCR反应体系总体积为50μL，包括DNA基因组100mg、10×Buffer 10μL、dNTP 0.3mmol/L、特异引物L10985、H11563各0.4μmol/L、Taq plus DNA聚合酶4U和氯化镁1.8mmol/L；PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、50℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环后，在72℃延伸7min；
3)产物鉴定：将步骤2)得到的PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，其pH为8.0，电泳时间为1.5h，加入溴化乙锭至终浓度500ng/mL染色，然后在凝胶成像***下观察并拍照记录。
实施例2
一种日本对虾分子标记方法，所述日本对虾分子标记方法包括以下步骤：
1)提取DNA基因组：取日本对虾组织180mg，剪碎后放入1.5mL离心管中，加入500μl缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；50mmol/L EDTA，pH 8.0)，混匀后加入终浓度为1％的SDS和200μg/ml的蛋白酶K，55℃水浴3h；12000转/min离心5min，取上清；向上清液中加入与上清液等体积的Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇混合液抽提一次，Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1，然后12000转/min离心5min，取上清液，向上清液中加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提一次，氯仿:异戊醇的体积比为24:1，5000转/min离心5min，取上清液；向上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇沉淀，然后70％乙醇洗涤沉淀两次，用TBE溶解；紫外分光光度计测定样品DNA的OD260、OD280值，确定其浓度和纯度，4℃保存备用；共17个样品；
2)PCR扩增：以步骤1)得到的DNA基因组为模板进行PCR扩增，用于扩增的特异引物命名为L10985与H11563，得到PCR扩增产物；其中，L10985:5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’；
H11563:5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’；其中，PCR反应体系总体积为50μL，包括DNA基因组50mg、10×Buffer 5μL、dNTP 0.2mmol/L、特异引物L10985、H11563各0.2μmol/L、Taq plus DNA聚合酶2U和氯化镁1.5mmol/L；PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、50℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环后，在72℃延伸7min；
3)产物鉴定：将步骤2)得到的PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，其pH为8.0，电泳时间为1.2h，加入溴化乙锭至终浓度500ng/mL染色，然后在凝胶成像***下观察并拍照记录。
实施例3
一种日本对虾分子标记方法，所述日本对虾分子标记方法包括以下步骤：
1)提取DNA基因组：取日本对虾组织200mg，剪碎后放入1.5mL离心管中，加入500μl缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；50mmol/L EDTA，pH 8.0)，混匀后加入终浓度为1％的SDS和200μg/ml的蛋白酶K，55℃水浴3h；12000转/min离心5min，取上清；向上清液中加入与上清液等体积的Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇混合液抽提一次，Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1，然后12000转/min离心5min，取上清液，向上清液中加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提一次，氯仿:异戊醇的体积比为24:1，5000转/min离心5min，取上清液；向上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇沉淀，然后70％乙醇洗涤沉淀两次，用TBE溶解；紫外分光光度计测定样品DNA的OD260、OD280值，确定其浓度和纯度，4℃保存备用；共17个样品；
2)PCR扩增：以步骤1)得到的DNA基因组为模板进行PCR扩增，用于扩增的特异引物命名为L10985与H11563，得到PCR扩增产物；其中，L10985:5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’；
H11563:5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’；其中，PCR反应体系总体积为50μL，包括DNA基因组80mg、10×Buffer 8μL、dNTP 0.3mmol/L、特异引物L10985、H11563各0.3μmol/L、Taq plus DNA聚合酶3U、氯化镁1.6mmol/L；PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s和50℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环后，在72℃延伸7min；
3)产物鉴定：将步骤2)得到的PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，其pH为8.0，电泳时间为1h，加入溴化乙锭至终浓度500ng/mL染色，然后在凝胶成像***下观察并拍照记录。
将实施例1-3的PCR产物送往上海生工生物工程技术有限公司，纯化后在ABI 3730在测序仪上进行测序。获得的序列经过人工校正后通过NCBI中BLAST同源检索后确认所得的基因片段，并从GenBank数据库中下载其他对虾物种的cytb序列以用于******的分析。利用MEGA3.1软件分析DNA序列和氨基酸序列的变异位点，计算碱基组成比例和遗传距离并构建***进化树；利用DnaSP4.0软件进行多态性指标、群体分化指数及基因流的计算；利用DAMBE软件计算核苷酸变异指数。
结果如下： 
日本对虾4个群体的遗传多样性参数如表1所示，福建群体具有最高的遗传多样性水平，其单倍型多样性及核苷酸多样性分别为1.0和0.0137，遗传多样性水平最低的浙江群体其单倍 型多样性及核苷酸多样性分别为0.874和0.0045，综合各项参数可知，日本对虾4个地理群体遗传多样性水平从高到低分别是福建群体、广东群体、台湾群体和浙江群体。所测序列经过人工校正后共发现52个变异位点，占分析位点总数的9.42％，各变异位点的核苷酸变异指数为0.014-0.198，在变异位点中包括38个简约信息位点。这些变异位点中包括39个转换位点和14个颠换位点(表2)，没有***及缺失位点，其中多样性水平最高的福建群体所分析序列的转换和颠换数分别达到了30个和12个。
利用MEGA软件计算了日本对虾cytb基因中的同义替代率(dS)和非同义替代率(dN)，全部序列的dN/dS为0.130(表3)。采用单尾的Z检验进行负选择(dN<dS)检验，由于同义替换明显高于非同义替换，检验得到的P<0.01，达到了极显著水平，说明日本对虾在进化过程中mtDNA-cytb基因受到负选择的影响。
表1 日本对虾4个群体的遗传多样性参数
利用MEGA软件计算了群体间的遗传距离并统计了群体间的变异位点数，从中可知，4个群体间的遗传距离在0.004-0.012之间，其中福建群体与广东群体遗传距离最大为0.012，台湾群体与浙江群体的遗传距离最小为0.005，所有个体间的平均遗传距离为0.009。并计算了各群体内个体间的遗传距离，广东、台湾、福建和浙江群体内的遗传距离分别为0.008、0.005、0.014和0.005，这和表1中各群体的遗传多样性水平具有类似的结论。表2中列出的群体间变异位点数显示福建群体与其他群体间存在较多的变异位点，存在较大的遗传分化。
从计算得到的4个群体间的遗传分化系数及基因流数据可以看出(表3)，台湾群体与浙江群体间存在轻度遗传分化(Fst<0.05)，台湾群体与福建群体、浙江群体与福建群体之间存在高度的遗传分化(Fst>0.15)，其他群体之间均存在着中度的遗传分化(0.05<Fst<0.15)。平均遗传分化系数为0.1004，表明约10％的遗传分化来自于群体之间，约90％的遗传分化来自于群体内。基因流(Nm)越大表明遗传分化程度越低，因此同样说明各群体之间的遗传分化水平。
表2 日本对虾4群体间的相对遗传距离(对角线下)和变异位点数(对角线下，共有变异位点/总变异位点) 
群体stocks 广东 台湾 福建 浙江
广东   4/22 11/44 6/28
 
台湾 0.007   10/45 7/27
福建 0.012 0.011   15/48
浙江 0.007 0.005 0.011  
表3 日本对虾4群体间的群体遗传分化系数Fst(对角线下)和基因流Nm(对角线上) 
群体stocks 广东 台湾 福建 浙江
广东   2.90 1.93 4.55
台湾 0.0794   1.11 13.15
福建 0.1143 0.1833   1.37
浙江 0.0524 0.0185 0.1545  
参照分子标记得到的各群体的遗传多样性水平，利用4个日本对虾繁育的基础群体设计进行了8个组合的杂交实验，从2007年3月到2007年6月进行了多次群体交配实验，最终获得了日本对虾群体杂交的成功，在2007年5月份获得杂交虾苗865万尾。并在2007年5月进行第二次大规模杂交实验，同时并行进了8个杂交组合的比较试验。
2007年6月28日在舟山市绿源水产养殖有限公司(定海长白)放养不同组合杂交对虾苗及对照原种对虾苗于8只试验池，试验面积250×8m2，放养密度1.6万尾/池。2007年9月12日对8只池起捕并抽样检测50尾/池，基本情况见表4。其中7#池(G♀×T♂)杂交日本对虾平均身体全长14.6cm，平均体重12.4g，平均亩产354.3kg；8#池(T♀×G♂)杂交日本对虾平均身体全长16.2cm，平均体重14.2g，平均亩产374.1kg，经对比发现7#、8#池杂交组合生长速度、单位产量均优于其它组合，虾体型匀称、大小均匀。
表4 不同杂交组合养殖试验基本情况表
注：G广东，F福建，T台湾。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  浙江省海洋开发研究院
 
<120>  一种日本对虾分子标记方法及应用
 
<130>  ZH10013
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  1
tgaggaggtt tcgcagta                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  2
agatgagggt gagtgggt                                                   18
 
 

Claims (5)

1.一种日本对虾分子标记方法，其特征在于，所述日本对虾分子标记方法包括以下步骤：
1)提取DNA基因组：取日本对虾组织150-200mg，剪碎后按照苯酚氯仿提取法提取DNA基因组，在0-4℃下保存备用；
2)PCR扩增：以步骤1)得到的DNA基因组为模板进行PCR扩增，用于扩增的特异引物命名为L10985与H11563，得到PCR扩增产物；其中，L10985:5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’；
H11563:5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’；
3)产物鉴定：将步骤2)得到的PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像***下观察并拍照记录。
2.根据权利要求1所述的一种日本对虾分子标记方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应体系总体积为50μL，包括DNA基因组50-100mg、10×Buffer 5-10μL、dNTP 0.2-0.3mmol/L、特异引物L10985、H11563各0.2-0.4μmol/L、Taq plus DNA聚合酶2-4U和氯化镁1.5-1.8mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种日本对虾分子标记方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、50℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环后，在72℃延伸7min。
4.根据权利要求1所述的一种日本对虾分子标记方法，其特征在于，PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，其pH为8.0，电泳时间为1-1.5h，加入溴化乙锭至终浓度500ng/mL染色，然后在凝胶成像***下观察并拍照记录。
5.一种如权利要求1所述的一种日本对虾分子标记的应用，其特征在于，所述应用为筛选日本对虾种质资源多样性分析、遗传多样性分析、家系鉴定、分子群体遗传学研究、遗传图谱构建、重要经济性状定位、功能基因研究与辅助日本对虾分子遗传育种或养殖。
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