CN105002238A

CN105002238A - 一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法

Info

Publication number: CN105002238A
Application number: CN201510448169.8A
Authority: CN
Inventors: 李晓凤; 唐诗潮; 赵光磊; 吴晖; 余以刚; 赖学能; 赖富饶
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2015-10-28

Abstract

本发明公开了一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法。该方法步骤如下：在10mL带塞三角瓶中分别加入有机溶剂、柚皮苷、酰化底物和施氏假单胞菌细胞催化剂，将其混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应。在本研究所确定的最佳反应条件下，施氏假单胞菌细胞促柚皮苷丙酰化反应最大产率为70.8%。反应条件对施氏假单胞菌细胞在柚皮苷酰化反应中的区域选择性影响不大，6’’-区域选择性保持在99%以上。

Description

一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法

技术领域

本发明属于生物催化及生物医药合成与控制领域，具体涉及一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法。

背景技术

黄酮类化合物是两个苯环通过三个碳原子相互连接而形成的一系列重要的多酚类化合物，广泛存在于几乎所有的植物,尤其是蔬菜和水果；在医药、食品和化妆品上有很大的应用价值。黄酮有多种生物活性包括抗氧化活性,抗炎,抗癌的,抗菌,抗过敏和抗病毒等，然而,由于其多羟基结构的特点，大部分黄酮生物活性受限于其低脂溶性或水溶性。位于苯环或配糖体骨架上的羟基对黄酮的生物和化学活性有重要的影响。黄酮的酯化被认为是一种很有前景的方法，能用于提高黄酮的溶解度,从而使黄酮展示出更多的生理活性。已有研究表明,有选择地修饰黄酮类化合物结构不仅可以提高物理化学属性,如,热稳定性和脂溶性；而且能增强其生物活性,如抗氧化活性、抗菌活性、细胞渗透能力、减肥和降血脂功能。

柚皮苷是黄酮苷中的一种，在医药上具有降低胆固醇，抗炎止血等功效，也可以作为抗氧化剂添加到食品中。柚皮苷有8个羟基，分布在苯环或者糖环上。环上的羟基对其活性有重要的影响，因此选择性的对柚皮苷的羟基进行酯化具有重要的意义，即可以保持其活性又可以提高其脂溶性来增加其他方面的活性。

发明内容

本发明利用传统的化学方法通常难以对特定的羟基进行保护，本发明目的在于开发一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法。施氏假单胞菌细胞促柚皮苷水合物酰化反应的最适有机溶剂、酰基供体、酰基供体与柚皮苷水合物摩尔比、初始水含量、施氏假单胞菌细胞催化剂、反应温度和振荡速度分别为叔戊醇、丙酸乙烯酯（VP）、20:1、0%（v/v）、40mg/mL、40℃和180rpm，反应24h后产率可达到70.8%。反应条件对施氏假单胞菌细胞在柚皮苷丙酰化反应中的区域选择性影响不大，6′′-区域选择性保持在99%以上。

该方法催化剂制备简单易操作，反应条件温和，产率高，初速度快，羟基保护区域选择性可控制，克服了传统化学方法的选择性低而导致底物利用率低，产物纯度低，易生成副产物等缺点。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，包括以下步骤：

1）制作施氏假单胞菌细胞催化剂：将细菌种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，接种量为0.5%~20%（v/v），培养条件为30℃ ~50℃，培养时间为12~144h ；离心后收集菌体，蒸馏水洗涤两次，经真空冷冻干燥12h-36h，收获菌体干粉，即为细菌细胞催化剂；

2）在带塞三角瓶中加入有机溶剂；

3）加入黄酮类化合物；

4）加入酰基供体；

5）在有机溶剂反应体系中加入0~160μL水；

6）加入施氏假单胞菌细胞催化剂使整个反应体系最终质量为20~160mg，混合均匀；

7）置于水浴恒温振荡器反应，速度为100~260rpm。

进一步地，可适当改变步骤2）所述带塞三角瓶的体积来放大或缩小反应体系体积；

步骤2）所述带塞三角瓶体积为10mL；所述有机溶剂是单一种类有机溶剂或混合有机溶剂，其中单一种类有机溶剂是叔丁醇或叔戊醇，混合有机溶剂是乙腈-叔戊醇、吡啶-叔戊醇等；有机溶剂的体积为2mL；

步骤3）所述黄酮类化合物为柚皮苷或秦皮甲水合物，其用量为10mmol-90mmol；

步骤4）所述酰基供体为用量为60 ~2400 mmol的丙酸乙烯酯；

步骤5）所使用水为超纯水或双蒸水；

步骤7）所述反应温度控制方法为水浴摇床恒温震荡器水浴或恒温摇瓶柜气浴等，反应温度为25℃~60℃。

进一步优化地，所述方法包括以下步骤：

1）制作施氏假单胞菌细胞催化剂；

2）在10mL带塞三角瓶中加入2mL有机溶剂，可为纯有机溶剂或混合有机溶剂；

3）加入柚皮苷水合物；

4）加入酰基供体丙酸乙烯酯，用量分别为60 ~2400 mmol；

5）在2mL叔戊醇反应体系中加入0-160μL水；

6）在2mL 叔戊醇反应体系中加入施氏假单胞菌细胞催化剂使整个反应体系最终质量为20~160mg；

7）柚皮苷羟基保护时反应温度为25℃~60℃，于水浴恒温振荡器反应；

8）在水浴恒温振荡器振荡反应，震荡速度为100~260rpm。

步骤2）中反应所使用的三角瓶体积不限于10mL，反应体系可适当放大或缩小；有机溶剂是单一种类有机溶剂如吡啶或是混合有机溶剂，如乙腈-叔戊醇、叔丁醇-吡啶、叔戊醇-吡啶；最佳混合有机溶剂为叔戊醇，但不限于此溶剂；

步骤5）中所使用水为超纯水或双蒸水；

步骤8）恒温震荡器不限于水浴摇床，如恒温摇瓶柜等气浴条件也可。

本发明与现有的技术相比具有如下的优点：

1、利用生物催化剂施氏假单胞菌细胞作为催化剂，较之化学催化剂反应条件温和、环境友好；较之酶催化剂成本低。

2、该方法中催化剂制备简单易操作，酰基供体丙酸乙烯酯常用易购买，反应初速度快，产率高，区域选择性高，克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低，产物纯度低，易生成副产物等缺点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1

在10mL带塞三角瓶中均加入2mL吡啶、60 mmol柚皮苷水合物、1200mmol丙酸乙烯酯和80mg 施氏假单胞菌细胞催化剂，混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应（40℃、180r/min），定时取样20μL，用60% （体积分数，下同）甲醇-水混合溶液稀释50倍，混合均匀后离心（15,000r/min）15min，自动进样器取上清液20μL，供高效液相色谱分析。在纯叔戊醇中施氏假单胞菌细胞可以催化柚皮苷发生酰化反应，24h后产率分别为70.8%，6’’区域选择性分别为99.5%。

菌种培养方法：斜面培养基，营养肉汤培养基；种子液培养24h后接种到发酵培养基中，接种量为2%（v/v）, 180r/m，30℃，培养48h。种子液培养基（w/v）为1%葡萄糖，1%牛肉膏，1%蛋白胨，0.5% K₂HPO₄, 0.02% MgSO₄·7H₂O，0.5%NaCl，pH 7.0±0.1；发酵培养基（w/v）为 0.5%大豆油，0.1% 酵母浸膏，0.5% (NH₄)₂SO₄，0.1% K₂HPO₄, 0.02% MgSO₄·7H₂O。

实施例2

在3个10mL带塞三角瓶中把60 mmol柚皮苷水化合物、1200mmol丙酸乙烯酯分别和2mL有机溶剂（四氢呋喃、叔丁醇、叔戊醇）混合，加入80mg 施氏假单胞菌细胞催化剂，混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应（40℃、180r/min），定时取样10μL，用40% 甲醇-水混合溶液稀释100倍，混合均匀后离心（15,000r/min）15min，自动进样器取上清液20μL，供高效液相色谱分析。反应结果如表1。

表1 不同有机溶剂对施氏假单胞菌细胞促柚皮苷丙酰化反应的影响

	logP	转化率/%	区域选择性/%
				四氢呋喃	0.49	21.7±0.12	99.5±0.04
叔丁醇	O.80	61.8±0.20	99.3±0.03
				异丙醇	1.9	10.4±0.02	99.3±0.02

表中，反应条件：2mL有机溶剂，80mg施氏假单胞菌细胞催化剂，60 mmol 柚皮苷水合物，1200 mmol丙酸乙烯酯，40℃，180 rpm，反应24h。

实施例3

在8个10mL带塞三角瓶中均加入2mL叔戊醇，再向8个带塞三角瓶中分别加入不同用量的柚皮苷（10mmol 、20mmol 、40mmol、50mmol、60mmol、70mmol、80mmol、90mmol），最后向每个带塞三角瓶中均加入1200mmol丙酸乙烯酯和80mg施氏假单胞菌细胞催化剂，混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应（40℃、180r/min），定时取样20μL，用60%甲醇-水混合溶液稀释50倍，混合均匀后离心（15,000 r/min）15min，自动进样器取上清液20μL，供高效液相色谱分析。反应结果表明，当柚皮苷浓度较低时（5~25mmol/L），增加底物的量，反应速度显著增加；继续增大柚皮苷的浓度，反应速度增加趋于缓慢；在实验考察的浓度范围内，反应速度尚未催于恒定值，可推知40 mg/mL 的全细胞催化剂投入量在反应体系中仍未被底物饱和。然而，随着柚皮苷浓度的增大（>30mmol/L），反应产率呈缓慢下降趋势，区域选择性变化维持在99%。

实施例4

在8个10mL带塞三角瓶中均加入2mL 50%（v/v）异辛烷-吡啶混合有机溶剂、60mmol柚皮苷和1200mmol/L丙酸乙烯酯，再向8个带塞三角瓶中分别加入不同质量施氏假单胞菌细胞催化剂（10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg），混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应（30℃、140r/min），定时取样20μl，用60% 甲醇-水混合溶液稀释50倍，混合均匀后离心（15,000 r/min）15min，自动进样器取上清液20μL，供高效液相色谱分析。反应结果表明，在柚皮苷的丙酰化反应中，施氏假单胞菌细胞催化剂用量大于20 mg/mL（以50%（v/v）异辛烷-吡啶作为溶剂）时产率趋于平稳，且在用量为20 mg/mL时产率达最大值65%；在丙酰化反应中，施氏假单胞菌细胞催化剂用量大于40 mg/mL时，继续增大施氏假单胞菌细胞催化剂用量，产率几乎不再提高，最大值为85.6%；而区域选择性变化不大，始终在99%以上。

实施例5

在9个10mL带塞三角瓶中均加入2mL叔戊醇和60mmol柚皮苷，再向9个带塞三角瓶中分别加入不同摩尔浓度丙酸乙烯酯（60 mmol、300 mmol、600mmol、900 mmol、1200 mmol、1500 mmol、1800 mmol、2100 mmol、2400 mmol），最后向每个带塞三角瓶中均加入80mg施氏假单胞菌细胞催化剂，混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应（40℃、180r/min），定时取样20μl，用40% 甲醇-水混合溶液稀释100倍，混合均匀后离心（15,000 r/min）15min，自动进样器取上清液20μl，供高效液相色谱分析。反应结果表明，全细胞促柚皮苷的丙酰化反应的初速度均随着丙酸乙烯酯与柚皮苷摩尔比（1:1-20:1）的增加而增大，再增加摩尔比，产率变化不大，但6’’-区域选择性变化不大，始终高于99％。

综合考虑，认为全细胞促柚皮苷水合物乙酰化反应中丙酸乙烯酯与柚皮苷水合物摩尔比的最佳比例为20:1。

实施例6

在9个10mL带塞三角瓶中均加入2mL叔戊醇、60mmol柚皮苷和丙酸乙烯酯1200 mmol，再向9个带塞三角瓶中分别加入不同体积的超纯水（0μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL、120μL、140μL、160μL ），最后向每个带塞三角瓶中加入 40mg施氏假单胞菌细胞催化剂，混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应（40℃、180r/min），定时取样20μL，用60% 甲醇-水混合溶液稀释50倍，混合均匀后离心（15,000 r/min）15min，自动进样器取上清液20μL，供高效液相色谱分析。反应结果表明，当加入超纯水很少时，酰化反应的初速度和产率随加入体积的增加而降低，达到一定的值后又随水分含量的增加变化不大，区域选择性基本不变，始终在99%以上，故认为反应体系中加入的超纯水的体积以0%为宜。

实施例7

在8个10mL带塞三角瓶中均加入2mL叔戊醇，0μL超纯水、60mmol柚皮苷、丙酸乙烯酯1200 mmol 和40mg施氏假单胞菌细胞催化剂，混合均匀，置于不同温度（25℃、30℃、35℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55℃、60℃）下水浴恒温振荡器反应（180r/min），定时取样20μL，用60% 甲醇-水混合溶液稀释50倍，混合均匀后离心（15,000 r/min）15min，自动进样器取上清液20μL，供高效液相色谱分析。反应结果表明，在25~40 ℃温度范围内，随着反应温度的升高，施氏假单胞菌全细胞促柚皮苷丙酰化反应的初速度均随之增大。然而，与初速度相比，反应的产率表现出典型的先升后降的趋势。最适温度为40℃-55℃，此时，产率在70.8%-74.3% ，而当温度高于55℃后，产率下降明显，6’’-区域选择性的影响不大，均大于99%。

Claims

1.一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制作施氏假单胞菌细胞催化剂；

2）在带塞三角瓶中加入有机溶剂；

3）加入黄酮类化合物；

4）加入酰基供体，形成有机溶剂反应体系；

5）在有机溶剂反应体系中加入0~160μL水；

7）置于水浴恒温振荡器反应，震荡速度为100~260rpm。

2.根据权利要求1所述的一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于步骤2）所述带塞三角瓶体积为10mL。

3.根据权利要求1所述的一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于步骤2）所述有机溶剂是单一种类有机溶剂或混合有机溶剂，其中单一种类有机溶剂是叔丁醇或叔戊醇，混合有机溶剂是乙腈-叔戊醇、吡啶-叔戊醇等。

4.根据权利要求1所述的一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于步骤2）所述有机溶剂的体积为2mL。

5.根据权利要求1所述的一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于步骤3）所述黄酮类水合物为柚皮苷水合物，柚皮苷用量为10mmol-90mmol。

6.根据权利要求1所述的一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于步骤4）所述酰基供体用量为60 ~2400 mmol的丙酸乙烯酯。

7.根据权利要求1中所述的一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于步骤5）所使用水为超纯水或双蒸水。

8.根据权利要求1中所述的一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于反应温度控制方法为水浴摇床恒温震荡器水浴或恒温摇瓶柜气浴等。

9.根据权利要求1所述的一种基于施氏假单胞菌细胞催化的柚皮苷羟基保护反应方法，其特征在于步骤7）所述反应温度为25℃~60℃。