CN101709322A - 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 - Google Patents

生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101709322A
CN101709322A CN200910154901A CN200910154901A CN101709322A CN 101709322 A CN101709322 A CN 101709322A CN 200910154901 A CN200910154901 A CN 200910154901A CN 200910154901 A CN200910154901 A CN 200910154901A CN 101709322 A CN101709322 A CN 101709322A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phase system
liquid
zjuqh
ionic liquid
trochol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200910154901A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101709322B (zh
Inventor
陈启和
刘婧
傅明亮
何国庆
刘晓杰
章海锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN2009101549015A priority Critical patent/CN101709322B/zh
Publication of CN101709322A publication Critical patent/CN101709322A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101709322B publication Critical patent/CN101709322B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括：(1)黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的制备；(2)在离子液体或两相体系中加入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞进行预培养，得到预培养体系；(3)向预培养体系中加入白桦脂醇溶液，于25℃～30℃发酵培养6小时～24小时得到转化后的培养液；(4)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸；其中，所述的两相体系为离子液体与正己烷的混合溶剂或者离子液体与磷酸缓冲溶液的混合溶剂。该方法与传统方法相比，提高了产物的得率，缩短了催化反应时间，且产物分离简单，同时离子液体体系不易挥发，生物相容性好，不污染环境。

Description

生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
技术领域
本发明涉及生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法。
背景技术
生物催化是利用酶或微生物细胞催化进行某种化学反应的过程，具有专一性强、催化效率高、环境友好、操作条件温和等优点。与水相中的生物催化反应相比，非水相生物催化有其独特的优越性。但传统的有机溶剂通常会限制酶的活性和选择性，且会造成大量工业污染。
离子液体(Ionic liquids，ILs)作为新型绿色溶剂，是由有机阳离子与无机阴离子或有机阴离子构成的盐类，在室温或较低温(＜100℃)下呈液态，具有可忽略的蒸汽压、高热稳定性、高化学稳定性及对许多化合物具有良好的溶解性等特点，作为生物催化反应介质表现出许多优越性能，近年来引起广泛重视。
2000年，Cull等首次报道了离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([bmim][PF6])/水双相体系中Rhodococcus R312细胞催化1，3-二氰基苯水解生成3-氰基苯酰胺反应，并发现[bmim][PF6]对细胞的毒性远远小于甲苯等有机溶剂(Cull SG，et a1.Biotechnol Bioeng 2000，69(2)：227-233)。随后，有关离子液体中生物催化反应的报道日渐增多，大部分研究表明，酶或微生物整细胞在离子液体中具有较高的活性、选择性及稳定性(Manpreet S，et a1.J Mol Catal B：Enzym 2009，56：294-299；He JY，et al.Process Biochem2009，44：316-321)。
公开号为CN101319236A的中国专利申请中公开了一种以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在水/离子液体两相体系中，以潜手性酮为底物还原制备相应手性醇，提高了反应产物的转化率、浓度和对映体过量值，加快了反应的进程。
白桦脂酸(betulinic acid)是非常有价值的天然化合物，它具有抗疟性、抗炎性和抗肿瘤活性，尤其在抗艾滋病活性及抗各种肿瘤细胞系细胞毒性方面可与一些临床用药相比拟，被视为最有潜力的新型药物制剂。目前，白桦脂酸的获得多以自然界中丰富的白桦脂醇为前体，经过化学方法合成，虽然产率较高，但普遍存在操作复杂、污染大、成本高、安全性低等问题，限制了其在生产实践中的应用。微生物转化通过微生物整体细胞中复杂的特异性催化酶系对天然活性成分进行结构修饰，广泛应用于药物前体化合物的转化、生物催化的不对称合成、新药开发、药物代谢体外模型预测等领域。探索以白桦脂醇为前体通过微生物催化途径合成白桦脂酸已成为目前研究重点。
公开号为CN101457250A的中国专利申请中已经筛选获得一株黄绿密环菌(Armillaria luteo-virens Sacc)ZJUQH，在水相体系中能催化白桦脂醇合成白桦脂酸，并利用响应面方法进一步优化了发酵条件。由于有机相的底物溶液在水相体系中溶解度不高，不但影响酶对底物的催化作用，而且对微生物细胞存在一定毒害，导致前期实验获得的菌株和发酵条件催化白桦脂醇合成白桦脂酸的产率仍较低，且转化反应时间很长。为此，对生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法还有待进一步的改进，以期提高白桦脂酸的转化得率。
发明内容
本发明提供了一种生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，利用绿色溶剂离子液体或者离子液体与其它溶剂组成的两相体系替代传统的水相体系作为黄绿密环菌ZJUQH催化白桦脂醇合成白桦脂酸的反应介质，将白桦脂醇生物转化成白桦脂酸，具有操作简单、产物易于分离、转化条件温和、转化效率高、转化时间短、安全性高的特点。
本发明所使用的黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc.)ZJUQHCGMCC No.1884，于2006年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1884，其获取、培养方法和形态在中国发明专利CN200610155189.7中有详细描述。
一种生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括以下步骤：
(1)将黄绿蜜环菌ZJUQH经过活化和种子培养后得到种子培养液，再经冷冻离心得到黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞；
(2)在离子液体或含离子液体的两相体系中加入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞进行预培养，得到预培养体系；
(3)向预培养体系中加入白桦脂醇溶液，于25℃～30℃发酵培养6小时～24小时得到转化后的培养液；
(4)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸；
其中，所述的白桦脂醇用量以每升离子液体或含离子液体的两相体系计为15mg～150mg。
离子液体作为生物催化反应的溶剂，应用模式通常有：纯溶剂体系、作为水的共溶剂、与其他有机溶剂组成两相体系或多相体系。针对具体的生物催化反应需要选择合适的离子液体应用模式，本发明根据白桦脂醇生物转化得到白桦脂酸的转化反应的特点，选择合适的反应体系，来提高转化效率，缩短转化时间。
所述的含离子液体的两相体系为离子液体与正己烷的混合溶剂或者离子液体与磷酸缓冲溶液的混合溶剂，优选离子液体与正己烷的混合溶剂。
所述的磷酸缓冲溶液采用本领域常规的配制方法进行配制即可。
两相体系中合适的离子液体浓度能增强酶的活性和选择性，因此，所述的含离子液体的两相体系中离子液体的体积百分浓度优选为3％～98％，进一步优选为40％～60％，最优选50％。
氧化还原酶的催化通常需要辅酶，微生物细胞中含有可催化氧化还原反应的多种脱氢酶和辅酶，用微生物整细胞作为生物催化剂可省去酶的分离纯化步骤，同时不需要添加辅酶再生***。然而，微生物细胞中的辅酶含量有限，添加共基质有助于辅酶的回收利用。因此，可在所述的两相体系中添加共基质，每升离子液体或含离子液体的两相体系中共基质的添加量为0.05mol～0.1mol。
其中，所述的共基质选自葡萄糖、乙醇、正丁醇、甘油、蔗糖、异丙醇中的一种。
所述的离子液体选自1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([OMIM]PF6)中的一种。可直接采用市售产品，如上海成捷化学有限公司生产的纯度≥99％的离子液体。
步骤(3)中，所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，即溶剂为二甲基亚砜，其中的白桦脂醇浓度优选为7.5mg/mL；白桦脂醇用量优选以每升离子液体或含离子液体的两相体系计为75mg。
所述的白桦脂醇可选用根据公开号为CN101328201A中国专利申请中记载的从白桦树皮中提取得到白桦脂醇的方法而自行提取的白桦脂醇，纯度一般为90％，相比购买高***桦脂醇标准样品作为催化底物更具现实意义，不但可以降低生产成本，还可以实现资源的综合利用。
步骤(3)中，所述的发酵培养温度优选为28℃，发酵培养时间优选为18小时，一般可在转速180～220r/min(优选200r/min)的摇床上进行培养。
步骤(1)中，活化所用的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其原料质量百分比组成为：马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂3％；所述的活化温度为25℃～30℃，活化时间为4天～6天。
种子培养所用的种子培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，其原料质量百分比组成为：马铃薯20％，葡萄糖2％，余量为水，pH自然；所述的种子培养温度为25℃～30℃，培养时间为3天，一般在转速为120r/min的摇床中进行培养。
将活化后的黄绿蜜环菌ZJUQH制成黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液接入种子培养基，黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液中孢子浓度为1×106个/毫升～1×107个/毫升，种子培养基与接入的黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为10～30。
步骤(2)中，所述的黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升离子液体或含离子液体的两相体系计为50g～400g，优选以每升离子液体或含离子液体的两相体系计为300g；所述的预培养条件为在25℃～30℃培养5分钟～15分钟，优选28℃培养10min，一般可在转速180～220r/min(优选200r/min)摇床上进行培养。
步骤(4)中，所述的后处理包括：将转化后的培养液进行离心处理得到上清液，调节pH至3～4，乙酸乙酯萃取后得到萃取液，经浓缩得到白桦脂酸。调节pH值时可采用通用的酸、碱，如氢氧化钠、盐酸等。
本发明方法中白桦脂醇、白桦脂酸含量同步检测方法为：步骤(4)中转化后的培养液经后处理，用甲醇定容于10ml容量瓶，采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测所得物中白桦脂醇、白桦脂酸的含量。RP-HPLC色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈/水(体积比)＝91/9；流速1.0mL/min；检测波长210.1nm；柱温25℃；进样量10μl；跑样时间30～45min。
本发明具有如下有益效果：
本发明选择离子液体或含离子液体的两相非水相体系用于微生物整细胞催化白桦脂醇合成白桦脂酸，与采用普通水相体系相比，具有以下优点：(1)离子液体或含离子液体的两相体系有利于提高转化效率和产物得率，白桦脂酸的产率可以达到12.17％以上，相比普通水相体系提高了30.58％；(2)离子液体或含离子液体的两相体系大大缩短了催化反应时间，转化时间不超过24小时；(3)离子液体或含离子液体的两相体系中产物分离简单，离子液体易于回收循环使用；(4)离子液体或含离子液体的两相体系不易挥发，生物相容性好，不污染环境，为白桦脂醇生物催化合成白桦脂酸产率的提高提供了新思路，同时为离子液体体系在白桦脂酸催化合成中的应用提供了理论依据。
附图说明
图1为本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
实施例1～8  不同两相体系中黄绿密环菌ZJUQH催化白桦脂醇合成白桦脂酸
(1)将黄绿蜜环菌ZJUQH接入灭菌过的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(其原料质量百分比组成为：马铃薯20％，葡萄糖2％和琼脂3％)，在28℃，活化4天后制成黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液，然后接入马铃薯葡萄糖液体培养基(其原料质量百分比组成为：马铃薯20％，葡萄糖2％，余量为水，pH自然)，在28℃、转速为120r/min的旋转式摇床中培养3天，得到种子培养液。黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液中孢子浓度为1×106个/毫升，马铃薯葡萄糖液体培养基与接入的黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为30。
将种子培养液经3000r/min冷冻离心30分钟，无菌水洗涤3次后除去发酵液获得黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞。
(2)具塞试管中加入5mL离子液体与磷酸缓冲液的混合溶剂或离子液体与正己烷的混合溶剂形成两相体系，两相体系中离子液体的体积浓度为50％，无菌条件下加入上述黄绿密环菌ZJUQH湿细胞，黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升两相体系计为200g，于28℃，转速200r/min旋转式摇床上预培养10min，得到预培养体系。
(3)向上述预培养体系中加入0.1mL浓度为7.5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，继续于28℃，转速200rpm旋转式摇床上发酵培养18h得到转化后的培养液。
(4)将转化后的培养液经离心、调pH至3、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸。
以[BMIM]BF4、[BMIM]PF6、[EMIM]BF4、[OMIM]PF6四种离子液体和磷酸缓冲液、正己烷两种溶剂分别组成两相体系进行白桦脂酸的催化合成，结果见表1：
表1
实施例 两相反应体系   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  1   [BMIM]BF4/磷酸缓冲液   93.64   2.81
  2   [BMIM]PF6/磷酸缓冲液   66.36   2.71
  3   [EMIM]BF4/磷酸缓冲液   76.10   0.99
  4   [OMIM]PF6/磷酸缓冲液   43.42   4.05
实施例 两相反应体系   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  5   [BMIM]BF4/正己烷   68.67   2.86
  6   [BMIM]PF6/正己烷   46.23   4.77
  7   [EMIM]BF4/正己烷   48.20   4.81
  8   [OMIM]PF6/正己烷   44.95   4.60
由表1可以看出，[EMIM]BF4/正己烷体系中黄绿密环菌ZJUQH催化效果较好，合成白桦脂酸的产率相对较高。
实施例9～14  不同离子液体浓度的两相体系中黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂酸
(1)黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的制备同实施例1。
(2)具塞试管中加入5mL离子液体或离子液体与正己烷的混合溶剂形成两相体系，两相体系中离子液体的体积浓度为3％～100％，无菌条件下加入上述黄绿密环菌ZJUQH湿细胞，黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升两相体系计为200g，于28℃，转速200r/min旋转式摇床上预培养10min，得到预培养体系。
(3)向上述预培养体系中加入0.05mL浓度为7.5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，继续于28℃，转速200rpm旋转式摇床上发酵培养18h得到转化后的培养液。
(4)将转化后的培养液经离心、调pH至4、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸，结果见表2：
表2
  实施例   离子液体[EMIM]BF4体积浓度(％)   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  9   3   63.79   3.77
  10   10   86.02   4.16
  11   30   58.31   5.57
  12   50   71.76   8.39
  13   80   81.54   4.32
  14   100   54.09   6.84
由表2可以看出，离子液体[EMIM]BF4/正己烷两相体系中，黄绿密环菌ZJUQH转化白桦脂醇的反应，在离子液体[EMIM]BF4浓度为50％时白桦脂酸产率最高。
实施例15～21  不同共基质中黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂酸
(1)黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的制备同实施例1。
(2)具塞试管中加入5mL离子液体[EMIM]BF4与正己烷的混合溶剂形成两相体系，两相体系中离子液体的体积浓度为50％，同时在两相体系中添加共基质，每升两相体系中共基质的添加量为0.1mol。无菌条件下加入上述黄绿密环菌ZJUQH湿细胞，黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升两相体系计为200g，于28℃，转速200r/min旋转式摇床上预培养10min，得到预培养体系。
(3)向上述预培养体系中加入0.05mL浓度为7.5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，继续于28℃，转速200rpm旋转式摇床上发酵培养18h得到转化后的培养液。
(4)将转化后的培养液经离心、调pH至3.5、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸。
共基质选取葡萄糖、乙醇、正丁醇、甘油、蔗糖或异丙醇，与未添加共基质的反应体系进行相比，实验结果见表3。
表3
实施例 共基质   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  15   未添加   71.76   8.39
  16   葡萄糖   63.90   6.41
  17   乙醇   93.66   6.57
  18   正丁醇   54.13   14.21
  19   甘油   62.29   5.22
  20   蔗糖   56.84   8.31
  21   异丙醇   62.14   8.60
由表3可以看出，离子液体[EMIM]BF4/正己烷两相体系中，添加0.1mol/L正丁醇作为共基质能有效提高黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂酸的能力。
实施例22～24  不同底物浓度对黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂酸反应的影响
(1)黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的制备同实施例1。
(2)具塞试管中加入5mL离子液体[EMIM]BF4与正己烷的混合溶剂形成两相体系，两相体系中离子液体的体积浓度为50％，同时在两相体系中添加正丁醇，每升两相体系中正丁醇的添加量为0.1mol。无菌条件下加入上述黄绿密环菌ZJUQH湿细胞，黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升两相体系计为200g，于28℃，转速200r/min旋转式摇床上预培养10min，得到预培养体系。
(3)向上述预培养体系中分别加入0.01mL、0.05mL、0.1mL浓度为7.5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，继续于28℃，转速200rpm旋转式摇床上发酵培养18h得到转化后的培养液。
(4)将转化后的培养液经离心、调pH至3.5、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸，结果见表4。
表4
实施例   底物用量(mL)   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  22   0.01   85.81   6.16
  23   0.05   59.02   11.04
  24   0.1   48.19   4.81
由表4可以看出，离子液体[EMIM]BF4/正己烷两相体系中，当添加的白桦脂醇底物溶液为0.05mL时，最有利于白桦脂酸的催化合成。
实施例25～29不同湿细胞浓度对黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂酸反应的影响
(1)黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的制备同实施例1。
(2)具塞试管中加入5mL离子液体[EMIM]BF4与正己烷的混合溶剂形成两相体系，两相体系中离子液体的体积浓度为50％，同时在两相体系中添加正丁醇，每升两相体系中正丁醇的添加量为0.1mol。无菌条件下加入上述黄绿密环菌ZJUQH湿细胞，黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升两相体系计分别为50g、100g、200g、300g、400g，于28℃，转速200r/min旋转式摇床上预培养10min，得到预培养体系。
(3)向上述预培养体系中加入0.05mL浓度为7.5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，继续于28℃，转速200rpm旋转式摇床上发酵培养18h得到转化后的培养液。
(4)将转化后的培养液经离心、调pH至3.5、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸，结果见表5。
表5
实施例   湿细胞用量(g/L)   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  25   50   71.99   4.74
实施例   湿细胞用量(g/L)   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  26   100   67.57   9.77
  27   200   59.02   11.04
  28   300   67.35   12.17
  29   400   72.19   8.87
由表5可以看出，离子液体[EMIM]BF4/正己烷两相体系中，当添加的黄绿密环菌ZJUQH湿细胞量为300g/L时，白桦脂酸的产率最高。
实施例30～33  黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂酸反应的转化时间过程
(1)黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的制备同实施例1。
(2)具塞试管中加入5mL离子液体[EMIM]BF4与正己烷的混合溶剂形成两相体系，两相体系中离子液体的体积浓度为50％，同时在两相体系中添加正丁醇，每升两相体系中正丁醇的添加量为0.1mol。无菌条件下加入上述黄绿密环菌ZJUQH湿细胞，黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升两相体系计为200g，于28℃，转速200r/min旋转式摇床上预培养10min，得到预培养体系。
(3)向上述预培养体系中加0.05mL浓度为7.5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，继续于28℃，转速200rpm旋转式摇床上发酵培养6～24h，得到转化后的培养液，每隔6h取一次样。
(4)将转化后的培养液经离心、调pH至3.5、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸，结果见表6。
表6
实施例   转化时间(h)   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  30   6   63.71   3.75
  31   12   68.54   5.87
  32   18   59.02   11.04
  33   24   57.39   4.55
由表6可以看出，离子液体[EMIM]BF4/正己烷两相体系中，黄绿密环菌ZJUQH催化转化白桦脂醇18h可以获得较高的白桦脂酸产率。
实施例34  两相体系中黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂酸
(1)黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的制备同实施例1。
(2)具塞试管中加入5mL离子液体[EMIM]BF4与正己烷的混合溶剂形成两相体系，两相体系中离子液体的体积浓度为50％，同时在两相体系中添加正丁醇，每升两相体系中正丁醇的添加量为0.1mol。无菌条件下加入上述黄绿密环菌ZJUQH湿细胞，黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升两相体系计为300g，于28℃，转速200r/min旋转式摇床上预培养10min，得到预培养体系。
(3)向上述预培养体系中加0.05mL浓度为7.5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，继续于28℃，转速200rpm旋转式摇床上发酵培养18h得到转化后的培养液。
(4)将转化后的培养液经离心、调pH至3.5、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸，结果见表7。
对比例1水相体系中黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂酸
(1)黄绿蜜环菌ZJUQH的活化同实施例1，将活化后的黄绿蜜环菌ZJUQH制得孢子悬浮液接入30mL马铃薯液体培养基(马铃薯质量浓度20％，pH5.0，吐温80质量浓度0.57％，余量为水)，置于温度28℃，转速120r/min旋转式摇床上培养3天，获得种子培养液。
(2)无菌条件下向上述种子培养液中加入浓度为7.5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，白桦脂醇的二甲基亚砜溶液的用量以每升种子培养液计为15mL，继续于28℃，转速120r/min旋转式摇床上发酵培养3天得到转化后的培养液。
(3)将转化后的培养液经离心、调pH至3.5、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸，结果见表7。
表7
反应体系   白桦脂醇转化率(％)   白桦脂酸产率(％)
  实施例34   [EMIM]BF4/正己烷体系   67.35   12.17
  对比例1   水相体系   66.63   9.32
由表7可以看出，与普通水相体系相比，离子液体[EMIM]BF4/正己烷两相体系更有利于黄绿密环菌ZJUQH催化合成白桦脂醇。

Claims (10)

1.一种生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括以下步骤：
(1)将黄绿蜜环菌ZJUQH经过活化和种子培养后得到种子培养液，再经冷冻离心得到黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞；
(2)在离子液体或含有离子液体的两相体系中加入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞进行预培养，得到预培养体系；
(3)向预培养体系中加入白桦脂醇溶液，于25℃～30℃发酵培养6小时～24小时得到转化后的培养液；
(4)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸；
其中，所述的白桦脂醇用量以每升离子液体或含有离子液体的两相体系计为15mg～150mg；
所述的含有离子液体的两相体系为离子液体与正己烷的混合溶剂或者离子液体与磷酸缓冲溶液的混合溶剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的两相体系中离子液体的体积百分浓度为3％～98％。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的两相体系中离子液体的体积百分浓度为40％～60％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的离子液体或两相体系中添加有共基质，每升离子液体或两相体系中共基质的添加量为0.05mol～0.1mol；
其中，所述的共基质选自葡萄糖、乙醇、正丁醇、甘油、蔗糖、异丙醇中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的离子液体选自1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中的一种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，其中的白桦脂醇的浓度为7.5mg/mL；白桦脂醇用量以每升离子液体或两相体系计为75mg。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的发酵培养温度为28℃，发酵培养时间为18小时。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，活化所用的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；种子培养所用的种子培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基；所述的活化温度为25℃～30℃，活化时间为4天～6天；所述的种子培养温度为25℃～30℃，培养时间为3天。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升离子液体或两相体系计为50g～400g；所述的预培养条件为在25℃～30℃培养5分钟～15分钟。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的后处理包括：将转化后的培养液进行离心处理得到上清液，调节pH至3～4，乙酸乙酯萃取后得到萃取液，经浓缩得到白桦脂酸。
CN2009101549015A 2009-11-26 2009-11-26 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 Expired - Fee Related CN101709322B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009101549015A CN101709322B (zh) 2009-11-26 2009-11-26 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009101549015A CN101709322B (zh) 2009-11-26 2009-11-26 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101709322A true CN101709322A (zh) 2010-05-19
CN101709322B CN101709322B (zh) 2012-06-27

Family

ID=42402127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009101549015A Expired - Fee Related CN101709322B (zh) 2009-11-26 2009-11-26 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101709322B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286595A (zh) * 2011-09-07 2011-12-21 浙江大学 一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
CN104271550A (zh) * 2011-12-14 2015-01-07 葛兰素史克有限责任公司 白桦脂醇的丙烯酸酯衍生物
CN107573397A (zh) * 2017-09-13 2018-01-12 江苏耐雀生物工程技术有限公司 一种制备白桦脂酸的方法
CN109370916A (zh) * 2018-12-04 2019-02-22 昆明理工大学 一种蜜环菌老化菌种的快速活化方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1385410A (zh) * 2002-04-10 2002-12-18 中国科学院兰州化学物理研究所 一种苯直接羟化制苯酚的方法
CN1187309C (zh) * 2002-11-07 2005-02-02 华东师范大学 离子液体[Hmim]+BF4－中酯化的方法
CN100453636C (zh) * 2006-12-13 2009-01-21 浙江大学 一种黄绿蜜环菌及其培养方法与应用
CN101319236A (zh) * 2008-07-01 2008-12-10 江南大学 水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原羰基化合物的方法
CN101457250B (zh) * 2008-12-25 2010-11-03 浙江大学 一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286595A (zh) * 2011-09-07 2011-12-21 浙江大学 一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
CN102286595B (zh) * 2011-09-07 2013-08-28 浙江大学 一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
CN104271550A (zh) * 2011-12-14 2015-01-07 葛兰素史克有限责任公司 白桦脂醇的丙烯酸酯衍生物
CN104271550B (zh) * 2011-12-14 2016-09-07 葛兰素史克有限责任公司 白桦脂醇的丙烯酸酯衍生物
CN107573397A (zh) * 2017-09-13 2018-01-12 江苏耐雀生物工程技术有限公司 一种制备白桦脂酸的方法
CN107573397B (zh) * 2017-09-13 2019-07-30 江苏耐雀生物工程技术有限公司 一种制备白桦脂酸的方法
CN109370916A (zh) * 2018-12-04 2019-02-22 昆明理工大学 一种蜜环菌老化菌种的快速活化方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101709322B (zh) 2012-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101709322B (zh) 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
CN105543293A (zh) 一种制备阿魏酸的方法
CN104130967B (zh) 一株共表达l‑乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌及其构建方法与应用
CN103045504B (zh) 微生物催化制备(2s, 3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯及菌株
CN103224963A (zh) 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法
CN101319236A (zh) 水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原羰基化合物的方法
CN108456665A (zh) 一种促进氧化葡糖杆菌合成山梨醇脱氢酶及辅酶吡咯喹啉醌的方法
CN101457250B (zh) 一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
CN106520855A (zh) 羰基还原酶生物催化生产立体互补的n‑杂环醇类化合物
CN105567584A (zh) 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（+）γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用
CN101560527B (zh) 一种无溶剂体系酶促合成阿魏酸甘油酯的方法
CN105586289B (zh) 一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(-)γ-内酰胺的假单胞菌及其筛选和应用
CN104651425A (zh) 一种生物催化合成光学活性烷基内酯的方法
CN103710405A (zh) 一种生物法制备孟鲁斯特中间体的方法
CN102994403B (zh) 一种粘红酵母及其在不对称催化制备（r）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用
CN101864370A (zh) 转化奎宁酮为r-3-奎宁醇的酵母菌株及其转化方法
CN103484505B (zh) 利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法
CN102443547B (zh) 一株粘红酵母及其制备（s）-n-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法
CN105420307A (zh) 一种制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法
CN104561136B (zh) 一种将消旋体芳基邻二醇转化为手性芳基邻二醇的方法
CN104651243B (zh) 膜醭毕赤酵母及其在手性合成(r)‑1,3‑丁二醇中的应用
CN102409068A (zh) 一种(3aS,6aR)-生物素手性内酯的制备方法
CN102952760B (zh) 一株能将奎宁酮转化为(s)-3-奎宁醇的红串红球菌及转化方法
CN102115772A (zh) 微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法
CN111100799A (zh) 一种微生物全细胞合成(r)-1,3-丁二醇的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120627

Termination date: 20151126

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee