CN105002152B - 一种催化速率提高的角蛋白酶突变体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种催化速率提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。本发明通过将角蛋白酶KerSMD的C端结构进行剪切，得到了一系列对酪蛋白底物催化速率明显提高的角蛋白酶突变体，催化速率提高了33％‑103％。尤其是突变体V355，不仅具有显著提高的催化速率和酶活，而且还具有增强的耐盐耐去垢剂能力。突变体V355的无胶原蛋白酶活性又耐盐可以利用于皮革处理行业，其催化底物速率快而且耐去垢剂，可以作为洗衣添加剂来生产应用。

Description

一种催化速率提高的角蛋白酶突变体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种催化速率提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。
背景技术
角蛋白酶(Keratinase)为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白(Prion)的降解。目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA基因。虽然角蛋白酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌中筛选出的角蛋白酶催化效率低，底物专一性不高，不能耐盐耐去垢剂，大大降低了角蛋白酶的开发和运用。本发明将来自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)BBE11-1的角蛋白酶KerSMD进行分子改造，提高角蛋白酶对底物催化速率，以及对高盐高去垢剂环境的耐受性，对角蛋白酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种催化速率提高的角蛋白酶突变体，所述突变体是将来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶KerSMD的C端结构进行剪切。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述剪切是根据角蛋白酶C端结构主要是由六个反向平行的β折叠组成，逐步去除β折叠结构可以暴露平行肽链上活性氨基酸的位点，从而采用选择环状结构中间区域进行剪切，得到各种新型突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述剪切是剪切掉第355位、第370位、第380位、第395位、第415位或者第435位氨基酸之后的C端序列，得到的突变体分别命名为V355、V370、V380、V395、V415、V435。
在本发明的一种实施方式中，所述剪切是将第355位的亮氨酸后面所有的氨基酸进行去除。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种所述突变体的制备方法，包括：
(1)根据目标突变体的蛋白序列设计引物，PCR扩增或者化学合成法得到含有编码角蛋白酶突变体的核苷酸片段；
(2)将上一步得到的突变体的核苷酸片段连接到质粒pET22b中，得到重组质粒；
(3)将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌，将重组菌发酵培养，得到的发酵上清液即含有角蛋白酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将重组菌于37℃培养至OD600＝0.6，然后降温至20℃并加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，培养72h时离心获得上清酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和HisTrap FF crude 1ml的镍柱对发酵上清液中的角蛋白酶进行纯化。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种提高角蛋白酶催化速率的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD的C端结构进行剪切；所述剪切是将角蛋白酶KerSMD的C端末尾六个β折叠序列逐步去除并选择环状结构中间区域进行剪切。
本发明还要求保护编码所述突变体的基因以及表达所述突变体的基因工程菌。
本发明也要求保护所述突变体在食品、饲料、化工、制革或者制备药物方面的应用，尤其是在制备日化洗涤产品、在皮革领域或者在饲料消化中的应用。
本发明的有益效果：
通过对角蛋白酶KerSMD的C端结构进行剪切，本发明得到了一系列对酪蛋白底物催化速率明显提高的角蛋白酶突变体，催化速率提高了33％-103％。而且突变体V355、V370的酶活分别比原始酶KerSMD提高了20.5％、41.35％，突变体V435、V380、V370、V355在5％盐浓度下的酶活也得到了提升，此外V355还具有显著增强的抗去垢剂SDS能力。本发明的角蛋白酶，尤其是V355，在洗涤、纺织、饲料消化、医药等领域具有很好的应用前景
附图说明
图1：角蛋白酶KerSMD的C端预测的二级结构序列和构建不同C端剪切突变体示意图；
图2：角蛋白酶KerSMD及其突变体的SDS-PAGE电泳图；M，蛋白分子量(kDa)，所有蛋白的分子大小接近43kDa；
图3：角蛋白酶突变体V355，野生酶KerSMD以及碱性蛋白酶对降解牛跟腱胶原I型蛋白的SDS-PAGE分析图；左边下划线的三个样品是反应上清液，中间和右边三个样品是胶原蛋白的反应沉淀蛋白；
图4：角蛋白酶KerSMD及其突变体在不同食盐浓度下的酶活比较；
图5：角蛋白酶KerSMD及其突变体在不同浓度去垢剂SDS下的酶活比较。
具体实施方式
角蛋白酶的酶活力测定原理：角蛋白酶属于蛋白酶，可以水解酪蛋白底物，释放出酪氨酸，通过酪氨酸与福林酚显色，在660nm下测定吸光度值。吸光值的大小直接与酶活力的高低成正比。
角蛋白酶酶活力测定步骤：0.1mL经适当稀释的酶液，加入0.1mL的1％(w/v)酪蛋白底物(使用前和0.1mol/L的pH9.0的Gly-NaOH缓冲液混合)，在50℃反应20min，每个反应样品中加入0.2mLTCA反应终止蛋白沉淀剂，摇匀后10,000r/min离心5min，取0.2mL上清液加入1mL的4％(w/v)Na2CO3，再加入0.2mL上海生工公司购买的福林酚试剂(预先稀释3倍)在50℃下反应15分钟。使用0.5cm的石英比色杯测定清液在660nm处的吸光值。空白对照是在加入底物之前已经加入同等体积的TCA终止酶活，其他步骤相同。酶活定义为每毫升酶液每分钟释放出多少微克酪氨酸。
角蛋白酶催化速率测定方法：采用合成性底物succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(AAPF)，溶解在含有5％(v/v)的二甲基甲酰胺的100mM Tris-HCl缓冲液中，pH 9.0，在25℃下测定405nm(ε405＝9600M-1cm-1)处每秒钟吸光度变化值。采用酶的浓度在1.5x 10-8M左右，底物浓度在0.1和1.5mM之间。并采用非线性回归分析得出反应动力学参数。
实施例1表达角蛋白酶C端剪切突变体的重组菌的制备
(1)根据C端特殊的β折叠结构，确定剪切位点如图1。然后使用一对携带双酶切位点NcoI和XhoI的引物(表1)，以含有嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1(于2011年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2011193)角蛋白酶基因kerSMD的质粒pET22b+kerSMD为模版，进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min后进入一下循环：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸7min 50s，30个循环；72℃延伸1min 50s，然后再降温到12℃得到最终反应液。使用的DNA扩增酶为TaKaRa公司的Primer STAR，使用配方参照产品说明书。
(2)将扩增后的PCR产物和pET22b质粒用NcoI和XhoI内切酶处理，得到粘性末端的DNA序列，再使用DNA连接酶在16℃下连接过夜。
(3)将连接液直接进行转化感受态大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落验证，将此质粒进行序列测定。选择正确的测序结果即为我们所需要的重组质粒。
(4)正确的突变质粒转化大肠杆菌BL21，37℃培养过夜，挑取单菌落即为本发明的产重组角蛋白酶工程菌。
表1角蛋白酶C端突变体的PCR引物序列
实施例2重组菌发酵生产角蛋白酶突变体
将参照实施例1的方法构建的分别携带编码突变体基因的重组表达载体转化E.coli BL21获得表达角蛋白酶的基因工程菌；将所得基因工程菌在含有100μg/l的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/l的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导培养，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。
实施例3角蛋白酶突变体的纯化及比酶活力和催化速率测定
(1)含有突变体基因的质粒的重组大肠杆菌在20℃下诱导培养3天后获得粗酶液。
(2)使用AKTA蛋白纯化仪(美国GE公司)和HisTrap FF crude 1ml的镍柱，从粗酶液中纯化出纯度90％以上的角蛋白酶KerSMD及其各种突变体。角蛋白酶的SDS-PAGE见图2，每个蛋白分子量大小都接近43kDa.
(3)将纯化好的角蛋白酶突变体加入到含有1％(w/v)酪蛋白的50mM Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0)中，置于50℃下孵育不同时间后，测定酶活力。并且测定角蛋白酶突变体对合成底物AAPF的催化速率和其他反应动力学参数。
(4)由表2可知，随着角蛋白酶KerSMD的C端氨基酸被去除数目的增加，角蛋白酶的蛋白酶活力显著提升，其中突变体V355酶活力最高，达到5340U/mg。除此之外，角蛋白酶突变体对于分解合成底物AAPF的催化速率也显著提升，从原始的底物催化速率71.0±5.2s- 1mM-1升到突变体V355的最高速率143.6±2.2s-1mM-1。本实验使用的分子改造技术的确能在一定程度上改善角蛋白酶的酶活力和反应催化速率。
表2角蛋白酶C端剪切突变体的酶活力及催化速率
实施例4角蛋白酶突变体V355对胶原蛋白底物酶活性的变化
对于构建的多种角蛋白酶C端剪切突变体中，突变体V355表现活性最佳，然而其对胶原蛋白的降解能力大大减弱。如图3所示，通过对比碱性蛋白酶和原始角蛋白酶KerSMD降解胶原I型蛋白的效果，突变体V355与胶原I型蛋白的反应液没有可溶性蛋白出现，而且其完整的胶原蛋白电泳也没有检测到蛋白降解条带。这说明突变体V355失去胶原蛋白酶活性，可以开发该种新型突变体作为皮革处理酶制剂的应用。
实施例5角蛋白突变体对食盐NaCl和去垢剂SDS的耐受性
分别测定不同浓度的食盐浓度(w/v)：0，5％，10％，15％下，角蛋白酶突变体耐受能力。如图4所示，相比于原始角蛋白酶KerSMD，突变体V435，V380，V370，V355都在5％浓度的NaCl溶液中获得酶活力提升。总的来说，该四种突变体相比原始酶耐盐能力提升，尤其突变体V435和V355在15％浓度的食盐环境下还能保持50％的酶活比。
分别测定不同浓度的SDS浓度(w/v)：0，1％，2％，4％下，角蛋白酶突变体耐受能力。如图5所示，突变体V355抗去垢剂SDS能力最强。在1％浓度的SDS环境下，大多数角蛋白酶突变体活性被抑制，然而只有突变体V355活性获得提升。这说明去垢剂SDS反而可以使角蛋白酶突变体V355部分活性位点暴漏，可以更好的增加酶活力。继续提升SDS浓度或严重抑制角蛋白酶活力，而突变体V355耐去垢剂能力最强，在4％浓度SDS环境下，仍然保持50％的活性，高于耐去垢剂SDS最好的蛋白酶subtilisin E。说明角蛋白酶突变体V355也可以在洗衣用途上开发新的应用价值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种催化速率提高的角蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体是将来源于嗜麦芽窄食单胞菌的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD的C端结构进行剪切，所述剪切是剪切掉第355位之后的C端序列。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
4.权利要求1所述突变体在食品、饲料、化工、制革或者制备药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是指在制备日化洗涤产品、在皮革领域或者在饲料消化中的应用。
6.一种权利要求1所述突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)根据目标突变体的蛋白序列设计引物，PCR扩增或者化学合成法得到含有编码角蛋白酶突变体的核苷酸片段；
(2)将上一步得到的突变体的核苷酸片段连接到质粒pET22b中，得到重组质粒；
(3)将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌，将重组菌发酵培养，得到的发酵上清液即含有角蛋白酶突变体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵是将重组菌于37℃培养至OD600＝0.6，然后降温至20℃并加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，培养72h时离心获得上清酶液。
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