CN103589705A - 一种角蛋白酶及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或在SEQ ID NO.2基础上通过缺失、突变、重组获得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。本发明还提供了一种编码角蛋白酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或根据角蛋白酶氨基酸缺失、突变、重组情况，人工设计的核苷酸序列。本发明提供的角蛋白酶能够有效水解羽毛，羊毛等非水溶性角蛋白底物，可用于皮革纺织工业和饲料工业。

Description

一种角蛋白酶及其编码基因

技术领域

本发明涉及一种角蛋白酶及其编码基因，属于酶基因工程和酶工程领域。

技术背景

全球家禽养殖业年产生数百万吨羽毛，角蛋白在羽毛中占很大的比重，高达90%以上。羽毛营养成分分析表明，氨基酸含量在70%以上。其中动物的第一，第二限制性氨基酸：赖氨酸和蛋氨酸含量分别高达0.77%和0.48%。动物的另一种必需氨基酸，甘氨酸含量占到7.59%。而在动物日粮中，赖氨酸添加比例一般为0.1%-0.2%，蛋氨酸的添加比例为0.02%-0.1%。目前中国饲料蛋白源严重不足，而中国是羽毛产量第一大国，年产量70万吨以上。以羽毛为原料作为饲料蛋白源，具有很好的前景。此外，羽毛角蛋白还可以广泛应用于医药，食品，复合材料行业。所以羽毛角蛋白的开发利用具有重要的现实意义。

但是，由于角蛋白多肽链间二硫键，盐键，氢键的广泛存在，使角蛋白的结构非常稳定，尤其由于二硫键的存在。常用的蛋白酶，如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，都很难降解角蛋白。热处理对角蛋白的降解程度很有限，此外还会破坏一些具有营养价值的氨基酸，如赖氨酸，蛋氨酸和色氨酸，产生一些动物不需要的氨基酸，如硫化双丙氨酸。而化学方法，主要包括酸水解法和碱水解法，也会破坏掉一些具有营养价的氨基酸。此外水解后的废水还会对环境造成污染。基于此及酶反应所具有的优势，利用角蛋白酶降解羽毛角蛋白成为一种具有很好前景的方法。角蛋白酶（Keratinase）为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白（Prion）的降解。更使其成为研究热点，应用和研究价值巨大。

目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA基因。本专利介绍一种由本实验室自主筛选获得的具有高效降解羽毛能力的嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1），并将角蛋白酶基因单独表达，并进行基因以及酶学性质方面的研究，为角蛋白酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水解非水溶性角蛋白底物的角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或在SEQ ID NO.2基础上通过缺失、突变、重组获得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种上述角蛋白酶的基因，、其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或根据角蛋白酶氨基酸缺失、突变、重组情况，人工设计的核苷酸序列。

此外，本发明还提供了一种生产的角蛋白酶的方法，具体包括如下步骤：首先采用化学全合成或PCR方法获得SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；克隆获得的核苷酸序列到pET22b(+)表达载体；然后将获得的表达载体转化E.coli BL21获得表达的角蛋白酶的基因工程菌；最后通过优化发酵工艺，将获得的基因工程菌在含有100μg/l的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/l的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600nm=0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。包含本发明角蛋白酶基因的表达载体属于本发明要求保护的范围。

包含本发明提供的表达载体的细胞系或基因工程菌也为本发明要求保护的范围。

上述角蛋白酶及其编码基因在在处理羽毛中的应用也为本发明要求保护的范围。

角蛋白酶酶活测定方法，测定原理及步骤为。

原理：角蛋白酶水解角蛋白底物，释放出酪氨酸，通过酪氨酸与福林酚显色，在660nm下测定吸光度值。吸光值的大小直接与酶活力的高低成正比。

测定步骤：0.1mL经适当稀释的酶液，加入0.1mL的1%（w/v）可溶性角蛋白底物(使用前和0.1mol/L的pH9.0的Gly-NaOH缓冲液混合)，在50℃反应20min，每个反应样品中加入0.2mLTCA反应终止蛋白沉淀剂，摇匀后10,000r/min离心5min，取0.2mL上清液加入1mL的4%（w/v）Na₂CO₃，再加入0.2mL上海生工公司购买的福林酚试剂（预先稀释3倍）在50℃下反应15分钟。使用0.5cm的石英比色杯测定清液在660nm处的吸光值。空白对照是在加入底物之前已经加入同等体积的TCA终止酶活，其他步骤相同。酶活定义为每毫升酶液每分钟释放出多少微克酪氨酸。

本发明提供的重组角蛋白酶的最适温度60℃，最适pH9.0。在50℃、pH9.0下与不溶性角蛋白底物反应，能够部分水解。50℃下酶活性半衰期为90分钟，60℃下半衰期62分钟。实验结果显示该重组角蛋白酶能够很好的水解羽毛粉，羊毛，具有很好的应用前景。

附图说明

图1重组菌构建琼脂糖凝胶电泳图

M：DNA marker，1：角蛋白酶全长阅读框基因片段（1923bp），2：角蛋白酶基因PCR产物，3：扩增质粒pMD19T+KerSMD，4：质粒pMD19T+KerSMD双酶切（NcoⅠ/XhoⅠ）5：表达质粒pET22b+KerSMD，6：表达质粒pET22b+KerSMD双酶切（NcoⅠ/XhoⅠ）

图2重组菌发酵产角蛋白酶SDS-PAGE图

M：protein marker，1：诱导12h发酵上清，2：诱导24h发酵液上清，3：诱导48h发酵液上清，4：纯化的角蛋白酶，图中总箭头所示为目标蛋白。

图3角蛋白酶KerSMD在不同pH下的酶活性。pH4-6为醋酸钠缓冲液，pH6-7为磷酸缓冲液，pH7-9为Tris-HCl缓冲液，pH9-12为Gly-NaOH缓冲液。

图4角蛋白酶KerSMD在不同温度下的酶活性。使用pH7.0缓冲液。

图5角蛋白酶KerSMD在不同温度下的酶稳定性。使用pH7.0缓冲液，保存角蛋白酶于不同温度下不同时间之后测定酶活。

具体实施方式

实施例1角蛋白酶基因的分离克隆程序。

Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1（已在本课题组之前的专利申请中提交保藏机构，2011年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏编号为CCTCC No.2011193）在液体LB培养基（蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物10g/L）中培养12h，10000rpm离心5min收集菌体，无菌水洗涤，使用基因组提取试剂盒（上海生工公司购买）提取总DNA。

利用引物NdeI-kerD（GGAATTCCATATGATGGCCGCAGTGTTG）和XhoI-kerD（CCGCTCGAGCTGCGTGGCGAGGATG），以Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1基因组为模版，PCR扩增角蛋白酶基因。反应条件为：95℃预变性5min后进入一下循环：95℃变性50s，60℃退火30s，72℃延伸110s，30个循环；72℃延伸10min。扩增得到1923bp的PCR片段，切胶回收。回收片断与pMD19-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃培养过夜，挑取单菌落，接入LB液体培养基，8h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因开放阅读框全长1902个核苷酸，编码634个氨基酸，和Stenotrophomonas maltophilia YHYJ-1的kerD基因有7个氨基酸的差异。

实施例2角蛋白酶基因在大肠杆菌表达载体上的构建程序。

用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET22b(+)。利用引物NocI-p-kerD（CATGCCATGGCCGGGTTGCCGAC）和XhoI-kerD（CCGCTCGAGCTGCGTGGCGAGGATG）进行扩增角蛋白酶KerSMD的基因。将pET22b(+)质粒和角蛋白酶基因进行NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物切胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的KerSMD-pET22b(+)质粒，构建过程电泳图见图1。

实施例3大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。

将质粒KerSMD-pET22b(+)在42℃热击转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氨苄青霉素（100mg/L）-LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子（重组菌KerSMD-pET22b(+)/E.coli BL21(DE3)）在LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L）中37℃液体培养过夜，后接入LB发酵液体培养基37℃培养至OD₆₀₀=0.6后降温至20℃培养，加入IPTG（异丙基硫代βD半乳糖苷，终浓度为0.1mM）诱导，72h时离心收集上清，上清酶活为最高可达720U/ml。电泳图见图2，表观分子量46kDa。

Claims (7)

1.一种角蛋白酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或在SEQ ID NO.2基础上通过缺失、突变、重组获得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。 

2.编码权利要求1所述角蛋白酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或根据角蛋白酶氨基酸缺失、突变、重组情况，人工设计的核苷酸序列。 

3.表达权利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌或细胞系。 

4.含有权利要求2所述角蛋白酶基因的表达载体或克隆载体。 

5.生产权利要求1所述角蛋白酶的方法，其特征在于包括如下步骤： 

1）采用化学全合成或PCR方法获得SEQ ID NO.1所示核苷酸序列； 

2）克隆SEQ ID NO.1所示核苷酸序列到pET22b(+)表达载体； 

3）将步骤2）获得的表达载体转化E.coli BL21(DE3)获得表达角蛋白酶的基因工程菌； 

4）将步骤3）获得的基因工程菌在含有100μg/l的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/l的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD_600nm=0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。 

6.权利要求1所述角蛋白酶在处理羽毛中的应用。 

7.权利要求2所述蛋白酶基因在角蛋白处理中的应用。 

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