CN106810561A - 一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针及其制备方法与应用，该探针的分子式为：C49H55N7O5，结构式如下：该探针通过在反应位点增加溶酶体定位基团，利用两个荧光基团之间的能量传递导致荧光改变，设计出比率型识别次氯酸的探针且响应时间非常速度，可以应用于生物细胞体系中次氯酸的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。

Description

一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针及其制备方法与应用，属于分析化学技术领域。
背景技术
次氯酸(HClO)是自然界中的多种生物用于防御的天然杀菌剂。在生物细胞中，次氯酸由过氧化氢和氯离子在髓过氧化酶(MPO)的催化作用下产生。作为一种重要的活性氧物种，次氯酸在维持细胞内的氧化还原平衡状态起着非常重要的作用，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病，检测生物体系中次氯酸的浓度已成为一个重要的课题。
文献报道，中性粒(白)细胞发炎的情况下可以每小时产生20-400μM的次氯酸，由于次氯酸的pKa为7.46，在生物体内，部分次氯酸(HClO)是以次氯酸跟(ClO-)的形式存在的。与传统的检测方法相比，荧光光谱法作为一种非侵入性检测技术，以其众多的优势。如灵敏度高、选择性好、响应迅速、原位检测、实时监测等。
生物体内广泛存在很多内源性活性物种，活性氧物种是非常重要的一类，而次氯酸只是活性氧家族的一员，在其他干扰活性氧物种的存在的条件下，专一性对体内的次氯酸进行识别，需要探针分子具有较好的抗干扰性。与此同时，对于探针浓度、检测温度、响应时间以及仪器误差都对识别产生影响。目前，多数报道的次氯酸探针为单一荧光强度的变化型探针，比率型探针较少。本专利通过分子结构设计，利用FRET原理，在反应位点增加溶酶体定位基团，设计出比率型识别次氯酸的探针且响应时间非常速度。
发明内容
针对目前次氯酸分子荧光探针检测所面临的问题的现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有响应时间快的比率型次氯酸荧光探针。
本发明采用以下技术方案：
一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针，该探针分子的分子式为：C49H55N7O5，具有如下所示结构：
所述探针随着NaClO当量的增加，该荧光探针在385nm的吸收逐渐降低，而在560nm的吸收逐渐增强，紫外光谱成比率变化。
所述探针在没有加入次氯酸的条件下，以380nm激发波长激发，只有在455nm处有很强的荧光发射，以500nm激发波长激发，没有荧光发射；随着NaClO加入当量的增加，455nm处的荧光强度逐渐减弱，584nm处的荧光强度逐渐增强，荧光光谱成比率变化。
上述的溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：
1)将1eq的4-二乙胺基酮酸和1eq的间羟基苯基哌嗪溶于3ml浓硫酸中，90℃加热3小时，冷却到室温，冰浴下，加入4ml高氯酸，得到粗产品，柱层析分离得化合物1；
2)将1eq的化合物1溶于乙醇，滴加10eq的80％水合肼，回流3小时，反应完成后，减压旋干溶剂得粗产品并用柱层析分离后得化合物2；
3)将1eq化合物2和1eq的6-二乙胺基萘羧酸、1eq的HOBt、1eq的EDCI溶于DMF中，室温反应6h，反应完全后，加水，乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用柱层析后分离得化合物；
4)将1eq的化合物3溶于氯仿中，向其中滴加3-4滴三乙胺，然后将20μl溴乙酰溴溶于1ml氯仿中，再于0℃条件下缓慢滴加于混合溶液中，滴加完毕后室温反应3-4小时，反应完全后，用二氯甲烷萃取，然后依次水洗、盐水洗、无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用柱层析分离得到化合物4；
5)将1eq的化合物4，3eq的碳酸钾，微量碘化钾以及3eq的吗啉溶解在DMF中，室温反应6h，反应完全后，乙酸乙酯萃取，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂得到粗产品后，用柱层析得到目标探针化合物，简记为Lyso-HClO。
所述步骤(1)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。
所述步骤(2)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。
所述步骤(3)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝30:1。
所述步骤(4)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。
所述步骤(5)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/石油醚＝1:1。
上述的次氯酸荧光探针的合成路线如下：
本发明所述的溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针的应用，该荧光探针可以应用于生物细胞体系中次氯酸的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。
该荧光分子结构增加吗啉作为溶酶体定位基团，在细胞成像过程可以有效的专一的定位到溶酶体区域。基于FRET机理，在没有加入次氯酸的条件下，该荧光探针只在385nm处出现紫外吸收，随着NaClO当量的增加，该荧光探针在385nm的吸收逐渐降低，而在560nm的吸收逐渐增强，紫外光谱成比率变化。在没有加入次氯酸的条件下，该荧光探针在激发波长(380nm)条件下，该荧光探针只有在455nm处有很强的荧光发射，在激发波长(500nm)条件下，该荧光探针没有荧光发射。随着NaClO加入当量的增加，荧光强度逐渐减弱(455nm)；在激发波长(500nm)条件下随着NaClO加入当量的增加，荧光强度逐渐增强(584nm)，荧光光谱同样成比率变化，荧光强度比率变化可有效减弱单一荧光强度变化造成的一定误差。利用共聚焦显微镜成像，没有加入次氯酸钠的细胞中，通过405nm为激发光的蓝通道有荧光发出，而561nm激发的红通道几乎观察不到荧光发出。然而，加入次氯酸钠的细胞中可以同时在蓝通道和红通道观察到荧光成像。
本发明的优点：(1)探针的合成成本比较低，且后处理过程相对简单；(2)本发明实现了次氯酸分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中和生物细胞内次氯酸分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。
附图说明
图1是实施例1中探针Lyso-HClO的1H NMR图谱；
图2是探针Lyso-HClO随次氯酸钠的加入荧光谱图的变化情况；
图3是探针Lyso-HClO对不同分析物加入后荧光强度的变化情况，其中(1)blank；(2)t-butylhydroperoxide；(3)H2O2；(4)NO；(5)peroxide tert-butyl ether；(6)OH—；(7)NO2 —；(8)NO3 2—；(9)I—；(10)S2—；(11)Cys；(12)GHS；(13)Hcy；(14)Cu2+；(15)；Co2+(16)Ca2+；(17)Mg2+；(18)K+,(19)ClO—；
图4是探针Lyso-HClO溶液在次氯酸加入前后溶液颜色的变化；
图5是探针Lyso-HClO应用于细胞中对外源性次氯酸进行荧光成像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。
实施例1
化合物Lyso-HClO次氯酸荧光探针的合成
化合物1的合成：
4-二乙胺基酮酸(10mmol,3g)和间羟基苯基哌嗪(10mmol,1.77g)溶于3ml浓硫酸中，90℃加热3h，冷却到室温，冰浴下加入4ml高氯酸，得到粗产品，柱层析分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇＝20:1，产量为80％。
化合物2的合成：
将化合物1(2.5g，5mmol,1eq)溶于20mL乙醇中，滴加80％水合肼5ml加热回流反应3h，用TCL板检测反应，反应完全后，减压旋干溶剂后得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇＝20:1，产量为85％。
化合物3的合成：
将化合物2(0.23g,5mmol,1eq)和6-二乙胺基萘羧酸(1.2g，5mmol,1eq)、HOBt(0.675g，5mmol,1eq)、EDCI(0.96g,5mmol，1eq)溶于DMF中，室温反应6h，反应完全后，加水，乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇＝30:1，产量为50％。
化合物4的合成：
将化合物3(100mg，1mmol,1eq)溶于2ml CHCl3中，滴加3-4滴三乙胺，溴乙酰溴20μl溶于1ml氯仿中，0℃条件下缓慢滴加。用TCL板检测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇＝20:1，产量为86％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.41(s,1H),7.85(d,J＝6.8Hz,1H),7.78(d,J＝8.5Hz,2H),7.66(d,J＝8.6Hz,1H),7.59(p,J＝7.2Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,1H),7.20(d,J＝9.1Hz,1H),7.06(d,J＝7.1Hz,1H),6.92(s,1H),6.66(s,2H),6.55(d,J＝9.3Hz,1H),6.46(d,J＝8.8Hz,1H),6.45–6.26(m,2H),3.67(s,4H),3.47(d,J＝6.9Hz,4H),3.32(d,J＝6.9Hz,4H),3.25(s,4H),2.96–2.76(m,2H),2.12(s,4H),1.16(t,J＝6.9Hz,6H),1.08(t,J＝6.8Hz,6H).
化合物Lyso-HClO的合成：
将化合物4(50mg，0.1mmol,1eq)，K2CO3(45mg，0.3mmol,3eq),KI微量，溶于2mLDMF中，吗啉(26mg,3eq)溶于DMF中加入，室温反应6小时，用TCL板检测反应，反应完全后，乙酸乙酯萃取，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂。硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚＝1:1，产量为81％。
实施例2
化合物Lyso-HClO次氯酸荧光探针随NaClO加入当量的增加荧光谱图的变化
取实施例1制备的Lyso-HClO次氯酸荧光探针溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出40μL加入到5mL的离心管当中，用PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)与DMF体积比为1:1的溶液稀释至4mL，加入不同当量(0-12eq)的NaClO标准溶液，测量其荧光性质。荧光光谱如图2所示。左图为该荧光探针在激发波长(380nm)条件下随着NaClO加入当量的增加，荧光强度逐渐减弱(455nm)，右图为该荧光探针在激发波长(500nm)条件下随着NaClO加入当量的增加，荧光强度逐渐增强(584nm)。二者在一定浓度范围内成线型比例关系，可以定量检测低浓度次氯酸。
实施例3
化合物Lyso-HClO次氯酸荧光探针对不同分子或离子的选择性
从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的次氯酸标准溶液[(1)blank；(2)t-butylhydroperoxide；(3)H2O2；(4)NO；(5)peroxide tert-butyl ether；(6)OH—；(7)NO2 —；(8)NO3 2—；(9)I—；(10)S2—；(11)Cys；(12)GHS；(13)Hcy；(14)Cu2+；(15)；Co2+(16)Ca2+；(17)Mg2+；(18)K+,(19)OCl—]，30min后以PBS:DMF(1:1)为溶剂，365nm为激发光，检测溶液的荧光发射光谱变化，结果如图3所示。同时还研究了其他金属离子对本发明探针荧光强度的影响，在以PBS:DMF(1:1)为溶剂，380nm为激发光。由图3看可以发现，其他金属离子对化合物Lyso-HClO在584nm处的荧光几乎没有影响，而次氯酸溶液的加入使化合物Lyso-HClO在584nm处的荧光显著增强。
实施例4
化合物Lyso-HClO荧光探针对次氯酸的可视化检测
从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的样品管当中，加入80摩尔量的次氯酸标准溶液，次氯酸可以使合物Lyso-HClO荧光探针的PBS：DMF体积比为1:1的缓冲溶液，溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成红色，如图4所示。这说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。
实施例5
化合物Lyso-HClO次氯酸荧光探针对细胞外源性次氯酸荧光比率成像
我们将本发明探针应用于HeLa细胞中对外源性的次氯酸进行荧光成像。具体操作步骤如下：将5μM Lyso-HClO次氯酸探针DMSO溶液加入到两份育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min然后向其中的一份加入20μM的次氯钠水溶液后，另一份加入相同体积的蒸馏水，在培养箱中培养20min用PBS进行洗涤三次后，用共聚焦显微镜进行成像。成像结果如图5所示。作为参比，没有加入次氯酸钠的细胞中，通过405nm为激发光的蓝通道有荧光发出，而561nm激发的红通道几乎观察不到荧光发出。然而，加入次氯酸钠的细胞中可以同时在蓝通道和红通道观察到荧光成像，通过两个通道的比率成像，可以发现两者之间有明显的差异，说明此荧光探针可以对外源性的次氯酸进行荧光比率成像。

Claims (10)

1.一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针，其特征在于，该探针分子的分子式为：C49H55N7O5，具有如下所示结构：
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述探针随着NaClO当量的增加，该荧光探针在385nm的吸收逐渐降低，而在560nm的吸收逐渐增强，紫外光谱成比率变化。
3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述探针在没有加入次氯酸的条件下，以380nm激发波长激发，只有在455nm处有很强的荧光发射，以500nm激发波长激发，没有荧光发射；随着NaClO加入当量的增加，455nm处的荧光强度逐渐减弱，584nm处的荧光强度逐渐增强，荧光光谱成比率变化。
4.一种权利要求1、2或3所述的溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
1)将1eq的4-二乙胺基酮酸和1eq的间羟基苯基哌嗪溶于3ml浓硫酸中，90℃加热3小时，冷却到室温，冰浴下，加入4ml高氯酸，得到粗产品，柱层析分离得化合物1，所述化合物1结构式如下：
2)将1eq的化合物1溶于乙醇，滴加10eq的80％水合肼，回流3小时，反应完成后，减压旋干溶剂得粗产品并用柱层析分离后得化合物2，所述化合物2结构式如下：
3)将1eq化合物2和1eq的6-二乙胺基萘羧酸、1eq的HOBt、1eq的EDCI溶于DMF中，室温反应6h，反应完全后，加水，乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用柱层析后分离得化合物3，所述化合物3的结构式如下：
4)将1eq的化合物3溶于氯仿中，向其中滴加3-4滴三乙胺，然后将20μl溴乙酰溴溶于1ml氯仿中，再于0℃条件下缓慢滴加于混合溶液中，滴加完毕后室温反应3-4小时，反应完全后，用二氯甲烷萃取，然后依次水洗、盐水洗、无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用柱层析分离得到化合物4，所述化合物4的结构式如下：
5)将1eq的化合物4，3eq的碳酸钾，微量碘化钾以及3eq的吗啉溶解在DMF中，室温反应6h，反应完全后，乙酸乙酯萃取，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂得到粗产品后，用柱层析得到目标探针化合物，简记为Lyso-HClO。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝30:1。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/石油醚＝1:1。
10.一种权利要求1、2或3所述的溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针的应用，其特征在于，该荧光探针可以应用于生物细胞体系中次氯酸的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。
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