CN105001352A

CN105001352A - 一种β-1,3/1,6-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用

Info

Publication number: CN105001352A
Application number: CN201510409825.3A
Authority: CN
Inventors: 于广利; 郝杰杰; 丛大鹏; 管华诗; 赵峡; 吕友晶; 胡婷
Original assignee: Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Current assignee: CP Pharmaceutical Qingdao Co Ltd; Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2015-07-14
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-07-14
Also published as: CN105001352B; WO2017008768A1

Abstract

本发明提供了一种β-1,3/1,6-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用，将南极褐藻烘干、粉碎，经脱脂、水提、氯化钙沉淀及阴离子交换树脂纯化，获得以β-1,3-葡萄糖为主链，β-1,6-葡萄糖为支链的葡聚糖，其分子量在5～50kDa之间。本发明制备的β-葡聚糖，通过体外巨噬细胞吞噬中性红及促进NO释放实验表明其具有免疫增强活性，通过体内动物实验表明具有抗肿瘤生长并抑制肿瘤转移作用。本发明利用南极褐藻制备β-1,3/1,6-葡聚糖，具有原料来源丰富易得、制备工艺简单，产品纯度高、生物活性强及易于产业化生产等优点，有开发成为免疫增强和抗肿瘤药物的前景。

Description

一种β-1,3/1,6-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用

技术领域

本发明属于海洋药物领域，涉及利用海藻制备高纯度低分子量葡聚糖的方法及其应用，尤其涉及一种β-1,3/1,6-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用。

背景技术

葡聚糖(Glucan)是一种以葡萄糖为唯一组成单元的多糖物质，广泛存在于动植物和微生物以及褐藻中。自然界中的葡聚糖种类很多，有直链或分支的α/β-葡聚糖，葡萄糖之间其连接方式有1,2-连接、1,3-连接、1,4-连接和1,6-连接等形式，其中β-1,3及β-1,6-葡聚糖有较好的生物活性,如抗肿瘤、增强免疫、促伤口愈合、抗辐射及预防高脂血症等。据世界卫生组织统计，在未来的20年,癌症病例将由2012年的1400万上升到2200万。中国每天有8550人成为癌症患者，每七到八人中就有一人死于癌症。癌症治疗除了手术疗法和放化疗法外，免疫疗法是一种安全可靠的疗法之一，其中通过免疫增强执行抗肿瘤作用的β-1,3-葡聚糖的市场需求量很大。β-1,3-葡聚糖除了用做免疫增强和抗肿瘤作用外，在代用血浆、预防口腔黏膜溃疡以及化妆品等行业中也具有广泛的用途，市场应用前景广阔。

目前，市场上β-1,3-葡聚糖多来自于大麦、燕麦、食用真菌(香菇，灰树花，裂褶菌)、酵母等陆生生物，由于原料来源不同，所得β-1,3-葡聚糖的分子量、连接方式及分支度等差别很大，质量很难控制，如注射药用的β-葡聚糖主要来源于香菇，是一种具有β-1,6-分支的β-1,3-葡聚糖，由于其分子量高达400-800kDa，水溶性较差。随着β-葡聚糖应用领域的不断扩大，市场需求量的不断增长，现有的香菇β-葡聚糖已不能满足市场的需要。

在海藻来源葡聚糖制备方面，经过专利检索发现有1项中国发明专利(专利号201010169739.7)涉及了海藻低分子葡聚糖的制备方法，其原料是海带，裙带菜和羊栖菜，所用方法是采用80％乙醇分级沉淀以及双氧水氧化的方法，所得到的产品分子量只有800-1000道尔顿(Da)，结构不明确，也未见其有抑制肿瘤生长与转移的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种β-1,3/1,6-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用，所述β-1,3/1,6-葡聚糖从南极褐藻中制备而得，细胞和动物实验均表明其安全性高，且具有显著的免疫增强和抗肿瘤活性，具有开发为免疫增强和抗肿瘤作用的潜力，能弥补市场药用β-1,3/1,6-葡聚糖缺乏的需求。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：

一种β-1,3/1,6-葡聚糖，它从南极褐藻中提取获得，所述β-1,3/1,6-葡聚糖以β-1,3-葡萄糖为主链，以β-1,6-葡萄糖为支链，重均分子量为5～50kDa；所述β-1,3/1,6-葡聚糖中葡萄糖的含量为90wt％～98wt％，粗蛋白含量0.5％wt-2.5％wt，其余为水分。

所述南极褐藻为海茸、海笋或雷松藻。

本发明还提供了所述的β-1,3/1,6-葡聚糖的制备方法，它包括以下步骤：

(1)脱脂：将南极褐藻烘干、粉碎，有机溶剂浸泡、搅拌，得脱脂藻粉；

(2)水提：所述脱脂藻粉室温下用水搅拌提取得水提液；

(3)分级：将步骤(2)所得水提液离心，在离心获得的上清液中加入1～3mol/L氯化钙水溶液；搅拌后离心，取上清液进行透析或超滤脱盐，减压浓缩干燥获得粗多糖；

(4)纯化：将步骤(3)所述粗多糖用蒸馏水溶解，以蒸馏水和氯化钠水溶液为流动相，经过阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，收集水洗脱组分，减压浓缩、冻干，获得所述β-1,3/1,6-葡聚糖。

对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(1)中加入的有机溶剂的体积与藻粉的质量比例为10～20：1，采用浸泡或间歇搅拌脱脂2～8h，所用有机溶剂为乙醇、丙酮或甲醇混合溶液之一种或几种。

对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(3)中加入氯化钙水溶液的体积为提取液体积的1～3倍，透析或超滤所用膜的截留分子量为1000～3000Da。

对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(4)中所述阴离子交换树脂纯化所用氯化钠水溶液浓度为0.0～2.0mol/L，洗脱2～8个柱体积。

本发明还提供了所述的β-1,3/1,6-葡聚糖在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用。

所述β-1,3/1,6-葡聚糖浓度为5～100μg/mL时，具有促进巨噬细胞吞噬中性红的作用。

所述β-1,3/1,6-葡聚糖浓度为5～100μg/mL时，具有促进淋巴细胞NO释放的作用。

所述β-1,3/1,6-葡聚糖用量大于1mg/kg/day时，能够有效抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长和肿瘤转移。

本发明的优点和有益效果为：

(1)本发明将南极海藻烘干、粉碎，经脱脂、氯化钙沉淀及阴离子交换树脂纯化，获得高纯度的以β-1,3-葡萄糖为主链及β-1,6-葡萄糖为支链的低分子量β-1,3/1,6-葡聚糖，其葡萄糖含量为90wt％～98wt％，蛋白含量0.5％wt～2.5％wt，重均分子量为5～50kDa。原料来源于南极可食用的褐藻，安全性高。

(2)本发明采用的原料资源丰富、制备工艺简单、成本低廉、易于产业化生产，可弥补市场供应量不足的缺陷。

(3)采用本发明方法制备的β-1,3/1,6-葡聚糖，产品纯度90wt％～98wt％，分子量为5～50kDa。

(4)采用本发明方法制备的低分子量β-1,3/1,6-葡聚糖在细胞和动物水平具有免疫增强和抑制肿瘤生长与转移作用。

附图说明

图1为本发明所述β-1,3/1,6-葡聚糖的单糖组成分析HPLC图；

图2为本发明所述β-1,3/1,6-葡聚糖的傅里叶变换红外光谱(FTIR)图；

图3为本发明所述β-1,3/1,6-葡聚糖的核磁共振碳谱(¹³C-NMR)图；

图4为本发明所述β-1,3/1,6-葡聚糖促进巨噬细胞吞噬中性红效果图；

图5为本发明所述β-1,3/1,6-葡聚糖促进巨噬细胞分泌NO效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进一步的详细说明，结合附图阅读本发明的具体实施例后，本发明的其他优点和特点将变得更加清晰，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

1、将南极褐藻(如海茸，海笋，雷松藻)烘干，粉碎，取藻粉400g，向藻粉中加入4000mL95％乙醇浸泡、间歇搅拌4h，离心弃去乙醇，利用乙醇重复提取1次，干燥得300g脱脂藻粉。

2、取30g所述脱脂藻粉，加入600mL双蒸水，室温搅拌提取2-4h得到水提液。

3、离心取上清液；在搅拌下向上清液中加入3mol/L氯化钙水溶液600mL，离心后收集上清液，然后用3000Da的透析袋或者1000Da纳滤膜脱盐，减压浓缩后冷冻干燥，得到粗多糖1.6g。

4、将0.5g所述粗多糖用2mL水溶解，以蒸馏水和氯化钠水溶液为流动相，氯化钠水溶液浓度为0.0～2.0mol/L，采用阴离子交换色谱柱(填料为Q SepharoseFast Flow)进行分离，用超纯水洗脱，洗脱2～8个柱体积。合并收集洗脱液，再经浓缩后冷冻干燥，得到0.32g高纯度β-1,3/1,6-葡聚糖(简称为DAG)。

本实施例中制备的β-1,3/1,6-葡萄糖纯度为97.5wt％，蛋白含量2％wt，采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)与十八角激光散射仪(MALLS)和示差检测器(RI)联用分析，其分子量分布在5～50kDa之间。

如图1所示，本发明产品的单糖组成分析结果表明，所得多糖的单糖组成中只有葡萄糖，表明其为葡聚糖。

如图2所示，本发明产品的红外光谱显示，3347cm^-1为多糖羟基的O-H伸缩振动峰，2917cm^-1为糖环中C-H的伸缩振动峰，1646cm^-1为少量蛋白中N-H伸缩振动吸收峰，1371cm^-1为C-H的变角振动峰；1152cm^-1，1072cm^-1和1030cm^-1分别为D-吡喃葡萄糖环非对称伸缩振动峰；896cm^-1为β-端基C-H的特征伸缩振动峰，由此可以判断本发明产品是一种β-D-吡喃葡聚糖。

表1为本发明产品甲基化分析结果。从表中数据可知，本发明葡聚糖产品中各葡萄糖(Glc)之间存在Glc(1→、→3)Glc(1→、→6)Glc(1→和→3,6)Glc(1→四种连接方式，且它们的摩尔比为1：3：1：1，表明该葡聚糖是以1→3连接为主链和以1→6连接为支链的葡聚糖。

表1褐藻β-葡聚糖甲基化分析结果

连接方式	离子碎片	摩尔比
			Glc(→	101、117、129、145、162、205	1
→3)Glc(1→	71、101、118、129、161、174、202、234、277	3
			→6)Glc(1→	71、87、99、102、118、129、162、189、233	1
→3,6)Glc(1→	87、118、129、139、174、189、234、245、305	1

图3为本发明产品的¹³C-NMR谱图。从图3中可以看出，δ170～176×1^-0⁶范围内无信号，表明样品中糖醛酸和乙酰基，δ16～18×10^-6之间无信号，表明样品中无甲基糖。本发明产品信号归属见表2，表2数据证明所得产品是β-1,3/1,6-葡萄糖。

表2所述β-1,3/1,6葡聚糖的¹³C-NMR信号归属

连接方式	化学位移×10^-6

	C1	C2	C3	C4	C5	C6
							→3,6)Glc(β1→	102.71	73.23	84.24	71.00	75.80	68.68
→3)Glc(β1→	102.49	73.11	84.07	69.53	75.55	60.66
							→6)Glc(β1→	95.62	73.23	75.80	68.12	73.78	68.04

实施例2

用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养巨噬细胞(Raw264.7)，调整细胞浓度，将其接种于96孔细胞培养板中，使得细胞浓度为2×10⁴个/孔，然后加入不同浓度样品，使β-1,3/1,6-葡萄糖终浓度分别为5μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL，以空白培养基为对照。培养24小时之后吸去培养基，用PBS洗涤多余的培养基，加入0.075％中性红，37℃下，5％CO₂孵育半小时，PBS洗净多余中性红，加细胞裂解液(无水乙醇：冰醋酸＝1:1，体积比)，混匀后在酶标仪上540nm处测吸光度值，通过吸光值的大小评价样品促进巨噬细胞吞噬中性红能力。以上实验做3次重复，取平均值进行结果统计分析。从图4结果可知，本发明产品DAG在5～100μg/mL时，随浓度的增加对巨噬细胞吞噬中性红均有促进作用。

实施例3

对巨噬细胞(Raw264.7)细胞进行复苏，传代，培养，铺板后加药培养24h。取96孔板每孔加入50μL培养液及50μL的稀释标准品，之后各孔加入50μLGriess Reagent I，再加入50μL Griess Reagent Ⅱ，在540nm测定吸光度值。以上实验做3次重复，取平均值进行结果统计分析。如图5所示，本发明褐藻β-1,3/1,6-葡聚糖(DAG)在5～100μg/mL时，随浓度的增加对巨噬细胞NO的释放均有明显促进作用。

实施例4

将小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)在适宜的条件下培养，待细胞生长至对数期时，重悬细胞，计数，接种，在体传代。于小鼠右前肢腋窝皮下接种1mm³瘤块，待瘤子长到9mm³左右，按体重将小鼠随机分组，即DAG高中低剂量组，环磷酰胺(CTX，30mg/mL)阳性对照组，每组10只。空白组给予20mL/kg/day生理盐水，给药组DAG剂量为1、4、10mg/kg/day,环磷酰胺(30mg/kg/day)为阳性对照组，腹腔注射给药，连续21天。每周测定2次瘤重，计算瘤体积。颈椎脱臼处死小鼠后，取出瘤块称重，取出肺组织，观察肿瘤转移结节数量。肿瘤抑制率按如下公式计算：肿瘤抑制率(％)＝(空白对照组的瘤重－治疗组的瘤重)/空白对照组瘤重×100％；转移抑制率＝(空白对照组结节数－治疗组结节数)/空白对照组结节数×100％。

表3海藻β-1,3/1,6-葡聚糖抑制荷肺癌小鼠肿瘤生长结果(n＝10)

注：x±SE，与模型组相比，**P<0.01,*P<0.05.

由表3可以看出，DAG可以有效地抑制肿瘤的生长，抑瘤率达32.9％,而且环磷酰胺在用药过程中出现体重下降的趋势，但是DAG组的体重没有出现明显下降，表明DAG药物毒性低，对动物也具有保护损伤的作用。

表4海藻β-1,3/1,6-葡聚糖抑制肺癌转移结果(n＝10)

注：x±SE，与模型组相比，**P<0.01,*P<0.05.

由表4可以看出,DAG能显著抑制Lewis肺癌的自发性肺转移，抑制效率达40.6％，表明DAG对肿瘤的转移侵袭具有有效的抑制作用。

综上，本发明制备的所述β-1,3/1,6-葡聚糖浓度为5～100μg/mL时，具有促进巨噬细胞吞噬中性红和促进淋巴细胞NO释放的作用，尤其在25～50μg/mL时，具有明显促进巨噬细胞吞噬中性红(图4)及促进NO释放作用(图5)，效果与香菇多糖(LTN)类似，表明其具有显著的免疫增强活性。体内小鼠实验表明，在1mg/kg/day时,具有明显抑制肺癌小鼠肿瘤生长和肿瘤转移效果，具有开发为免疫增强和抗肿瘤药物的潜力。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例中所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种β-1,3/1,6-葡聚糖，其特征在于，它从南极褐藻中提取获得，所述β-1,3/1,6-葡聚糖以β-1,3-葡萄糖为主链，以β-1,6-葡萄糖为支链，重均分子量为5~50 kDa；所述β-1,3/1,6-葡聚糖中葡萄糖的含量为90wt% ~ 98wt%，粗蛋白含量0.5%wt -2.5%wt，其余为水分。

2.根据权利要求1所述的β-1,3/1,6-葡聚糖，其特征在于，所述南极褐藻为海茸、海笋或雷松藻。

3.权利要求1所述的β-1,3/1,6-葡聚糖的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1) 脱脂：将南极褐藻烘干、粉碎，有机溶剂浸泡、搅拌，得脱脂藻粉；

(2) 水提：所述脱脂藻粉室温下用水搅拌提取得水提液；

(3) 分级：将步骤(2)所得水提液离心，在离心获得的上清液中加入1~3mol/L氯化钙水溶液；搅拌后离心，取上清液进行透析或超滤脱盐，减压浓缩干燥获得粗多糖；

(4) 纯化：将步骤(3)所述粗多糖用蒸馏水溶解，以蒸馏水和氯化钠水溶液为流动相，经过阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，收集水洗脱组分，减压浓缩、冻干，获得所述β-1,3/1,6-葡聚糖。

4.根据权利要求3所述的β-1,3/1,6-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入的有机溶剂的体积与藻粉的质量比例为10～20：1，采用浸泡或间歇搅拌脱脂2～8 h，所用有机溶剂为乙醇、丙酮或甲醇混合溶液之一种或几种。

5.根据权利要求3所述的β-1,3/1,6-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入氯化钙水溶液的体积为提取液体积的1～3倍，透析或超滤所用膜的截留分子量为1000～3000 Da。

6.根据权利要求3所述的β-1,3/1,6-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述阴离子交换树脂纯化所用氯化钠水溶液浓度为0.0～2.0 mol/L，洗脱2～8个柱体积。

7.权利要求1或2所述的β-1,3/1,6-葡聚糖在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用。

8.根据权利要求7所述的β-1,3/1,6-葡聚糖在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用，其特征在于，所述β-1,3/1,6-葡聚糖浓度为5~100 μg/mL时，具有促进巨噬细胞吞噬中性红的作用。

9.根据权利要求7所述的β-1,3/1,6-葡聚糖在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用，其特征在于，所述β-1,3/1,6-葡聚糖浓度为5~100 μg/mL时，具有促进淋巴细胞NO释放的作用。

10.根据权利要求7所述褐藻β-葡聚糖在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和功能性食品中的应用，其特征在于，所述β-1,3/1,6-葡聚糖用量大于1 mg/kg/day 时，能够有效抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长和肿瘤转移。