CN103804507A - 马里兰烟叶多糖、提取纯化方法及其作为抗氧化剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟叶产品技术领域，具体涉及一种马里兰烟叶多糖。本发明还公开了烟叶多糖的提取纯化方法，具体为：将粉碎过的马里兰烟叶按料液比1:30－40加入蒸馏水后，于50－70℃、500±20W超声处理5－7min，然后于4±2℃离心，取上清液旋转蒸发后醇析静置，离心取沉淀，采用Sevage法脱除蛋白，脱色后再次醇析静置并离心取沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。粗多糖再经层析柱分离纯化后，获得两个多糖组分Fr-I和Fr-II。经试验验证，马里兰烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对OH·自由基、DPPH·自由基具有较好的清除能力，是一种很好的抗氧物质，可用作抗氧化剂。

Description

马里兰烟叶多糖、提取纯化方法及其作为抗氧化剂的应用

技术领域

本发明属于烟叶产品技术领域，具体涉及一种马里兰烟叶多糖、提取纯化方法及其作为抗氧化剂的应用。

背景技术

近年来，人们已从近五十种植物叶子中成功提取出的多糖并广泛应用于功能食品和医药的开发研究中，如从桑叶、银杏叶、茶叶、枸杞叶、荷叶、沙棘叶等。从植物叶子中提取的多糖具有非常重要的生物活性。近来随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖与蛋白质、核酸一样，是与生命活动紧密相关的生物大分子，具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒、提高免疫能力等功能，是药理学研究的热点。

近年来，对植物叶多糖的体外抗氧化活性研究不胜枚举，例如Yuanfeng Wang等通过研究指出：茶叶多糖对·OH自由基的清除效果较明显，而且纯化的茶叶多糖组分TPS1具有较高的清除DPPH自由基活性和抑制脂质过氧化的作用。陈义勇等人的研究结果表明：银杏叶多糖清除DPPH自由基和·OH自由基的能力也较强。植物叶子多糖的提取方法有很多，主要包括溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法以及酶解法等。刘树兴等人利用热水浸提法从桑叶中提取桑叶多糖；利用正交试验确定多糖提取的最佳条件，用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，通过三氯乙酸法除去多糖中的蛋白质。张凡等对超声波提取法与水提醇沉法提取枸杞叶多糖进行了比较，在样品粒度、提取时间、提取温度、液料比以及提取次数一致的前提下，超声波法与水提法的提取率分别为12.35%、10.28%，可以看出，超声波法提取效果更好。

烟草是一种有争议、但有巨大经济效益的农作物，也是世界上种植最广泛的非粮食作物，烟草种植与产品加工在国民经济发展中发挥着重要的作用。我国引种烟草很早，产量颇大。到目前为止我国烟草的种植面积和产量均居世界首位。我国目前对于烟叶的研究多限于香烟的加工工艺。但由于烟叶中含有多种特殊天然植物素，如烟碱、果胶、纤维素、烟酸、茄尼醇、多糖等，所以在精细化工、日化、香精香料、食品、轻工、医药等行业都有着广泛的应用，极具开发潜质。烟叶多糖作为烟叶功能成分中的一种生物活性物质，具有多种药理作用，其应用和开发前景非常广阔。

马里兰烟属红花烟草，是一种淡色晾烟，口感适中，具有“低烟碱、低焦油”的特点，是生产安全性卷烟的优质原料之一，是斗烟、嚼烟、鼻烟和卷烟的原料，国内常用作混合型卷烟、雪茄烟配方中的调味原料。随着混合型卷烟的发展，我国近几年已引进马里兰烟试种，湖北等地已有少量生产。目前，高纯度烟叶多糖的制备在实验室里已经可以实现，通过对不同类型烟草中烟叶多糖提取及其结构性质的研究，对比分析不同类型烟叶多糖的药理作用，利于提高烟叶的利用价值，为烟草的综合利用提供了一条新的途径。目前，尚未有关于马里兰烟叶多糖的研究和相关报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种马里兰烟叶多糖、提取纯化方法及其作为抗氧化剂的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种马里兰烟叶多糖的提取纯化方法，其由下述步骤获得：

将粉碎过的马里兰烟叶按料液比1:30－40（质量体积比g:ml）加入蒸馏水后，于50－70℃、500±20W超声处理5－7min，然后于4±2℃离心，取上清液旋转蒸发（优选70±5℃）后醇析静置，离心取沉淀，采用Sevage法脱除蛋白，脱色后再次醇析静置并离心取沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。

进一步地，将粗多糖用层析柱分离纯化后，获得精制多糖。

具体的，所用层析柱的填料为Sepharose CL-6B；洗脱液为0.2 mol/L NaCl。

利用上述提取纯化方法制备得到的马里兰烟叶多糖。

利用上述提取纯化方法制备得到的马里兰烟叶多糖作为抗氧化剂的应用。

Sevage法脱除蛋白采用本领域常规技术即可。醇析静置时优选使用无水乙醇进行醇析。

本申请采用超声波法提取马里兰烟叶多糖，并通过五水平的单因素实验，研究功率A、时间B、液料比C三个因素对烟叶多糖提取率的影响。然后采用DX8Trial进行响应面试验设计，得出马里兰烟叶多糖的最佳超声提取条件：功率500W、时间6min、料液比1:35。在此工艺条件下，采用紫外可见分光光度计，运用苯酚-硫酸显色法测得马里兰烟叶粗多糖提取得率为2.01%。粗多糖再用层析柱进行分离纯化，得到两个烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II。此外，采用邻二氮菲法、DPPH法检测了马里兰烟叶多糖的抗氧化活性，即其对OH·自由基、DPPH·自由基的清除能力。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

1）经济效益分析：近年来，由于生物化学、分析化学、植物学、医学等学科的飞速和交叉发展，人们对多糖及其复合物的提取分离结构生物活性等有了更深入的认识，烟叶多糖作为烟叶功能成分中的一种生物活性物质，具有多种药理作用，并且由于其制备的原料多为低档烟叶，资源较丰富且价格低廉，其应用和开发前景非常广阔。高纯度烟叶多糖的制备在实验室里已经可以实现，通过研究马里兰烟草中烟叶多糖的提取纯化工艺，并分析烟叶多糖的结构及单糖组分、抗氧化性质，开发出一种新型的烟草终端产品，为烟草的综合利用提供了一条新的途径，提高了烟叶的利用价值，并拓展了烟草的应用范围。除此之外，研究烟叶多糖在燃吸过程中的裂解机理，为卷烟水平提供有效的数据支撑。由于烟叶多糖的制备工艺流程简单，可应用于大规模工业化生产中。因此，烟叶多糖终端产品的开发具有非常可观的经济效益。

2）社会效益分析：目前，世界各国对烟草综合利用的研究开发方兴未艾，而且正在不断的深入，与欧洲发达国家相比较，我国在该领域的研究相对较为落后。值得重视的是，我国既是烟草生产大国又是烟草的消费大国，烟草既对人类有药用等多种实用价值，也存在“吸烟危害人类健康和污染环境”的隐患。由于烟草业税收丰盈已成为国家财政收入的主要来源之一，因此，国家面临“增加财政收入”和“禁烟保障人民健康”的两难困境；怎样结合国情，加强对烟草有利人类方面的综合开发利用研究，同时重视对烟草制品进行再研究，扬长避短，让烟草充分发挥对人类的贡献。烟叶多糖是一种具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等性质的天然活性物质，对人民健康是有益的。我们可以从对烟叶多糖的提取、多糖性质及应用研究着手，结合高新技术的发展，在烟草的综合开发与利用领域，开创出新的局面。

附图说明

图1为马里兰烟叶多糖的超声波法提取工艺路线图；

图2为马里兰烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II的 Sepharose CL-6B层析柱分离图谱；

图3为马里兰烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II的红外鉴定图谱；

图4为马里兰烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对OH·自由基的清除能力；

图5为马里兰烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对DPPH·自由基的清除能力。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

1）材料：马里兰烟叶，产自湖北宜昌

2）超声波法提取马里兰烟叶多糖工艺路线（见图1）

3）超声波法提取马里兰烟叶多糖优化方法

一种马里兰烟叶多糖的提取纯化方法，其由下述步骤获得：将粉碎过的马里兰烟叶按料液比1:30－40（质量体积比g:ml）加入蒸馏水后，于60℃、400－600W超声提取4－8min，然后于4℃离心，取上清液70℃旋转蒸发后用无水乙醇醇析静置48h，离心取沉淀，采用Sevage法脱除蛋白，活性炭脱色后再次用无水乙醇醇析静置48h并离心取沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。Sevage试剂选用体积比为5:1的氯仿/正丁醇混合溶液。

通过五水平的单因素实验，研究超声功率A、时间B、液料比C三个因素对烟叶多糖提取率的影响。然后采用DX8Trial进行响应面试验设计。

功率：在料液比1：30(m：v)，提取温度60℃，提取时间4min，超声波功率分别为100，200，300，400，500 W的条件下进行试验，得出最佳功率水平，选择400W、500W和600W三个水平设计试验。

时间：在超声波功率300 W，提取温度60℃，料液比1：30(m:v)，提取时间分别为2，4，6，8，10 min的条件下进行试验，得出最佳时间水平，选择4min、6min和8min三个水平设计正交试验。

料液比：在超声波功率300 W，提取温度60℃，提取时间4 min，料液比分别为1：20，1：25，1：30，1：35，1：40(m:v)的条件下进行试验，得出最佳料液比水平，选择1:30、1:35和1:40三个水平设计正交试验。

响应面试验：在单因素实验分析的基础上，选择了400W、500W和600W三个功率水平，4min、6min和8min三个时间水平，1:30、1:35和1:40三个料液比水平，采用DX8Trial进行响应面试验设计，可得出超声波法提取马里兰烟叶多糖得出马里兰烟多糖的最佳提取条件为：功率500W、时间6min、液料比35:1。在此工艺条件下，采用紫外可见分光光度计，运用苯酚-硫酸显色法测得烟叶多糖提取率为2.01%。结果见表1。

实施例2

一种马里兰烟叶多糖的提取纯化方法，其由下述步骤获得：

1）将粉碎过的马里兰烟叶按料液比1:35（g:ml）加入蒸馏水后，于60℃、500W超声提取6min，然后于4℃离心，取上清液70℃旋转蒸发后用无水乙醇醇析静置48h，离心取沉淀，采用Sevage法脱除蛋白，活性炭脱色后再次用无水乙醇醇析静置48h并离心取沉淀，0℃冷冻干燥，得粗多糖；

2）将粗多糖用层析柱进行分离和纯化，获得精制多糖；所用层析柱（2.5×60cm）的填料为Sepharose CL-6B；洗脱液为0.2 mol/L NaCl。具体操作为：取50mg粗多糖，用5mL 0.2 mol/L NaCl溶解后，过孔径0.22μm的滤膜，上柱，洗脱液以0.6mL /min的流速进行洗脱，部分收集器收集，150滴/管。每管取1mL多糖溶液，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量。重复上柱5次。将同一组分的多糖收集在一起，浓缩透析（透析袋分子量3500）后，0℃冷冻干燥。采用傅里叶红外光谱技术对其分子结构进行表征，确认获得的两个多糖组分为Fr-I和Fr-II，结果见图2和3；图3中，3331.9、3277.7cm^-1处的吸收峰为羟基的O-H伸缩振动峰；2928.6、2928.0cm^-1处的吸收峰为C-H 的伸缩振动峰，这些属于糖类的特征吸收峰。

应用试验：马里兰烟叶多糖的抗氧化研究

1）马里兰烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对OH·自由基清除率的测定：

取1mL 7.5mmol/L邻二氮菲于比色管中，再加1.0mL磷酸缓冲液（pH=7.2），混匀，逐滴加入1mL 7.5mmol/L硫酸亚铁溶液后立即摇匀，然后加入1mL 0.1％的双氧水，加蒸馏水至5mL。将比色管置于37℃的恒温水浴锅中反应1.5 h，在536nm波长下测定吸光度A_{536（损伤）}。

同上法，不加双氧水，测定A_{536（未损伤）}。

同上法，在加入0.5mL 0.1％双氧水后，再分别加入不同浓度（0.5、0.8、1.2、1.5、2、2.5、3、4mg/mL）的烟叶多糖组分溶液0.5mL，分别测定A_{536（加样）}。

烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对OH·自由基的清除率I计算方法如下：

I=（A_{536（加样）}－A_{536（损伤）}）/（A_{536（未损伤）}－A_{536（损伤）}）×100％ 。

试验中还用抗坏血酸进行对照比较，结果如图4所示，当浓度为6mg/mL时，烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对OH·自由基的清除率分别为41.8%和62.3%；说明马里兰烟叶多糖具有较好的自由基清除能力，是一种良好的抗氧化物质，可用作抗氧化剂。

）马里兰烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对DPPH·自由基清除率的测定：

准确称取烟叶多糖组分0.010mg，于10ml蒸馏水中充分混匀溶解，配制成1mg/mL的多糖母液。用蒸馏水将多糖母液稀释成五种浓度：0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 mg/mL各2mL。试验分为样品组、对照组和空白组，具体为：取2 ml DPPH有机溶液，再加入2mL样品溶液，充分混匀，静置30min后在517nm处测定吸光度，记为A₂；取2 mL DPPH有机溶液，再加入2mL无水乙醇，充分混匀，静置30min后在517nm处测定吸光度，记为A₀；取2 mL无水乙醇，再加入2mL样品溶液，在517nm处测定吸光度，记为A₁。

烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对DPPH·自由基的清除率E计算方法如下：

       E=[1－(A₂－A₁)/A₀]×100％ 。

试验中还用抗坏血酸进行对照比较，结果如图5所示，当浓度为1mg/mL时，烟叶多糖组分Fr-I和Fr-II对DPPH·自由基的清除率分别为42.0%和65.1%；说明马里兰烟叶多糖具有较好的自由基清除能力，是一种很好的抗氧化物质，可用作抗氧化剂。

Claims (5)

1.一种马里兰烟叶多糖的提取纯化方法，其特征在于，包括下述步骤：将粉碎过的马里兰烟叶按料液比1:30－40加入蒸馏水后，于50－70℃、500±20W超声处理5－7min，然后于4±2℃离心，取上清液旋转蒸发后醇析静置，离心取沉淀，采用Sevage法脱除蛋白，脱色后再次醇析静置并离心取沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。

2.如权利要求1所述马里兰烟叶多糖的提取纯化方法，其特征在于，将粗多糖用层析柱分离纯化后，获得精制多糖。

3.如权利要求2所述马里兰烟叶多糖的提取纯化方法，其特征在于，所用层析柱的填料为Sepharose CL-6B；洗脱液为0.2 mol/L NaCl。

4.利用权利要求1、2或3所述提取纯化方法制备得到的马里兰烟叶多糖。

5.权利要求4所述马里兰烟叶多糖作为抗氧化剂的应用。

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