CN104994956B - 用于样品制备的反应容器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分纯化和/或富集生物有机化合物的样品制备容器,容器包括反应室和层析介质;其中,所述反应室用于保持所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分,并且配置为使得在其中可以实施以下反应的至少一个:裂解,例如,通过声波处理和/或蒸煮;层析纯化;还原;烷基化;以及诸如蛋白水解的酶促反应;其中,所述层析介质配置为纯化和/或富集所述生物有机化合物;其中,(a)所述层析介质位于所述反应室的壁处,并且所述壁是闭合或密封的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放;或(b)所述样本制备容器还包括用于接收所述生物有机化合物的接收室,所述接收室邻近所述层析介质,从而使得所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开,并且所述接收室的外面是闭合的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放。
Description
技术领域
本发明涉及用于从细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分纯化和/或富集生物有机化合物的样品制备容器,容器包括反应室和层析介质;其中,所述反应室用于保持所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分,并且配置为使得可以在其中实施以下反应的至少一个:裂解,例如,通过声波处理和/或蒸煮;层析纯化;还原;烷基化;以及诸如蛋白水解的酶促反应;其中,所述层析介质配置为纯化和/或富集所述生物有机化合物;其中,(a)所述层析介质位于所述反应室的壁上,并且所述壁是闭合或密封的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放;或(b)所述样本制备容器还包括用于接收所述生物有机化合物的接收室,所述接收室邻近所述层析介质,从而使得所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开,并且所述接收室的外面是闭合的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放。
背景技术
在本说明书中,引用了包括专利申请和制造商的手册的许多文件。虽然不认为和本发明的专利性相关,但是这些文件的全部公开内容结合于此作为参考。更具体地,所有参考文件均相同程度地结合于此作为参考,犹如每个单独的文件特定和单独地结合于此作为参考。
用于富集特定生物材料的包括细胞裂解的样本制备方法当前应用于生物研究的基本上所有领域。DNA、RNA和蛋白质的提取、纯化和处理是用于这些和其他生物材料的体外分析的起始步骤。当前的方法涉及预净化步骤和将这些材料转移至不同的反应容器以避免阻塞诸如分析柱的分析设备以及有时富集期望的生物材料。样品的纯化在诸如结晶学和电子显微镜的生物研究的某些领域被视为是重要的。这些预清洗和样品转移步骤在样品损失、延长的样品制备时间、例如将分析的蛋白质的不期望的改性、污染的引入、在处理有害或传染性材料中的潜在危害以及材料成本方面显示出一些主要缺点。但是,它们通常被视为是不可缺少的。
由于不完全的提取以及与容器表面的扩大接触(其中发生样品吸收),在预清洗粗制的裂解液的步骤中发生样品损失。减少样品损失的当前的解决方案包括非常严密的提取方法和反应管上的低结合表面。
反复的样品转移花费时间;尤其是研究者必须存在和需要处理样品的手工操作。延长的UV光或氧暴露可能损坏样品并且可以导致不期望的化学改性。这些问题的解决方案分别是光保护容器和屏蔽气体的使用。然而,这些措施使样品处理变得更加困难和耗时。此外,在容器之间传递样品期间可能引入污染,并且目前仅可以通过在昂贵的超净工作台、层流下或具有类似的预防措施下工作来避免污染。此外,诸如病原体的有害样品带来污染与样品管接触的人或机器的风险。最后,样品制备中的任何这些低效率以及多于最少量的一次性材料的使用都可以显著地增加处理成本。
包括层析材料的诸如移液吸头的设备在本领域是已知的并且可以从若干制造商购买并且包括Pierce C-18吸头(Thermo Fisher)和C18-SD盒(3M)。这些设备在两端均开口。这样的设备不适合于单反应容器中的样品制备。本文中的样品制备包括从细胞材料制备用于质谱分析的肽和多肽和/或从细胞材料制备用于表达谱的核酸。
Rappsilber等人(Anal Chem.;75(3):663-70(2003))描述了也称为“阶段吸头”的设备,“阶段吸头”在两端均开口并且允许以紧凑的格式层析的性能。
欧洲专利申请EP1033169描述了用于固相萃取的吸附剂盒。根据EP1033169的盒的特征是在吸头的远端处具有开口,该开口标示有标号(18),该开口对于盒的功能是必要的。在远端处提供了固相萃取材料,优选地,以珠子的形式。虽然盖(32)关闭吸附剂盒的近端,但是远端需要是开放的或打开以使原材料与珠子接触。本发明的设备的底部(当使用EP1033169的术语时为“远端”)由闭合或密封的壁制成或者以闭合的接收室的形式提供。然而加载原材料是可能的,即在上(“近”)端。然而,根据EP1033169的样品加载仅当远端开放时是可能的。
发明内容
鉴于本领域中可用的工具和方法的限制,本发明的技术问题可以视为提供用于样品制备的设备和方法,其中,所述样品制备在单反应容器中实现而不用任何转移步骤。
因此,本发明的第一方面涉及用于从细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分纯化和/或富集生物有机化合物的样品制备容器,容器包括反应室和层析介质;其中,所述反应室用于保持所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分,并且配置为使得可以在其中实施以下反应的至少一个:裂解,例如,通过声波处理和/或蒸煮;层析纯化;还原;烷基化;以及诸如蛋白水解的酶促反应;其中,所述层析介质配置为纯化和/或富集所述生物有机化合物;其中,(a)所述层析介质位于所述反应室的壁上,并且所述壁是闭合或密封的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放;或(b)所述样本制备容器还包括用于接收所述生物有机化合物的接收室,所述接收室邻近所述层析介质,从而使得所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开,并且所述接收室的外面是闭合的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放。
具体实施方式
术语“样品”指的是为随后的分析准备的组合物。例如,如果所述生物有机化合物是肽或多肽,优选的随后的分析是通过质谱分析。根据本发明的样品制备容器是用于获得这样的样品的工具。通常来说,所述样品包括或由所述纯化和/或富集的生物有机化合物组成,本文中也称为“分析物”。
通常地,样品制备容器可以是圆锥形的、盒形的或圆柱形的。容器的体积可以适合于从10μl至150μl(包括20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl和100μl)的样品体积以及任何更大的150μl以上的体积。然而,样品制备容器的总体积可以显著高于其适合的体积。例如,在圆锥形容器的情况下,基圆半径可以在1mm和5mm之间(诸如1.5mm、2mm或3mm),并且高度可以在10mm和150mm之间(诸如25mm)。
应该理解,配置为使得可以在其中实施裂解的反应室配置为实施本领域构建的裂解方法,本领域构建的裂解方法包括但不限于超声处理、珠磨和/或蒸煮。
在选择(a)的情况下,制备容器还可以包括接近闭合或密封的壁的连接器,例如,螺旋连接器,以用于连接在外部接收室内。这样的外部接收室包括连接器的相应的配对物,例如,匹配制备容器的内螺纹的外螺纹。外部接收室可以额外地包括打开工具,打开工具配置为当紧紧附接至壁时打开壁。这些工具可以是螺纹的端部处的锐缘的延伸件,当接收室紧拧在制备容器的螺旋连接件中时,延伸件穿透壁。因此,壁可以具有薄壁刚性塑料材料或柔性塑料材料,这两种材料均配置为用所述锐缘的延伸件穿透。
在选择(b)的情况下,接收室的外面,即,接收室的与层析介质和反应室相对的自由端,可以是薄壁,从而使得可以通过剪刀或手术刀剪断。例如,当容器是圆锥形时,外面可以是可分离的圆锥体的尖端以用于获得纯化和/或富集的生物有机化合物。
根据本发明的容器提供了单个反应容器中的样品制备。本发明发现,预清除和样品转移步骤不仅是缺点,而且对于纯化是可有可无的,纯化诸如用于通过基于质谱分析的蛋白质组学的随后的分析的蛋白质水解的多肽或肽富集或纯化。该发现对膜和核酸结合蛋白特别有利,主要是因为这样的蛋白在液体中的完全溶解是困难的并且由于它们的生物化学行为可能甚至在特定情况下是不可能的。特别地,本发明发现,可以在单个反应容器中实施所有样品裂解、样品改性、酶促反应、纯化和富集。该单个容器解决方案显著地减少了样品损失,这在当与极少的样品量一起工作时最为突出。本发明允许非常小的样品量或数量非常少的细胞的分析。此外,在单个容器中实施所有反应减少了处理时间,尤其是手工操作时间。这些改进使具有本领域机械的状态的简单组合的处理步骤的自动化至比先前可能的高得多的程度成为可能。
由于提高的样品制备速度,减少了由样品制备导致的诸如蛋白和核酸的分析物的不期望的改性。高效的工序减少了所需的化学物质的量以及一次性管或吸头的量,从而导致成本降低;因此,处理步骤的自动化减少了手工操作时间、在工作时间方面的成本以及在一次性使用设备方面的成本。
应该理解,术语“包括”包括“由…组成”。同样地,应该理解,当“包括”后面跟随一列试剂时,“包括”提供闭合的一列试剂,但是不排除另外的化合物的存在,其中,化合物不视为是试剂。例如,不视为是试剂的化合物是水。这也适用于缓冲溶液。
在优选的实施例中,所述生物有机化合物或分析物包括以下的至少一种:蛋白;肽;多肽;核酸,例如,脱氧核糖核酸和核糖核酸;包括脂肪酸的脂质;以及代谢物。
通常来说,生物有机化合物是在生物***中自然存在的有机化合物。有机化合物是包括一个或多个碳原子的化合物。生物***可以是包括单细胞有机体和多细胞有机体的有机体、组织、来自有机体或组织的细胞类型、培养中的细胞、诸如细胞器的细胞材料的亚组分,细胞器包括线粒体、叶绿体、溶酶体、过氧化物酶体、高尔基体、内质网、细胞核、核仁、核糖体、微管、中心体与蛋白酶体。此外,生物***包括病毒和它的亚组分。术语“亚组分”包括大分子组合体。
肽和多肽是氨基酸的缩聚物,优选地具有二十个自然存在的氨基酸。通常地,肽包含两个氨基酸和三十个氨基酸之间,而多肽包含多于三十个氨基酸。
核酸是核苷酸的缩聚物。根据本发明的术语“核酸”包括DNA(诸如cDNA和基因组DNA)和RNA。RNA包括所有形式的RNA,包括mRNA、非编码RNA、tRNA和rRNA。非编码RNA的实例包括siRNA、miRNA、复制相关的RNA、小核仁RNA和小核RNA。
术语“脂质”是本领域公知的并且涉及显著地亲脂性/疏水性分子,亲脂性/疏水性分子可以携带极性头基,从而使脂质分子具有两亲性。脂质包括简单的脂质,诸如碳氢化合物(三十烷、角鲨烯、类胡萝卜素)、醇类(蜡醇、视黄醇、胆固醇、线性单或多羟基碳氢化合物,优选地具有两到约30个碳原子)、醚、脂肪酸和诸如单、二和三酰甘油的酯。此外,包括诸如脂蛋白、磷脂和糖脂的复杂脂质。磷脂进而包括甘油磷脂,诸如磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰甘油、心磷脂、双溶血磷脂(lysobisphosphatidic)酸、卵磷脂、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷酸脂(phosphonolipids)。糖脂包括甘油糖脂,诸如单和双半乳糖甘油二酯和硫酸甘油糖脂。根据本发明的术语“脂质”也包括鞘磷脂、鞘糖脂和神经酰胺。
术语“代谢物”通常定义为涉及中间产物的小分子以及代谢和信号传导中的产物。这些包括分类为代谢中间产物、诸如荷尔蒙的信号传导分子和次级代谢物的代谢物。
在进一步优选的实施例中,容器包括盖,所述盖配置为密封反应室的开口和配置为允许样品的给料,例如,通过用针头穿透,以及优选地配置为在给料之后自动再密封。该优选的实施例提供了(完全)闭合的样品制备容器。
盖配置为密封该管的选择容易地使得在必要的地方在屏蔽气体下工作成为可能,这降低了氧化。密封该管也显著地减少了在样品制备期间引入的污染物。干净的密封设备(例如,具有可穿透的橡胶盖)保证了污染物的显著减少。同时,密封的容器也防止样品污染外部,使得与有害或毒性材料一起工作更安全和更可行。
优选地,盖可以与剩余的室熔合,例如,通过超声焊接。可选地,该盖可以粘合至剩余的室。该盖可以是可以通过尖锐的物体(例如,针头或小刀)穿透的任何材料。此外,盖也可以配置为在用尖锐的物体穿透之后再密封。
作为所述盖的可选方案,所述反应室可以是开放的。优选地,开口位于顶部处。在那种情况下,优选地,层析介质位于所述反应室的底部处。术语“顶部”和“底部”是相对于重力的方向进行限定。重力是用于实施层析的优选的驱动力。
在进一步优选的实施例中,所述层析介质的表面配置为用作过滤表面和/或包括另外的过滤层和/或反应层,所述表面或层面向所述反应室的内部。
所述层析介质的表面配置为用作过滤表面和/或包括另外的过滤层和/或反应层的选择允许从样品去除微观和/或介观杂质,并且在一定程度上所述层是反应性的,从而允许实施另外的化学反应。可以通过合并在过滤表面中的网来实施过滤。此外,该网可以涂布有反应性材料,例如,诸如用作反应层的肽-N-糖苷酶(PNGases)的化学反应性基团或酶。可选地,可以通过织物过滤器或纸过滤器来实施过滤。在这种情况下,织物材料或纸也可以涂布或处理有反应性材料。
可选地,所述过滤表面、过滤层和/或反应层可以是可有可无的,特别地,如果所述层析介质构建为实现较低的反压力,诸如通过使用诸如5μm、10μm和以上的较大的层析粒子尺寸或者通过使用诸如小或大孔的聚苯乙烯二乙烯基苯的聚合材料,并且从而提供减小的阻塞风险。
在主要实施例的方面(b)以及以上公开的优选实施例的进一步优选的实施例中,在一定程度上,它们重新提及主要实施例的方面(b),容器还包括密封件,其中,所述密封件配置为密封所述接收室并且配置为获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物。例如,密封件可以位于接收室的外面处并且可以完全代替所述外面。
如对于上述的盖,也优选地,该密封件可以与接收室熔合,例如,通过超声焊接。可选地,所述密封件可以粘合至接收室,如盖可以粘合至反应室。因此,密封件也可以是可以通过尖锐的物体(例如,针头或小刀)穿透的任何材料,并且可以配置为在用尖锐的物体穿透之后再密封。
在进一步优选的实施例中,所述容器包括以下的至少一种:聚丙烯;聚乙烯;配置为传导热、微波、震荡波、声波和/或电的材料;具有低结合表面的材料;透明、不透明或选择性传输电磁辐射(优选地,光,更优选地,UV辐射)的材料。
容器包括配置为传导热、微波、震荡波、声波或电的材料的选择可以增强不同形式的裂解,例如,通过超声处理或蒸煮。配置为传导热的材料可以是金属(例如,铜和/或银和/或金和/或铝)或硬塑料。金属可以涂布在容器的外部或内部处。此外,所述金属也配置为在超声处理的情况下传导震荡波或声波。在将微波应用于容器的情况下,优选地,容器主要包括塑料材料。
在进一步优选的实施例中,样品制备容器的至少一个内壁具有至少部分地低结合和/或低滞留特性,优选地通过至少部分地涂布有聚四氟乙烯。
可选地,低滞留特性可能起因于非常高的液体排斥性,例如,超疏水。可以通过具有高接触角(即,液体和内壁的固相表面之间的角度,优选地,大于150°)的纳米涂布实现高的液体排斥性。也可以通过表面处理实现低滞留特性,例如,通过形成微米尺寸的乳突形结构。
在第二方面中,本发明提供了接收室,接收室配置为连接至根据主要实施例的项目(a)的根据本发明的样品制备容器,并且配置为接收纯化和/或富集的生物有机化合物。
在第二方面的优选实施例中,所述接收室包括连接元件,优选地为螺纹,螺纹配置为连接至根据主要实施例的项目(a)的根据本发明的样品制备容器的相应的连接元件,优选地,相应的螺纹。
本发明的这个方面提供了单独的接收室,在一定程度上,根据本发明的样品制备容器还未包括这样的接收室。可以实现接收纯化和/或富集的生物有机化合物的上述配置,从而使得当连接至所述样品制备容器时,所述接收室通过所述层析介质与所述容器中的反应室分隔开。此外以及类似于主要实施例的项目(b),根据第二方面的接收室是闭合的,除了提供配置以接收纯化和/或富集的生物有机化合物的那些部件之外,可以通过上述连接元件实现该配置。闭合的外面优选地配置成为从所述接收室获得纯化和/或富集的生物有机化合物而是开放的。
图1示出了根据本发明的样品制备容器100的示例性实施例。样品制备容器100包括自动密封的橡胶盖或橡胶塞101、反应室102、用作过滤表面103的层析介质104的表面。密封件105用于在样品裂解之前完全密封反应室102。
可以通过一根或若干针头穿透自动密封的橡胶盖或橡胶塞101以引入样品、化学物质或屏蔽气体。此外,橡胶盖或橡胶塞101在去除针头之后重新密封。反应室102构建为用于特定反应,诸如通过超声处理的细胞裂解、蛋白烷基化(例如,通过碘乙酰胺)和蛋白水解。反应室102优选地由聚丙烯或聚乙烯形成。样品制备容器100的内壁优选地具有低滞留特性。因此,它可能涂布有聚四氟乙烯(PTFE)。
接近反应室102的是层析介质104,层析介质104用于结合、纯化感兴趣的细胞材料和/或感兴趣的细胞材料位于层析介质104中。在该上下文中,基质可以设计为实施多维层析,可以通过使用层析介质的多个堆叠件实现多维层析。层析介质后的表面103用作过滤表面。然而,其他表面也可以应用于层析介质的表面103的顶部上,例如,诸如微孔过滤器的非结合过滤基质。
在与自动密封的橡胶盖101相对的样品制备容器100的端部处,形成密封件105,密封件105用于在样品裂解之前完全密封反应室。由于样品制备容器由聚乙烯形成,可以通过一对剪刀或刀打开密封件,从而使得随后可以实施冲洗、纯化和洗脱步骤。因此,优选地,与剩余的样品制备容器100相比,样品制备容器100的这部分处的壁的厚度降低。
在这个实施例中,样品制备容器100是圆锥形的。因此,与仅是圆柱体的样品制备容器100相比,可以通过剪刀容易地移动密封件105。
图2示出了根据本发明的包括样品制备容器100和接收室200的***的示例性实施例。在这个实施例中,样品制备容器100可以具有圆柱形。代替位于自动密封的橡胶盖/橡胶塞101的相对侧上的密封件105,样品制备容器100包括闭合和密封的壁107,其中,该壁107配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放。因此,与样品制备容器100的其他壁相比,壁107具有较小厚度。因此,可以用任何锐缘的物体容易地穿透壁107。
图2还示出了接收室200,接收室200配置为从样品制备容器100接收所述纯化和/或富集的生物有机化合物。接收室200的上侧可以因此是开放的。可选地,接收室的上侧是密封的,并且在接收室200从样品制备容器100接收所述纯化和/或富集的生物有机化合物之前立即打开密封件。
样品制备容器100还包括位于壁107附近的螺纹108,螺纹108配置为与外部的接收室200的相应的螺纹连接。为了与样品制备容器100连接,接收室200包括与样品制备容器100的相应的螺纹108配合的螺纹208。此外,接收室200的螺纹208在螺纹208的端部处具有锐缘的延伸件208a,锐缘的延伸件208a面向样品制备容器100。当接收室200通过螺纹108和208的螺旋连接而连接至样品制备容器100时,锐缘的延伸件208a穿透样品制备容器的壁107,并且可以通过穿透的壁107接收纯化和/或富集的生物有机化合物。
在接收生物有机化合物之后,可以分离接收室200以用于进一步使用。
在第三方面中,本发明提供了从细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分制备纯化和/或富集的生物有机化合物的方法,所述方法包括(a)将所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分引入容器的反应室内,所述容器还包括层析介质和接收室,所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开,其中,所述接收室的外面是闭合的并且配置成为获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物而开放;(b)在所述反应室内使所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分破裂;以及(c)允许步骤(b)的产物穿过所述层析介质,从而在所述接收室中获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物,其中,生物有机化合物包括以下中的至少一种:蛋白质;肽;多肽;诸如脱氧核糖核酸和核糖核酸的核酸;包括脂肪酸的脂质和代谢物;并且其中,仅仅在所述容器中实施所述方法。
可以通过包括注入针头的任何工具实现所述引入,优选地,在所述容器的反应室用盖(优选地,自动密封的橡胶盖)关闭的情况下使用注入针头。特别是在所述反应室是开放的而不是由盖关闭的那些情况下,其他引入工具包括移液管。
术语“破裂”具有如本领域构建的意思。它指的是所述细胞材料、病毒和/或它们的亚组分的破碎,从而使得所述细胞材料、病毒和/或它们的亚组分的内部成分可用于分析。下面进一步详细描述破裂的优选工具。
根据步骤(c)的所述允许可以包括或由以下步骤组成:放置容器,使得反应室位于层析介质之上,从而使得重力、离心力和/或增大的压力提供步骤(b)的产物穿过所述层析介质;和/或打开接收室,该打开不仅可以提供使步骤(b)的产物穿过层析介质,而且除此之外获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物。术语“获得”指的是从接收室脱除所述纯化和/或富集的生物有机化合物,例如,用于分析的目的。
本发明的关键方面在于,一旦根据步骤(a)引入所述细胞材料、病毒和/或它们的亚组分,仅仅在所述容器中实施该方法。这避免了如以上本文中的背景部分中详述的可能引起样品损失或污染的累赘的转移步骤。图3提供了与本领域构建的工序相比的优越性能的证据。在实例2中示出了实际应用。方法能够识别和定量诸如这个实例(酿酒酵母和裂殖酵母)中描述的那些的整个蛋白质组。如本发明提供的改进的精确度尤其允许评估整个蛋白质组的蛋白质拷贝数。拷贝数值对***生物学、***建模(它们提供蛋白质的初始和/或稳态量)以及诸如蛋白质降解的生物活性的监测尤其有用。
在优选的实施例中,通过以下方法实现所述破裂:(a)超声处理;(b)在离液剂和/或变性剂的存在下蒸煮;和/或(c)在诸如研磨珠的物理试剂的存在下珠磨。这些是破裂的常用方法并且可以通过本领域技术人员采用而没有另外的麻烦。
在本发明的第一方面和第三方面的优选的实施例中,所述层析介质包括(a)以下材料中的至少一种:反相材料、阳离子交换材料、阴离子交换材料、混合模式离子交换材料、离子络合材料、抗体偶联和/或凝集素偶联的亲和偶联基质;和/或(b)不同层析介质的两个或多个堆叠件。
优选的层析材料是反相材料聚苯乙烯二乙烯基苯、如实例1中使用的C4、C8、C18材料、诸如磺化结合表面的阳离子交换材料以及诸如作为结合表面的季铵离子的阴离子交换材料。
当使用根据第一方面的所述容器和/或实施根据第三方面的方法的步骤(c)时,不同层析介质的两个或多个堆叠件或层可以用于执行两个或多个层析步骤。
在根据第一方面的容器或根据第三方面的方法的进一步优选的实施例中,(a)所述生物有机化合物包括蛋白质、肽和/或多肽,并且所述容器的特征为以下(i)至(iv)中的一个、两个、三个或全部:(i)所述容器包括蛋白酶,(ii)所述容器包括烷化剂;(iii)所述容器包括用于质谱分析的标准物;和(iv)所述容器中的pH值介于8和9之间,优选8.5;和/或(b)所述生物有机化合物包括核酸,并且所述容器的特征为以下的一个、两个或全部:(i)所述容器包括一种或多种核酸酶,优选地包括核酸内切酶;(ii)所述容器包括用于核酸扩增的试剂,优选地通过PCR,和(iii)所述容器中的pH值介于8和9之间,优选8.5。
在根据第一方面的容器或根据第三方面的方法的另一优选的实施例中,(a)所述生物有机化合物包括一种或多种蛋白质、肽和/或多肽,并且所述容器的特征为以下(i)至(viii)中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部:(i)所述容器包括洗涤剂,优选为SDC;(ii)所述容器包括还原剂,优选为TCEP;(iii)所述容器包括烷化剂,优选为氯乙酰胺;(iv)所述容器中的pH值介于7和9之间,优选8和9,更优选8.5;(v)所述容器包括用于质谱分析的标准物;(vi)所述容器包括离液剂,优选为GdmCl;(vii)所述容器包括分析物稳定化学物质,诸如抗氧化剂和/或UV吸收剂;和(viii)所述容器包括选自以下酶的至少一种酶:蛋白酶,优选胰蛋白酶和/或Lys-C;糖苷酶,优选PNGase F;和激酶;和/或(b)所述生物有机化合物包括核酸,并且所述容器的特征为以下的一个、两个或全部:(i)所述容器包括一种或多种核酸酶,优选地包括核酸内切酶;(ii)所述容器包括用于核酸扩增的试剂,优选地通过PCR,和(iii)所述容器中的pH值介于8和9之间,优选8.5;和/或(b)所述生物有机化合物包括核酸,并且所述容器的特征为以下的一个、两个或全部:(i)所述容器包括一种或多种核酸酶,优选地包括核酸内切酶;(ii)所述容器包括用于核酸扩增的试剂,优选地通过PCR,和(iii)所述容器中的pH值介于7和9之间,优选地介于8和9之间,更优选地为8.5。
以优选的顺序呈现了项目(a)的以上子项目(i)至(viii)。
取决于应用的类型和/或要纯化和/或富集的生物有机化合物的类型,所述容器可以预填充有一种或多种试剂,该试剂对于考虑中的特定类别的生物有机化合物的纯化和/或富集是有用的、需要的和/或特定的。项目(a)提供了适合于蛋白质、肽和/或多肽的纯化和/或富集的试剂和/或条件。
优选的洗涤剂是脱氧胆酸钠(SDC)。
优选的还原剂是TCEP。
优选的烷化剂是碘乙酰胺和氯乙酰胺。特别优选的是氯乙酰胺(CAA)。
特别优选的是烷化剂氯乙酰胺和还原剂TCEP的组合使用。
可以通过用缓冲材料预填充容器来构建分别根据项目(a)或(b)的pH值,缓冲材料以缓冲水溶液的形式或以制备缓冲溶液所需的干成分的形式。
用于质谱分析的优选标准物是WO2011/042467中描述的SUPER-SILAC标准物。通常地,所述标准物展示的同位素分布偏离自然存在的同位素分布。例如,它可以相对于重或轻同位素富集。优选地,并且如WO2011/042467中公开的,通过用于制备标准物混合物的方法获得这样的标准物,标准物混合物用于定量样品中的一种或多种第一生物分子,方法包括从至少两种不同的细胞种群的混合物提取包括一种或多种参考生物分子的多个第二生物分子,其中,所述至少两种不同的细胞种群是以下细胞的种群:(i)细胞类型不同的细胞,(ii)来自不同细胞系的细胞;(iii)不同细胞谱系的细胞;或(iv)来自不同细胞培养物的细胞,其中,培养物已经经受不同的培养条件,其中,所述一种或所述多种参考生物分子是所述一种或多种第一生物分子的代谢同位素标记的形式,并且其中,所述生物分子是蛋白质或肽。
如从该优选的实施例是显而易见的,预填充的样品制备容器是特别感兴趣的。假定以上公开的优选实施例的项目(a)提供了特定选择中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部,该声明内在地指定在所述样品制备容器中构建的试剂或条件的有限数量的子组合。以下是特别优选的子组合。下面给出的每个子组合与生物有机化合物(本文中也称为“分析物”)相关,生物有机化合物是或包括一种或多种蛋白质、肽和/或多肽。
优选的酶是蛋白酶。优选的蛋白酶是Lys-C、胰蛋白酶、AspN、GluC和胰凝乳蛋白酶的一种或组合。如上公开的,胰蛋白酶和Lys-C中的单独的一个或它们的组合是特别优选的。
如从该优选的实施例是显而易见的,预填充的样品制备容器是特别感兴趣的。假定以上公开的优选实施例的项目(a)提供了特定选择中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部,该声明内在地指定在所述样品制备容器中构建的试剂或条件的有限数量的子组合。以下是特别优选的子组合。下面给出的每个子组合与生物有机化合物(本文中也称为“分析物”)相关,生物有机化合物是或包括一种或多种蛋白质、肽和/或多肽。
(1)样品制备容器,其中,所述容器包括优选地作为仅有的试剂的烷化剂、还原剂、洗涤剂,并且所述容器中的pH值介于8和9之间。特别优选的是pH8.5的包括优选地作为仅有的试剂的CAA、TCEP、SDC和Tris缓冲液的样品制备容器。
(2)以上实施例(1),其中,所述容器还包括用于质谱分析的标准物,优选地为SILAC标准物或SUPER-SILAC标准物。
(3)根据(1)或(2)的实施例,此外包括糖苷酶,优选的糖苷酶为PNGase F。
根据以上公开的优选实施例,所述特别优选的实施例(1)至(3)同时限定根据本发明的方法的也是优选的实施方式。如本文中公开的,优选地,在实施蛋白水解之前立即(即,在已经实现裂解、还原和烷基化之后)添加蛋白酶或蛋白酶的混合物。
因此,应该理解,本发明在另外的方面中提供了闭合的样品制备容器,所述容器包括反应室和层析介质;其中,所述反应室包括优选地作为仅有的试剂的烷化剂、还原剂、洗涤剂,并且所述容器中的pH值介于8和9之间;其中(a)所述层析介质位于所述反应室的壁处,并且所述壁是闭合或密封的,并且配置为开放式的;或(b)所述样品制备容器还包括接收室,所述接收室邻近所述层析介质,从而使得所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开,并且所述接收室的外面是闭合的并且配置为开放式的。特别优选的烷化剂、还原剂和洗涤剂以及pH值是如以上本文中限定的根据特别优选的实施例(1)至(3)的那些。
根据项目(b)的优选的核酸是mRNA。以用于核酸扩增的所述试剂实施的优选反应是产生RNA Poly(A)库,RNA Poly(A)库用于包括在所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分中的多种mRNA的RNA-seq(本领域也称为“RNA深度测序”)分析。用于核酸扩增的优选试剂是RT-PCR合适的盐、脱氧核苷酸(dNTP)、引物(通常为poly-dT引物)和逆转录酶。
在本发明的第一方面和第三方面的进一步优选的实施例中,所述容器还包括(a)以下化学物质的至少一种:研磨珠、洗涤剂(优选地为已知的不干扰层析的洗涤剂)、诸如尿素、硫脲和盐酸胍(GdmCl)的离液剂、诸如碘乙酰胺和氯乙酰胺的烷化剂、诸如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧甲基)磷酸(TCEP)的还原剂、诸如乙腈或甲醇的有机溶剂、诸如以上进一步描述的诸如SUPER-SILAC混合物的用于质谱分析的标准物;和/或(b)以下酶中的至少一种:蛋白酶、核酸酶、脱羧酶。
优选的离液剂是GdmCl。
在本发明的第一方面和第三方面的进一步优选的实施例中,(a)所述细胞材料是以下之一:完整的细胞、非澄清的细胞裂解液、组织、病原菌;和/或(b)所述亚组分是亚细胞结构,特别是细胞器。以上进一步提到了示例性细胞器。
应该理解,非澄清的细胞裂解液包括碎片,这样的碎片通常在使所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分破裂的过程中形成。
在本发明的方法的进一步优选的实施例中,在一定程度上,所述生物有机化合物是蛋白质、肽或多肽,所述方法的步骤(b)还包括还原和烷基化。
在本发明的方法的进一步优选的实施例中,所述方法的步骤(b)还包括蛋白水解消化。优选地,在还原和烷基化之后实现蛋白水解消化。进一步优选地,在实施所述蛋白水解消化之前立即(即,在已经实现还原和烷基化之后)将蛋白水解消化所需的一种或多种蛋白酶添加到容器或反应混合物中。在一定程度上,本发明涉及预填充的样品制备容器,即,样品制备容器已经包括一种或多种试剂,因此优选地,蛋白酶不在预填充的样品制备容器中所包括的试剂中。
在进一步优选的实施例中,通过以下步骤实现在所述接收室中获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物:(i)允许步骤(b)的产物进入和保留在所述层析介质中,和(ii)洗脱所述生物有机化合物。
一旦所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分已经破裂,并且优选地也经受以上本文中详细描述的进一步处理步骤,所述优选的进一步处理步骤包括还原、烷基化和蛋白水解消化,允许存在于所述反应室中的混合物穿过所述层析介质。通常地,高分子量材料(在处理的这个阶段视为污染物)将保留在反应室内,更具体地,在面向所述反应室的层析介质的表面处。另一方面,低分子量化合物(诸如盐和此外的还原剂和烷化剂,在一定程度上它们可以存在)将穿过至层析介质。层析介质将通常保留生物有机化合物,优选地,所述肽、多肽和肽。在一定程度上已经实现了蛋白水解消化,在处理的这个阶段的所述生物有机化合物将通常以肽的形式存在。为了根据以上公开的优选的实施例的步骤(ii)的洗脱的目的,可以使用例如在Rappsilber等人(loc.cit.)中描述的本领域构建的洗脱液。为了提供优选的实例,我们注意到,在层析介质是诸如C18或C8材料的反相材料的情况下,可以使用乙腈或甲醇。在SCX已经用作层析材料的情况下,可以使用氨、醋酸铵或铵格式。在SAX已经用作层析介质的情况下,可以使用甲酸、乙酸和/或氯化钠。在没有其他麻烦的情况下并且取决于层析介质,可以由本领域技术人员选择另外的洗脱液。
在根据本发明的第三方面的方法的进一步优选的实施例中,所述容器是根据本发明的第一方面的实施例(b)的容器。
在第四方面中,本发明提供了包括或由以下物质组成的试剂盒:(a)根据本发明的第一方面的样品制备容器;和(b)(i)蛋白酶、烷化剂、用于质谱分析的标准物和/或用于在所述容器中构建介于8和9之间(优选8.5)的pH值的工具;和/或(ii)核酸酶,优选核酸内切酶;和/或用于核酸扩增的试剂,优选通过PCR。
与此相关的,本发明提供了包括或由以下物质组成的试剂盒:(a)根据本发明的第一方面的样品制备容器;和(b)(i)蛋白酶,优选胰蛋白酶和/或Lys-C;烷化剂,优选氯乙酰胺;还原剂,优选TCEP;用于质谱分析的标准物;离液剂,优选GdmCl;或洗涤剂,优选SDC;和/或用于在所述容器中构建为介于7和9之间(优选8和9,更优选8.5)的pH值的工具;和/或(ii)核酸酶,优选核酸内切酶;和/或用于核酸扩增的试剂,优选通过PCR。
如上进一步解释的,根据本发明的容器可以预填充有一种或多种试剂。作为替代方案,空的或仅部分预填充的容器可以提供作为根据本发明的试剂盒的组分(a),同时适合于纯化和/或富集给定的生物有机化合物的试剂可以提供作为根据本发明的试剂盒的单独的另外的组分。
在试剂盒的优选的实施例中,试剂盒还包括(a)以下化学物质的至少一种:珠磨材料、洗涤剂、离液剂、诸如碘乙酰胺的烷化剂、还原剂、有机溶剂、用于质谱分析的标准物;(b)以下酶的至少一种:蛋白酶、核酸酶、激酶、糖苷酶;和/或(c)具有用于实施根据本发明的第三方面的方法的使用说明的手册。
在试剂盒的优选的实施例中,试剂盒还包括(a)以下化学物质的至少一种:珠磨材料、洗涤剂、离液剂、诸如碘乙酰胺的烷化剂、还原剂、有机溶剂、抗氧化剂、UV吸收剂、用于质谱分析的标准物;(b)以下酶的至少一种:蛋白酶、核酸酶、激酶、糖苷酶;和/或(c)具有用于实施根据本发明的第三方面的方法的使用说明的手册。
在第五方面中,本发明提供了一种***,包括:(a)根据主要实施例的项目(a)的根据本发明的样品制备容器;和(b)根据本发明的第二方面的接收室。
图示出:
图1:根据本发明的样品制备容器的示例性实施例。下面是由参考标号标示的元件的描述。
(100)样品制备容器。
(101)可以通过一根或多根针头穿透自动密封的橡胶盖或橡胶塞以引入样品、化学物质或屏蔽气体。在去除针头之后,橡胶塞重新密封。
(102)反应室构建为用于特定反应,诸如通过超声处理的细胞裂解、蛋白烷基化(例如,通过碘乙酰胺)和蛋白水解。
(103)层析介质的表面用作过滤表面。其他表面可以应用在过滤表面的顶部上或代替过滤表面,例如,诸如微孔Millipore过滤器的非结合过滤基质。
(104)层析介质用于结合、纯化和富集感兴趣的细胞材料。基质可以设计为实施多维层析,可以通过使用层析介质的多个堆叠件实现多维层析。
(105)密封件用于在样品裂解之前完全密封反应室。可以打开密封件以用于冲洗、纯化和洗脱步骤。
图2:根据本发明的包括样品制备容器和接收室的***的示例性实施例。下面是由参考标号标示的元件的描述。
(100)样品制备容器。
(101)可以通过一根或多根针头穿透自动密封的橡胶盖或橡胶塞以引入样品、化学物质或屏蔽气体。在去除针头之后,橡胶塞重新密封。
(102)反应室构建为用于特定反应,诸如通过超声处理的细胞裂解、蛋白烷基化(例如,通过碘乙酰胺)和蛋白水解。
(103)层析介质的表面用作过滤表面。其他表面可以应用在过滤表面的顶部上或代替过滤表面,例如,诸如微孔Millipore过滤器的非结合过滤基质。
(104)层析介质用于结合、纯化和富集感兴趣的细胞材料。基质可以设计为实施多维层析,可以通过使用层析介质的多个堆叠件实现多维层析。
(107)闭合和密封的壁,该壁配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放。
(108)螺纹(例如,内螺纹)配置为与相应的螺纹(例如,外螺纹)连接。
(200)接收室配置为接收所述纯化和/或富集的生物有机化合物。所述接收室的上侧可以是开放的或密封的。
(208)螺纹(例如,外螺纹)配置为与相应的螺纹(例如,内螺纹)连接。
(208a)锐缘的延伸件,位于接收室的螺纹的端部,当接收室的螺纹紧拧在制备容器的相应的螺纹中时,锐缘的延伸件穿透样品制备容器的壁。
图3:本发明的方法与公布的基于SDC的溶液中解决方案的比较。后面的方法是根据本领域的现状的优选的方法;见Leon等人(Molecular&cellular proteomics 12(10),2992(2013))。示出了由技术三份±s.e.m表示的中位数独特的肽。
图4:深度S.啤酒酵母蛋白质组和拷贝数评估的定量再现性。
(a)由四种生物复制表示的蛋白质的频率。在所有四份中识别的蛋白质指定为核心蛋白质组。(b)跨越四种生物复制中的整个动态范围的五种代表性蛋白质的MS-信号(来自MaxQuant输出的非标记定量(LFQ)强度)。(c)单发分析中确定的LFQ强度与6片段分析中确定的LFQ强度的比较。
图5:酵母蛋白质组的深度覆盖度和酵母拷贝数的评估。(a)、(b)和(c)基于S.啤酒酵母数据集。(d)和(e)基于S.裂殖酵母数据集。
(a)对最深的实验S.啤酒酵母蛋白质组使用6片段iST-SCX分析的识别的蛋白质的比较(Peng等人,Nature methods 9(6),524(2012))。(b)使用6片段iST-SCX分析评估的拷贝数与使用21合成肽标准物报告的拷贝数的相关性(Picotti等人,Cell 138(4),795(2009))。(c)评估的拷贝数的分布。垂直红线表示每个细胞100拷贝。蓝框代表在6片段iST-SCX分析中独特识别的蛋白质。(d)使用6片段iST-SCX分析的识别的蛋白质与呈现S.裂殖酵母的最深蛋白质组的近期研究中报道的蛋白质的比较(Gunaratne等人,Molecular&cellular proteomics(12(6):1741-51(2013))。(e)使用6片段iST-SCX分析评估的拷贝数与S.裂殖酵母的另一近期深度分析中报道的拷贝数的相关性(Marguerat等人,Cell 151(3),671(2012))。
以下实例示出了本发明但是不应解释为限制。
实例1:
用于使用质谱的蛋白质组学分析的肽的纯化
已经在使用完全密封的管或仅在一侧处密封的管(通常在底部,底部分别是接收室的位置或可以附接接收室的位置)的蛋白质组学的领域中测试了***。在所述的管内以及在对管内裂解没有任何显著的缺点的管外侧裂解细胞。包含的蛋白质被蛋白水解消化,并且在反相纯化基质C18(嵌入在铁氟龙材料中)的表面上过滤粗制的污染物。在C18材料上使肽富集和脱盐。干净的肽被从C18材料洗脱并且随后通过LC-MS/MS分析。
结果示出高稳定性和样品量方面的按比例增加或减少的能力。效率高度增加,从而使得未观察到损失。该方法的效率使较少的单细胞的处理成为可能,如通过数量尽可能少的500HeLa S3细胞的处理示出的,这通过本领域技术的建立的状态是不可能的。与当前方法相比,处理速度高度增加,其中,相比于本领域方法的其他状态的至少约4h时间或更通常的12h,在1h时间内完成样品制备。由于每个步骤均简化并且故障的来源被减少至最小,所以不需要内行的知识。观察到分析物的非常少的不期望的改性(氧化、通过UV光的改性等)。通过LC-MS分析观察到可再现的高识别率(60%的MS/MS ID速率)。也当与少量样品一起工作时,污染物的量显著减少。由于先前已知的工序所需的一个或多个转移步骤,聚合物或塑料可以作为污染源出现。样品制备可以涉及与诸如DTT和碘乙酰胺的有害和有毒的化学物质一起工作,这些化学物质可以提供在本发明的预填充和密封的容器中,从而减小损害的风险。可以用于生产反应容器的单独的材料是众所周知的且已被描述,并且可以以非常便宜的方式结合。***的自动化版本是可行的并且可以容易地实施。
实例2:
S.啤酒酵母和S.裂殖酵母中的拷贝数
蛋白质拷贝数对于生物和***生物群落来说是非常感兴趣的,并且我们推断,流线型的、精简的样品处理方法可以提供特别客观的值。为了在良好特点的酵母模型***上评估精简的样品处理方法,我们在四个生物复制品中生长S.啤酒酵母,并且以96孔格式平行处理它们(100μL培养物,OD600=0.8)。以高定量再现性在四个复制品中的至少三个中检测了它们的四个单行分析一起识别的4270种可区分的蛋白质组和它们的显著的97%(总中位数序列覆盖度:34.4%,独特的肽的总数ID:46125,图4a、图4b)。在以单行模式的我们的近期酵母蛋白质组分析中,使用相同的下游LC-MS-MS装置(Nagaraj e等人,Molecular&cellular proteomics:MCP 11(3),M111013722(2012)),每个单独的运行中的平均识别为4084蛋白质组(33122±405序列独特的肽识别,中位数序列覆盖度23.4%),而精简的处理方法产生更高的数目(4144种蛋白质组,37880±1771种序列独特的肽,中位数序列覆盖度27.2%)。
酵母样品的SCX片段直接从反应设备至六个自动样品瓶,随后是与之前基本上相同的LC-MS/MS分析,定量4577种蛋白质组,迄今报道的最大表达的酵母蛋白质组。重要的是,我们不识别656个可疑的开放阅读框中的任何一个,其不认为代表表达的信息或蛋白质。非标记强度值与单行分析(R2=0.91)的那些的极好相关性表明,阶段中顶部片段不引入任何偏离,即使在非常低强度的区域(图4c)。
指数生长的S.啤酒酵母的最深的先前蛋白质组使用五种不同的蛋白水解酶以及肽的大量的基于柱的SCX片段(Peng等人,Nature methods 9(6),524(2012))。我们的单个六片段数据集主要包括先前的研究(94.9%)和添加的400种蛋白质,其中,内在的膜蛋白显著富集(p=9.4×10-6)(图5a)。我们接着将每个蛋白质的非标记MS信号用作蛋白质组的总MS信号的片段(Wisniewski等人,Molecular systems biology 8,611(2012))以评估4570种酵母蛋白质的拷贝数。先前已经使用合成肽标准物6构建了用于21种酵母蛋白质的拷贝数,并且我们的值在预期的不确定性内良好地吻合(R2=0.82)(图5b)。每个细胞的1.6×106拷贝的大多数丰富的酵母蛋白质是糖解酶Tdh3p,糖解酶Tdh3p在三个基因位点编码。中位数酵母蛋白质具有每个细胞的约800拷贝,并且包含2000倍的拷贝数范围的超过90%的蛋白质。六ORC复合成分具有中位数拷贝数332±150,与S.啤酒酵母中的复制的评估的500起源有趣的相关(Nieduszynski等人,Nucleic acids research 35(Database issue),D40(2007))。
我们好奇的是,超过763种酵母蛋白质在每个细胞中具有小于100的拷贝(图5c),比酵母拷贝数的分类研究中比例大得多(Ghaemmaghami等人,Nature 425(6959),737(2003))。该种群在GO期细胞周期过程和DNA修复中显著富集(分别是p<9×10-10和<1.8×10-4)。
对于非常低丰度的蛋白质,弱MS信号可以引起不确定性,然而,对于后期促进复合物(APC)的成员,我们测量了大体一致的拷贝数,指示为每个细胞约30APC。仅存在于特定细胞状态的蛋白质通常发现非常低的表观拷贝数,诸如100拷贝的细胞周期蛋白CLB2(G2/M阶段)或约50拷贝的激酶抑制剂FAR1(G1阶段)。这示出,我们的数据集已经包括来自若干不同的蛋白质组学状态的贡献。
S.裂殖酵母在超过4亿年前与S.啤酒酵母分支并且提供感兴趣的比较模型。那个有机体的最深的蛋白质组学研究最近采用若干生长条件和大量的正交片段以识别3542种蛋白质(Gunaratne等人,Molecular&cellular proteomics:MCP(2013))。仅对指数生长的细胞使用六片段方法,我们针对相同的数据库搜索获得4087种蛋白质。这表示S.裂殖酵母ORF的80%并且覆盖先前蛋白质组的96.5%以及670种额外的通常低丰度的蛋白质(图5d)。参考另一深S.裂殖酵母蛋白质组(Marguerat等人,Cell 151(3),671(2012)),我们的S.裂殖酵母拷贝数与34种蛋白质所报道的那些非常好地吻合,对于该34种蛋白质,已经合成了同位素标记的标准物(R2=0.89),并且针对任何蛋白质类别没有明显的偏离,包括内在的膜蛋白(图5e)。最丰富的蛋白质在每个细胞中具有约106拷贝,类似于S.啤酒酵母,但是低于100拷贝的比例大幅降低(17%与3%相对)。中位数拷贝数为5137,比S.啤酒酵母高约6倍。对于复制叉处理和DNA修复相关的蛋白质,最低表达的5%蛋白质组显著富集(分别为p<1.1×10-6和<1.2×10-6)。蛋白质组的该片段包含许多目前未定性的S.裂殖酵母ORF(207种蛋白质中的59种;p<3.9×10-5)。
Claims (20)
1.用于从细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分纯化和/或富集生物有机化合物的样品制备容器,所述生物有机化合物包括一种或多种蛋白质、肽和/或多肽;
所述容器包括反应室和层析介质;
其中,所述反应室用于保持所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分,并且将所述反应室配置为使得在所述反应室中可以实施以下反应的至少一个:裂解;层析纯化;还原;烷基化;以及酶促反应;
其中,所述层析介质配置为纯化和/或富集所述生物有机化合物;
其中,
所述样本制备容器还包括用于接收所述生物有机化合物的接收室,所述接收室邻近所述层析介质,从而使得所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开,并且所述接收室的外面是闭合的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放;
其中,所述容器包括用于质谱分析的标准物;并且
所述容器的特征为以下(i)至(vii)中的一项、两项、三项、四项、五项、六项或全部:
(i)所述容器包括洗涤剂;
(ii)所述容器包括还原剂;
(iii)所述容器包括烷化剂;
(iv)所述容器中的pH值介于7和9之间;
(v)所述容器包括离液剂;
(vi)所述容器包括分析物稳定化学物质;和
(vii)所述容器包括选自以下酶的至少一种酶:蛋白酶;糖苷酶;和激酶。
2.根据权利要求1所述的样品制备容器,其中,所述生物有机化合物进一步包括以下的至少一种:核酸;包括脂肪酸的脂质;以及代谢物。
3.根据权利要求1或2所述的样品制备容器,其中,所述样品制备容器还包括:盖,所述盖邻近所述反应室并且配置为允许样品的给料。
4.根据权利要求1所述的样品制备容器,其中,所述层析介质的表面配置为用作过滤表面和/或包括另外的过滤层和/或反应层,所述表面、所述过滤层和/或所述反应层面向所述反应室的内部。
5.根据权利要求1所述的样品制备容器,还包括密封件,其中,所述密封件邻近所述接收室并且配置为用于获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物。
6.根据权利要求1所述的样品制备容器,其中,所述容器包括以下的至少一种:聚丙烯;聚乙烯;配置为传导热、微波、震荡波、声波和/或电的材料;具有低结合表面的材料;透明、不透明或选择性传输电磁辐射的材料。
7.根据权利要求1所述的样品制备容器,其中,所述样品制备容器的至少一个内壁具有至少部分地低结合和/或低滞留特性。
8.根据权利要求1所述的样品制备容器,其中,所述层析介质包括:
(a)以下材料中的至少一种:反相材料、阳离子交换材料、阴离子交换材料、混合模式离子交换材料、离子络合材料、抗体偶联和/或凝集素偶联的亲和偶联基质;和/或
(b)不同层析介质的两个以上的堆叠件。
9.根据权利要求1所述的样品制备容器,所述容器还包括:
(a)以下化学物质的至少一种:研磨珠、洗涤剂、离液剂、烷化剂、还原剂、有机溶剂、用于质谱分析的标准物;和/或
(b)以下酶中的至少一种:蛋白酶、核酸酶、脱羧酶。
10.根据权利要求1所述的样品制备容器,其中,
(a)所述细胞材料是以下之一:完整的细胞、非澄清的细胞裂解液、组织、病原菌;和/或
(b)所述亚组分是亚细胞结构。
11.一种从细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分制备纯化和/或富集的生物有机化合物的方法,所述方法包括:
(a)将所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分引入容器的反应室内,所述容器还包括层析介质和接收室,所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开,其中,所述接收室的外面是闭合的并且配置成为获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物而开放;
(b)在所述反应室内使所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分破裂;以及
(c)允许步骤(b)的产物穿过所述层析介质,从而在所述接收室中获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物;
其中,生物有机化合物包括以下的至少一种:蛋白质;肽;多肽;
其中,仅仅在所述容器中实施所述方法;并且
所述步骤(b)还包括还原、烷基化和蛋白水解消化。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述破裂通过以下步骤实现:
(a)超声波处理;
(b)在离液剂和/或变性剂的存在下蒸煮;和/或
(c)在物理试剂的存在下珠磨。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其中,所述层析介质包括:
(a)以下材料中的至少一种:反相材料、阳离子交换材料、阴离子交换材料、混合模式离子交换材料、离子络合材料、抗体偶联和/或凝集素偶联的亲和偶联基质;和/或
(b)不同层析介质的两个以上的堆叠件。
14.根据权利要求11所述的方法,其中,
(a)所述容器的特征为以下(i)至(viii)中的一项、两项、三项、四项、五项、六项、七项或全部:
(i)所述容器包括洗涤剂;
(ii)所述容器包括还原剂;
(iii)所述容器包括烷化剂;
(iv)所述容器中的pH值介于7和9之间;
(v)所述容器包括用于质谱分析的标准物;
(vi)所述容器包括离液剂;
(vii)所述容器包括分析物稳定化学物质;和
(viii)所述容器包括选自以下酶的至少一种酶:蛋白酶;糖苷酶;和激酶;
和/或
(b)所述生物有机化合物进一步包括核酸,并且所述容器的特征为以下的一项、两项或全部:
(i)所述容器包括一种或多种核酸酶;
(ii)所述容器包括用于核酸扩增的试剂,和
(iii)所述容器中的pH值介于7和9之间。
15.根据权利要求11所述的方法,所述容器还包括:
(a)以下化学物质的至少一种:研磨珠、洗涤剂、离液剂、烷化剂、还原剂、有机溶剂、用于质谱分析的标准物;和/或
(b)以下酶中的至少一种:蛋白酶、核酸酶、脱羧酶。
16.根据权利要求11所述的方法,其中,
(a)所述细胞材料是以下之一:完整的细胞、非澄清的细胞裂解液、组织、病原菌;和/或
(b)所述亚组分是亚细胞结构。
17.根据权利要求11所述的方法,其中,通过以下步骤实现在所述接收室中获得所述纯化和/或富集的生物有机化合物:
(i)允许步骤(b)的产物进入和保留在所述层析介质中,和
(ii)洗脱所述生物有机化合物。
18.根据权利要求11所述的方法,其中,所述容器是在权利要求1至10中任一项限定的样品制备容器。
19.一种试剂盒,包括以下物质或由以下物质组成:
(a)根据权利要求1至10中任一项所述的样品制备容器;和
(b)用于质谱分析的标准物;以及
(c)蛋白酶;烷化剂;还原剂;离液剂;洗涤剂;和/或用于在所述容器中将pH值构建为介于7和9之间的工具。
20.根据权利要求19所述的试剂盒,还包括:
(a)以下化学物质的至少一种:珠磨材料、洗涤剂、离液剂、烷化剂、还原剂、有机溶剂、抗氧化剂、UV吸收剂;
(b)以下酶的至少一种:蛋白酶、核酸酶、脱羧酶、激酶、糖苷酶;和/或
(c)具有用于实施根据权利要求11至18中任一项所述的方法的使用说明的手册。
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