CN104994874B - 抗整联蛋白β1抗体组合物及其使用方法 - Google Patents
抗整联蛋白β1抗体组合物及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供人可变链框架区和包含所述框架区的人源化抗体,所述抗体对整联蛋白β1具有特异性。本发明也提供用于利用所述抗体例如来治疗如癌症的疾病的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35USC§119(e)要求2012年12月26日提交的美国申请序列号61/746,023的权益。先前申请的公开内容被视为本申请的公开内容的一部分,并且以引用的方式整体并入本申请的公开内容。
序列表的并入
随附序列表中的材料据此以引用的方式并入本申请。名为ONCO1100_1WO_Sequence_Listing的随附序列表文本文件于2013年12月23日创建,并且是81KB。所述文件可在使用Windows OS的计算机上利用Microsoft Word进行评估。
发明背景
发明领域
本发明大体上涉及免疫学领域,并且更具体来说涉及抗整联蛋白抗体及其使用方法。
背景信息
在发达世界,癌症是死亡的主要病因之一,仅在美国导致每年超过500,000例死亡。在美国,每年有超过100万人被诊断有癌症,并且总之据估计超过三分之一人在他们的寿命期间将显现某种形式的癌症。尽管存在超过200种不同类型的癌症,但它们之中包括乳癌、肺癌、结肠直肠癌和***癌的四种占所有新病例的超过一半。
乳癌是女性中最常见的癌症,其中估计12%的女性在她们的寿命期间处于显现所述疾病的风险下。尽管死亡率已由于较早检测和改进的治疗而降低,但乳癌仍然是中年女性的主要死亡病因。此外,转移性乳癌仍然是一种不可治愈疾病。在呈现时,大多数患有转移性乳癌的患者仅有一个或两个器官***受影响,但随着疾病进展,多个部位通常变得受牵连。转移性牵连的最常见部位是胸壁的皮肤和软组织中以及腋窝和锁骨上区域中的局部区域性复发。远端转移的最常见部位是骨(30-40%的远端转移),继之以肺和肝。尽管仅约1-5%的患有新诊断乳癌的女性在诊断时具有远端转移,但约50%的患有局部疾病的患者最终在5年内伴有转移而复发。目前,自显现远端转移开始的中值存活期是约3年。
当前诊断和分期乳癌的方法包括肿瘤-结节-转移(TNM)***,其依赖于肿瘤尺寸、肿瘤在***中的存在以及远端转移的存在,如American Joint Committee on Cancer:AJCC Cancer Staging Manual.Philadelphia,Pa.:Lippincott-Raven Publishers,第5版,1997,第171-180页以及Harris,J R:"Staging of breast carcinoma",Harris,J.R.,Hellman,S.,Henderson,I.C,Kinne D.W.(编):Breast Diseases.Philadelphia,Lippincott,1991中所述。这些参数用于提供预后,并且选择适当疗法。也可评估肿瘤的形态学外观,但因为具有类似组织病理学外观的肿瘤可展现显著临床可变性,所以这个方法具有严重局限性。最后,针对细胞表面标记的测定可用于将某些肿瘤类型分成子类。举例来说,在乳癌的预后和治疗中考虑的一个因素是***受体(ER)的存在,因为ER阳性乳癌通常比ER阴性肿瘤更易于对如他莫昔芬(tamoxifen)或芳香酶抑制剂的激素疗法应答。尽管适用,但这些分析仅部分预测***肿瘤的临床特性,并且在乳癌中存在当前诊断工具未能检测,并且当前疗法未能治疗的许多表型多样性。
在发达世界,***癌是男性中最常见的癌症,在美国占所有新癌症病例的估计33%,并且是第二最常见的死亡病因。自从引入***特异性抗原(PSA)血液测试,早期检测***癌已显著改进存活率,并且在诊断时患有局部和区域性时期***癌的患者的5年存活率接近100%。但超过50%的患者将最终显现局部晚期或转移性疾病。
当前根治性***切除术和放射疗法提供对大多数局部化***肿瘤的治愈性治疗。然而,针对晚期病例的治疗选项极其有限。对于转移性疾病,用单独或与抗雄激素剂组合的黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂进行雄激素剥夺(androgen ablation)是标准治疗。然而,尽管最大阻断雄激素,但所述疾病几乎始终进展,其中大多数显现雄激素非依赖性疾病。目前,不存在一致接受的针对激素难治性***癌的治疗,并且通常使用化学治疗方案。
肺癌是全世界最常见的癌症,在美国是第三最通常诊断的癌症,并且到目前为止是最常见的癌症死亡病因。抽烟据信导致所有肺癌的估计87%,从而使得它成为最致命的可预防疾病。肺癌被分成占所有肺癌的超过90%的两种主要类型:小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。SCLC占病例的15-20%,并且特征在于它来源于大中心气道中,并且组织学组成是具有少许细胞质的小细胞的薄片。SCLC比NSCLC更具侵袭性,快速生长,并且在早期且常常转移。NSCLC占所有病例的80-85%,并且基于组织学被进一步分成三种主要亚型:腺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)和大细胞未分化癌。
肺癌通常在它的病程中的晚期呈现,并且因此在诊断之后具有仅6-12个月的中值存活期以及仅5-10%的总体5年存活率。尽管手术提供最佳治愈机会,但仅小部分肺癌患者符合条件,其中大多数依赖于化学疗法和放射疗法。尽管试图操纵这些疗法的时间选择和剂量强度,但存活率历经过去15年已少许增加。
结肠直肠癌是全世界第三最常见的癌症和第四最常见的癌症死亡病因。所有结肠直肠癌的约5-10%是遗传性的,其中一种主要形式是家族性腺瘤多发性息肉(FAP),这是一种常染色体显性疾病,其中约80%的受影响个体在腺瘤结肠多发性息肉(APC)基因中含有生殖系突变。结肠直肠癌具有通过圆周性生长以及在其它地方通过淋巴性、血原性、经腹膜性和神经周性散布进行局部侵袭的倾向。淋巴外牵连的最常见部位是肝,其中肺是最常受影响的腹部外器官。血原性散布的其它部位包括骨、肾、肾上腺和脑。
当前对结肠直肠癌的分期***是基于肿瘤通过肠壁的渗透程度以及存在或不存在结节牵连。这个分期***由三种主要杜克氏分类法(Duke's classification)来规定:杜克氏A疾病限于结肠或直肠的粘膜下层;杜克氏B疾病具有通过固有肌层进行侵袭,并且可渗透结肠壁或直肠壁的肿瘤;并且杜克氏C疾病包括任何程度的肠壁侵袭,伴有区域性***转移。尽管手术切除高度有效针对早期结肠直肠癌,提供杜克氏A患者的治愈率95%,但在杜克氏B患者中,治愈率降低至75%,并且在杜克氏C疾病中存在阳性***预测在5年内有60%的复发可能性。用手术后化学疗法过程治疗杜克氏C患者使复发率降低至40%-50%,并且现在是针对这些患者的护理标准。
头颈部的上皮癌产生于头颈部区域中的粘膜表面,并且在来源方面通常是鳞状细胞。这个种类包括鼻旁窦、口腔以及鼻咽、口咽、下咽和喉的肿瘤。
在美国,头颈部癌的年度新病例数是每年约40,000,占成人恶性肿瘤的约5%。在一些其它国家,头颈部癌更常见,并且全世界发病可能超过每年50万例。在北美和欧洲,肿瘤通常产生于口腔、口咽或喉,而在地中海国家和远东,鼻咽癌更常见。
尽管适用,但传统疗法(放射疗法、化学疗法和激素疗法)模式已因出现治疗抗性癌细胞而受限制。明确的是,需要用以鉴定用于治疗头颈部癌以及一般来说癌症的靶标的新方法。
胰腺癌是一种源于产生在形成胰腺的组织中的转化细胞的恶性赘瘤。占这些肿瘤的95%的最常见类型的胰腺癌是产生在胰腺的外分泌组成部分内的腺癌(根据光显微术展现腺性构造的肿瘤)。少数产生于胰岛细胞,并且被分类为神经内分泌肿瘤。胰腺癌在美国是第四并且在全世界是第八最常见的癌症相关死亡病因。
多形性成胶质细胞瘤(GBM)是成人中最常见的恶性脑肿瘤,其中在最大限度治疗下的中值存活期小于1年。迄今为止,仅三种药物已由FDA核准用于GBM治疗,并且总体存活率在超过25年中尚未得以改进。
整联蛋白是负责在正常状态与病理状态(如炎症和癌症)两者下机械感测微环境,并且引发细胞外-基质(ECM)诱导的信号传导的细胞粘着分子。重要的是,整联蛋白位于细胞和微环境的界面处,从而在肿瘤进展以及调控生长和存活路径方面起关键作用。许多类型的整联蛋白的上调已与上皮恶性肿瘤相关联,特别是在侵袭、转移和血管生成的过程期间。重要的是,协调广泛得多的功能性活性(如炎症、增殖、粘着和侵袭)的β1整联蛋白新近已牵涉于多种实体癌症模型和造血性恶性肿瘤中的治疗抗性中。重要的是,这个β1整联蛋白介导的抗性被认为发生在肿瘤细胞自身的水平上。除以上所述之外,β1整联蛋白通过促进血管内皮细胞的迁移而在肿瘤血管化(如VEGF依赖性和VEGF非依赖性血管生成)期间具有重要功能。抑制β1整联蛋白会通过多种潜在机理来克服对抗血管生成疗法的抗性:(1)防止在任何经典ECM基底上的血管共选择和/或生长/侵袭;(2)在如电离辐射的伤害之后降低肿瘤细胞的活力;(3)直接抑制肿瘤细胞增殖;(4)直接抑制血管化过程;以及(5)抑制通常在产生疗法抗性之后所见的侵袭性间质表型,包括球状生长。
鉴于整联蛋白β1在如上讨论的较广泛功能性活性方面的作用,如整联蛋白β1靶向抗体的抗整联蛋白β1组合物也可在免疫性/炎性疾病中是重要的。此外,可通过整联蛋白β1路径加以靶向的疾病和病症包括多发性硬化症、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、类风湿性关节炎、炎性肠病等。类似地,将预期可靶向某些眼相关疾病,包括湿性年龄相关的黄斑部变性(AMD)。
发明概述
本发明是基于产生特异性结合整联蛋白β1的具有人框架序列的人源化抗体。已知整联蛋白β1是一种在实体肿瘤中过表达的蛋白质,并且因此作为适用于表征、研究、诊断和治疗癌症的癌细胞标记。此外,已证明整联蛋白β1会通过精密协调生长和来自肿瘤微环境的存活信号来驱动对常规(例如化学疗法和电离辐射)和靶向(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、贝伐单抗(bevicizumab)、拉帕替尼(lapatinib))疗法的癌抗性。在过去,人源化尝试已受可用人框架的数目限制。本发明满足对用于特异性结合整联蛋白β1的抗体的其它人框架序列的需要。
在一个实施方案中,本发明提供一种特异性结合整联蛋白β1的人源化抗体。所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区,其中所述VH区与具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VH区具有小于约97%、96%或95%同一性,并且其中所述VL区与具有如SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的VL区具有小于约97%、96%或95%同一性。
在另一实施方案中,VH区与具有如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29-43和SEQ ID NO:91-100所示氨基酸序列的VH区具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在实施方案中,VL区与具有如SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:44-57和SEQ ID NO:107-116所示氨基酸序列的VL区具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。
在另一实施方案中,抗体具有来自如OS2966的供体抗体的VH和VL区的CDR。在实施方案中,VH区的CDR具有如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列,并且VL区的CDR具有如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示氨基酸序列。
在一个方面,本发明提供一种包括本发明的VH和VL区的抗体。
在另一方面,本发明提供一种编码本发明的抗体的核酸分子。
在另一方面,本发明提供一种包括本发明的核酸分子的载体。
在另一方面,本发明提供一种包括本发明的载体的分离的宿主细胞。
在另一方面,本发明提供药物组合物。在一个实施方案中,药物组合物包括本发明的抗体和药学上可接受的载体。在一个实施方案中,药物组合物包括本发明的核酸分子和药学上可接受的载体。
在另一方面,本发明提供一种包括连接于检测或治疗部分的本发明的抗体的免疫缀合物。
在另一方面,本发明提供一种包括可操作地连接于如细胞因子的单独肽的本发明的抗体的嵌合蛋白。
在另一实施方案中,本发明提供一种治疗受试者的疾病的方法。在实施方案中,所述方法包括向受试者施用本发明的抗体、本发明的核酸分子、本发明的药物组合物、本发明的免疫缀合物或本发明的嵌合蛋白,由此治疗疾病。在一个实施方案中,疾病是细胞增生性病症,如癌症。
在另一实施方案中,本发明提供一种检测受试者的疾病的方法。所述方法包括使本发明的抗体或免疫缀合物与来自受试者的样品接触;通过与整联蛋白β1特异性结合来检测整联蛋白β1的水平;以及比较整联蛋白β1的检测水平与正常样品中的整联蛋白β1的水平,其中相较于正常样品,来自受试者的样品中的整联蛋白β1的水平增加指示疾病。
在另一实施方案中,本发明提供一种与具有如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29-43和SEQ ID NO:91-100所示氨基酸序列的VH区具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的VH区。
在另一实施方案中,本发明提供一种与具有如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:44-57和SEQ ID NO:107-116所示氨基酸序列的VL区具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的VL区。
附图简述
图1是描绘由杂交瘤OS2966产生的抗体OS2966的VH区的核酸和氨基酸序列的图示表示。
图2是描绘由杂交瘤OS2966产生的抗体OS2966的VL区的核酸和氨基酸序列的图示表示。
图3是描绘对由杂交瘤OS2966产生的抗体OS2966的CDR的分析的图示表示,所述CDR用于本发明的抗体的VH和VL区中。
图4是描绘由杂交瘤产生的抗体OS2966的CDR的氨基酸序列的图示表示,所述CDR用于本发明的抗体的VH和VL区中。
图5是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VH区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图6是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VH区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图7是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VH区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图8是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VH区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图9是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VH区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图10是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VL区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图11是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VL区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图12是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VL区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图13是描绘一个实施方案中的本发明的抗体的VL区的核酸和氨基酸序列的图示表示。对保守CDR加下划线。
图14是载体的示意图。
图15是描绘本发明的人源化VH链相较于抗体OS2966的VH(SEQ ID NO:2)的序列分析和比对的图示表示。图15的序列如下:OS2966是SEQ ID NO:2;变体1是SEQ ID NO:6;变体2是SEQ ID NO:8;变体3是SEQ ID NO:10;变体4是SEQ ID NO:12;变体5是SEQ ID NO:14;变体6是SEQ ID NO:29;变体7是SEQ ID NO:30;变体8是SEQ ID NO:31;变体9是SEQ ID NO:32;变体10是SEQ ID NO:33;变体11是SEQ ID NO:34;变体12是SEQ ID NO:35;变体13是SEQID NO:36;变体14是SEQ ID NO:37;变体15是SEQ ID NO:38;VH2是SEQ ID NO:91;变体16是SEQ ID NO:92;VH4是SEQ ID NO:93;变体17是SEQ ID NO:94;VH5是SEQ ID NO:95;变体18是SEQ ID NO:96;VH6是SEQ ID NO:97;变体19是SEQ ID NO:98;VH7是SEQ ID NO:99;并且变体20是SEQ ID NO:100。
图16是描绘对应于图15中所示的比对的本发明的人源化J区(VH)的序列分析和比对的图示表示。序列如下:J1是SEQ ID NO:101;J2是SEQ ID NO:102;J3是SEQ ID NO:103;J4是SEQ ID NO:104;J5是SEQ ID NO:105;并且J6是SEQ ID NO:106。
图17是描绘本发明的人源化VL链相较于抗体OS2966的VL(SEQ ID NO:4)的序列分析和比对的图示表示。序列如下:OS2966是SEQ ID NO:4;变体1是SEQ ID NO:16;变体2是SEQ ID NO:18;变体3是SEQ ID NO:20;变体4是SEQ ID NO:22;变体5是SEQ ID NO:44;变体6是SEQ ID NO:45;变体7是SEQ ID NO:46;变体8是SEQ ID NO:47;变体9是SEQ ID NO:48;变体10是SEQ ID NO:49;变体11是SEQ ID NO:50;变体12是SEQ ID NO:51;变体13是SEQ IDNO:52;VkI是SEQ ID NO:107;变体14是SEQ ID NO:108;VkII是SEQ ID NO:109;变体15是SEQ ID NO:110;VkIII是SEQ ID NO:111;变体16是SEQ ID NO:112;VkIV是SEQ ID NO:113;变体17是SEQ ID NO:114;VkVI是SEQ ID NO:115;并且变体18是SEQ ID NO:116。
图18是描绘对应于图17中所示的比对的本发明的人源化J区(κ轻链)的序列分析和比对的图示表示。序列如下:J1是SEQ ID NO:117;J2是SEQ ID NO:118;J3是SEQ ID NO:119;J4是SEQ ID NO:120;并且J5是SEQ ID NO:121。
图19是描绘本发明的VH和VL链的密码子使用的图示表示。
图20是描绘本发明的复合人抗体变体(表2中所示的那些)的相对亲和力的图解表示。
图21是描绘本发明的复合人抗体变体(表2中所示的那些)的相对亲和力的图解表示。
图22是描绘本发明的复合人抗体变体(表2中所示的那些)的相对亲和力的图解表示。
图23是描绘本发明的复合人抗体变体(表2中所示的那些)的相对亲和力的图解表示。
图24是描绘本发明的复合人抗体变体(表2中所示的那些)的相对亲和力的图解表示。
图25A-D是说明本发明的复合人抗体变体在细胞外基质(ECM)粘着测定中的功能性验证的一系列图解表示。在粘着微板测定中评估在多种ECM上以及在多种癌细胞系中,本发明的复合人抗体变体(来自表2)对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。图25A利用PANC-1人胰腺癌。图25B利用PANC-1人胰腺癌。图25B利用PANC-1人胰腺癌。图25C利用MDA-MB-231人三阴性乳癌。图25D利用AsPC-1人胰腺癌。
图26A-B是说明本发明的复合人抗体变体在细胞外基质(ECM)迁移测定中的功能性验证的一系列图示和图解表示。在微板“刮擦创伤”迁移测定中评估在ECM组分纤维结合蛋白上,使用人三阴性乳癌细胞(MDA-MB-231),本发明的复合人抗体变体(来自表2)对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。图26A是各板在10×放大倍数下的一系列图像,其显示在OS2966和复合人变体(H1、H2、H3)处理的孔中,向创伤中的迁移得以减弱。图26B是在各条件下对无细胞区域的定量(一式三份并且重复进行)的图。
图27A-B是说明本发明的复合人抗体变体在用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行的血管形成血管生成测定中的功能性验证的一系列图示和图解表示。在血管生成的体外模型(即用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行的血管形成测定)中评估本发明的复合人抗体变体(来自表2)对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。图27A是各板在10×放大倍数下的一系列图像,其显示在OS2966和复合人变体(H1、H2、H3)处理的孔中,血管形成得以减弱。图27B是在各条件下对闭合单元形成的定量(用内皮祖细胞至少一式三份并且重复进行)的一系列图。
图28A-B是说明本发明的复合人抗体变体在三阴性乳癌的人原位异种移植物模型中的功能性验证的一系列图示和图解表示。在人三阴性乳癌的体内模型中使用MDA-MB-231细胞系,评估本发明的复合人抗体变体(来自表2)对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。图28A是根据时间显示组肿瘤平均体积的图。图28B是蛋白质印迹的图像。
图29是说明本发明的复合人抗体变体在自三阴性乳癌的自发性肺转移的人原位异种移植物模型中的功能性验证的一系列图示表示。
图30A-C是说明本发明的复合人抗体变体在胰腺癌的人异种移植物模型中的功能性验证的一系列图示和图解表示。在人吉西他滨(gemcitabine)抗性胰腺癌的体内模型中使用PANC1-GEMR细胞系,评估本发明的复合人抗体变体(来自表2)对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。图30A是根据时间显示组肿瘤平均体积的图。图30B是根据时间显示组肿瘤平均体积的图。图30C是蛋白质印迹的图像。
图31A-B是说明本发明的复合人抗体变体在产生的成胶质细胞瘤的人异种移植物模型中的功能性验证的一系列图示和图解表示。在产生的人成胶质细胞瘤的体内模型中使用U87MG细胞系,评估本发明的复合人抗体变体(来自表2)对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。图31A是根据时间显示组肿瘤平均体积的图。图3B是印迹的图像。
图32A-B描绘免疫原性筛选测定(EpiScreenTM)的结果。图32A是直方图。图32B是供体组的健康供体T细胞增殖应答的概述。
发明详述
本发明提供人VH和VL框架序列和编码它们的核酸序列。所述序列用以例如提供用于移植来自例如啮齿动物抗体的供体抗体的CDR的框架。因此,可产生包含本发明的VH和/或VL框架的具有供体抗体的结合特异性的抗体。
本发明也提供具有称为OS2966的抗体的特异性,例如通过提供于SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、29-57、91-100和107-116所示人VH和VL框架区中的鼠类OS2966的CDR特异性结合整联蛋白β1的人源化抗体。
本发明的人源化抗体用于如本文所述的多种治疗和诊断目的。用途包括诊断和治疗如癌症的疾病。
在描述本发明组合物和方法之前,应了解本发明不限于所述的特定装置、方法和实验条件,因为所述装置、方法和条件可变化。也应了解本文使用的术语是仅出于描述特定实施方案的目的,而非意图具有限制性,因为本发明的范围将仅在随附权利要求中加以限制。
除非上下文另外明确规定,否则如本说明书和随附权利要求中所用,单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。因此,举例来说,提及“所述组合物”或“所述方法”包括将在阅读本公开等后变得为本领域技术人员显而易知的本文所述类型的一种或多种组合物和方法和/或步骤。
除非另外定义,否则本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域普通技术人员通常所理解具有相同含义。尽管在实施或测试本发明时可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料,但现在描述优选方法和材料。
术语“整联蛋白β1”与CD29同义,并且包括提及由ITGB1基因编码的蛋白质。整联蛋白β1与晚期抗原受体缔合,并且已知与包括α-1至α-9的许多α亚单位联合,例如与α-3亚单位复合会产生与如神经生长因子-1和颤蛋白(reelin)的分子反应的α3β1复合物。
如本文所用,关于抗体的术语“抗整联蛋白β1”是指特异性结合整联蛋白β1的抗体。
术语“抗体”是指特异性结合并识别抗原的由免疫球蛋白基因编码的多肽或其功能性片段。认定的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及数万种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε,此转而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。各四聚体由两对相同多肽链组成,各对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的N末端界定主要负责抗原识别的具有约100至110个或大于110个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体功能性片段的实例包括但不限于完整抗体分子,抗体片段如Fv、单链Fv(scFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab、F(ab)2'以及这些片段的任何组合或免疫球蛋白肽的能够结合靶标抗原的任何其它功能性部分(参见例如Fundamental Immunology(Paul编,第3版1993)。如由本领域技术人员所了解,可通过多种方法,例如用如胃蛋白酶的酶消化完整抗体;或重新合成来获得各种抗体片段。抗体片段常以化学方式或通过使用重组DNA方法来重新合成。因此,如本文所用的术语抗体包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段,或使用重组DNA方法重新合成的那些(例如单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那些。术语抗体也包括二价或双特异性分子、双链抗体、三链抗体和四链抗体。二价和双特异性分子在本领域中是已知的。
提及“VH”或一“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区,包括Fv、scFv、二硫稳定化Fv(dsFv)或Fab。提及“VL”或一“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区,包括Fv、scFv、dsFv或Fab。
CDR主要负责结合抗原的表位。各链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3,自N末端起始依序编号,并且也通常通过其中特定CDR所定位于的链来识别。因此,VH CDR3位于抗体的重链的于其中发现它的可变结构域中,而VL CDR1是来自抗体的轻链的于其中发现它的可变结构域的CDR1。除非另外指示,否则本文所述的对轻链和重链可变区的编号是根据Kabat(参见例如Johnson等,(2001)"Kabat Database and its applications:futuredirections"Nucleic Acids Research,29:205-206;以及Kabat Database of Sequencesof Proteins of Immunological Interest,2002年2月22日Dataset)。
可使用本领域中各种熟知定义来确定CDR和框架区的位置,所述定义例如Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见例如Johnson等(上文);Chothia和Lesk,1987,Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins.J.Mol.Biol.196,901-917;Chothia C.等,1989,Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions.Nature 342,877-883;Chothia C.等,1992,structural repertoire of the human VH segments J.Mol.Biol.227,799-817;Al-Lazikani等,J.Mol.Biol 1997,273(4))。对抗原结合位点的定义也描述于以下中:Ruiz等,IMGT,the international ImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res.,28,219-221(2000);以及Lefranc,M.-P.IMGT,the international ImMunoGeneTicsdatabase.Nucleic Acids Res.1月1日;29(l):207-9(2001);MacCallum等,Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,JMol.Biol.,262(5),732-745(1996);以及Martin等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272(1989);Martin,等,Methods Enzymol.,203,121-153,(1991);Pedersen等,Immunomethods,1,126,(1992);以及Rees等,Sternberg M.J.E.(编),Protein StructurePrediction.Oxford University Press,Oxford,141-1721996)。
本文公开的人VH和VL区的示例性框架和CDR序列显示于图4中。
“OS2966”是指特异性结合人整联蛋白β1的鼠类IgG1抗体。OS2966可自若干来源,如Developmental Studies Hybridoma Bank of the University of Iowa商购(根据不同标号)。已克隆OS2966的重链和轻链。OS2966VH区的核苷酸和氨基酸序列分别以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2示出。OS2966VL区的核苷酸和氨基酸序列分别以SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4示出。如对于本文所述的示例性人源化抗体指定的OS2966CDR以SEQ ID NO:23-28示出,并且显示于图4中。
“人源化抗体”是指包含供体抗体结合特异性,即移植于人框架序列上的通常是小鼠单克隆抗体的供体抗体的CDR区的抗体。如本文所用的“人源化抗体”与供体抗体结合相同表位,并且通常具有至少25%的结合亲和力。针对结合亲和力的示例性测定描述于实施例5中。用以确定抗体是否结合相同表位的方法在本领域中是熟知的,参见例如Harlow和Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999,其公开用以定位表位的技术或者用以确定抗体是否与供体抗体结合相同表位的竞争实验。本发明中提供一种包含新型框架区的人源化抗体。
本发明的“VH”或“VL”“区”或“框架”是指与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:29-57、SEQ ID NO:91-100或SEQ ID NO:107-116所示氨基酸序列具有至少70%同一性、常常至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH或VL氨基酸序列。VH或VL链的“框架”是指所述链不包括CDR的框架区。如应用于各链的所述术语涵盖所有框架区。
“人源化抗整联蛋白β1抗体”是指包含人框架序列的具有移植于那个框架的鼠类OS2966的结合特异性的人源化抗体。本发明的人源化抗整联蛋白β1抗体的CDR与分别以SEQID NO:2和SEQ ID NO:4所示的重链和轻链序列的CDR具有至少85%、更通常至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。VH区的CDR以SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25示出。VH区的CDR以SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28示出。
在一个方面,本发明提供复合人源化抗体。复合人抗体技术通过在可变区(V区)序列中避免T细胞表位(去免疫)来产生人源化非免疫原性抗体(EP2,388,871)。不同于使用单一人V区框架作为来自起始抗体(通常是鼠类抗体)的互补决定区(CDR)的‘接受体’的其它人源化技术,复合人抗体TM包含源于无关人抗体的V区的多个序列区段(‘复合物’)。复合人抗体的关键性质如下:
在确定被视为对起始抗体结合抗原关键的氨基酸之后选择由无关人V区的数据库获得的序列区段。使用Antitope的计算机模拟(in silico)工具针对潜在T细胞表位的存在性来过滤所有选择的由人V区数据库获得的序列区段。由于人序列区段与起始抗体V区的所有区段的密切配合(close fit),所以复合人抗体TM保留优于标准人源化抗体的亲和力和特异性。复合人抗体TM去除了T细胞表位,并且因此被视为是人源化且去免疫化的。
在一个实施方案中,通过鉴定框架区中在T细胞表位内的特定位点处的待突变候选残基来制备本发明抗体。本发明抗体相较于供体抗体可展现改变的结合亲和力和/或改变的免疫原性。
本领域中已知的方法可用于定位蛋白质序列内的T细胞表位。举例来说,EpiScreenTM(EP1989544,Antitope,UK)用于定位蛋白质序列内的T细胞表位以确定免疫原性潜力,所述免疫原性潜力是基于序列内的T细胞表位的数目和效价。EpiScreenTM T细胞表位定位通常使用来自最少50个HLA分型供体(被选择来代表目标人群体)的CD8+T细胞去除的PBMC。通常,通过3H TdR并入来分析跨越蛋白质序列具有12个氨基酸重叠的15聚体肽在许多平行测定培养物中的体外CD4+T细胞刺激。常在两个或三个邻近和重叠肽中检测到CD4+T细胞刺激,因为结合MHC II类结合沟槽的核心9聚体将存在于一个以上肽序列中。在准确鉴定在体外刺激CD4+T细胞的肽之后,计算机模拟技术可用于通过确定核心9聚体序列的精确位置和关键MHC II类锚定残基的位置来设计表位去除的(去免疫化)变体。
短语“单链Fv”或“scFv”是指其中传统双链抗体的重链的可变结构域和轻链的可变结构域已接合以形成一个链的抗体。通常,接头肽被***在两个链之间以使可变结构域稳定化而不干扰活性结合位点的适当折叠和产生。本发明的单链人源化抗体(例如人源化抗整联蛋白β1抗体)可以单体形式进行结合。其它示例性单链抗体可形成双链抗体、三链抗体和四链抗体。(参见例如Hollinger等,1993(上文))。此外,本发明的人源化抗体(例如人源化抗整联蛋白β1抗体)也可形成“重构”抗体或抗体片段(例如Fab、Fab'单体、F(ab)'2二聚体或完整免疫球蛋白分子)的一个组分。因此,本发明的人源化抗体可进一步包含人Fc区。
“接合”或“连接”或“缀合”是指本领域中已知的用于功能性连接蛋白质结构域的任何方法,包括不限于用或不用间插结构域进行重组融合、内含肽介导的融合、非共价缔合和共价键结,例如二硫键结、肽键结;氢键结;静电键结;以及构象键结,例如抗体-抗原和生物素-抗生蛋白缔合。在本发明的情形下,所述术语包括提及使抗体部分接合于效应物分子(EM)。键联可通过化学或重组手段来达成。化学手段是指抗体部分与效应物分子之间反应以使在两个分子之间存在形成的共价键以形成一个分子。
术语“效应物部分”是指免疫缀合物的意图对由靶向部分靶向的细胞具有影响或鉴定所述免疫缀合物的存在性的部分。因此,效应物部分可为例如治疗部分(如细胞毒性剂或药物)或可检测部分(如荧光标记)。
“治疗部分”是免疫缀合物的意图充当治疗剂的部分。
术语“治疗剂”包括当前已知或稍后开发来充当化学治疗剂、抗赘生化合物、消炎化合物、抗感染化合物、酶活化剂或抑制剂、变构调节剂、抗生素或被施用来在患者中诱导所需治疗作用的其它药剂的许多化合物。治疗剂也可为毒素或放射性同位素,其中预定治疗作用是例如杀死癌细胞。
术语“有效量”或“有效用以…的量”或“治疗有效量”是指足以在受试者中诱导可检测治疗应答的量。优选地,治疗应答有效降低癌细胞的增殖或抑制受试者中存在的癌细胞的生长。用于测定治疗应答的测定在本领域中是熟知的。
术语“免疫缀合物”是指包含连接于第二分子(如可检测标记或效应物分子)的抗体的组合物。常常,抗体是通过共价键联来连接于第二分子。
在免疫缀合物的情形下,“可检测标记”或“可检测部分”是指免疫缀合物的具有致使它的存在可检测的性质的部分。举例来说,免疫缀合物可用放射性同位素标记,所述放射性同位素标记允许其中存在免疫缀合物的细胞在免疫组织化学测定中被检测。“可检测标记”或“可检测部分”是可通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段来检测的组合物。举例来说,适用标记包括放射性同位素(例如3H、35S、32P、51Cr或125I)、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或通常用于ELISA中的其它酶)、生物素、地高辛或半抗原和可例如通过将放射性标记并入肽中而使其可检测或用于检测与肽具有特异性反应性的抗体的蛋白质。
术语“免疫反应性条件”包括提及允许针对特定表位产生的抗体在比结合大致上所有其它表位可检测更大程度上和/或在大致上排除结合大致上所有其它表位的程度上结合那个表位的条件。免疫反应性条件取决于抗体结合反应的形式,并且通常是用于免疫测定方案中的条件或在体内遇到的那些条件。对于免疫测定形式和条件的描述,参见Harlow和Lane(上文)。优选地,用于本发明方法中的免疫反应性条件是包括提及在活哺乳动物或哺乳动物细胞内部典型的条件(例如温度、容积摩尔渗透浓度、pH)的“生理条件”。尽管认识到一些器官经受极端条件,但生物体内和细胞内环境通常处于约pH 7(即pH 6.0至pH 8.0,更通常pH 6.5至7.5),含有水作为主要溶剂,并且在高于0℃且低于50℃的温度下存在。容积摩尔渗透浓度在支持细胞活力和增殖的范围内。
术语“特异性结合”、“结合特异性”、“特异性结合抗体”或“与…具有特异性免疫反应性”在涉及表位时是指确定在蛋白质和其它生物制剂的异质群体中存在表位的结合反应。因此,在指定的免疫测定条件下,指定的抗体结合特定表位是本底至少两倍,并且更通常是本底的10倍以上至100倍。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质或碳水化合物具有特异性免疫反应性的抗体。举例来说,固相ELISA免疫测定常规用于选择与蛋白质或碳水化合物具有特异性免疫反应性的抗体。对于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述,参见Harlow和Lane,ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Press,New York(1988)以及Harlow和Lane,USING ANTIBODIES,A LABORATORYMANUAL,Cold Spring Harbor Press,New York(1999)。如本文所用,“特异性结合”是指抗体结合蛋白质的Kd是至少约0.1mM、至少约1μM、至少约0.1μM或更佳、或0.01μM或更佳。
“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换用于指代呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键联的核酸,其是合成的、天然存在的和非天然存在的,其与参照核酸具有类似结合性质,并且其以与参照核苷酸类似的方式被代谢。所述类似物的实例包括不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。如由本领域技术人员所了解,可易于由另一链的序列确定核酸序列的互补序列。因此,本文阐述的任何特定核酸序列也公开互补链。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。
“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成氨基酸以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及稍后被修饰的那些氨基酸,例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构,即α碳结合于氢、羧基、氨基和R基团的化合物,例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架,但保留与天然存在的氨基酸相同基本的化学结构。“氨基酸模拟物”是指结构不同于氨基酸的一般性化学结构,但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可通过它们的通常已知三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。
“保守修饰的变体”适用于核酸序列与氨基酸序列两者。就特定核酸序列而言,保守修饰的变体是指编码同一或基本上同一氨基酸序列的那些核酸,或当核酸不编码氨基酸序列时,是指基本上同一序列。由于遗传密码的简并性,许多在功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在其中丙氨酸由密码子指定的每个位置处,所述密码子可改变成所述任何相应密码子而不改变编码的多肽。所述核酸变化是“沉默变化”,其是一种保守修饰的变化。本文每个编码多肽的核酸序列也描述核酸的每个可能的沉默变化。技术人员将认识到核酸中的各密码子(除AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密码子)之外)可被修饰来产生在功能上相同的分子。因此,编码多肽的核酸的各沉默变化隐含于各所述序列中。
就氨基酸序列而言,技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”,其中改变导致氨基酸被化学类似氨基酸取代。提供在功能上类似的氨基酸的保守性取代表在本领域中是熟知的。所述保守修饰的变体除了并且不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。
举例来说,可进行其中脂族氨基酸(G、A、I、L或V)被群组的另一成员取代的取代,或如一个极性残基被另一极性残基取代,如精氨酸被赖氨酸取代、谷氨酸被天冬氨酸取代、或谷氨酰胺被天冬酰胺取代的取代。以下八组各自含有彼此是保守性取代的其它示例性氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。
如多肽结构的大分子结构可以各种组构水平加以描述。对于这个组构的一般性讨论,参见例如Alberts等,Molecular Biology of the Cell(第3版,1994)以及Cantor和Schimmel,Biophysical Chemistry Part I.The Conformation of BiologicalMacromolecules(1980)。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内局部有序的三维结构。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。结构域是多肽的形成多肽的紧实单元,并且长度通常是50至350个氨基酸的部分。典型结构域由具有较小组构的区段,如β-折叠和α-螺旋的链段组成。“四级结构”是指通过独立三级单元的非共价缔合形成的三维结构。
术语“分离的”或“大致上纯化的”在应用于核酸或蛋白质时表示所述核酸或蛋白质基本上不含它在自然状态下与其相伴的其它细胞组分。它优选是呈均质状态,但它可呈干燥或水溶液形式。通常使用分析化学技术,如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是大致上纯化的。
术语“同一”或“同一性”百分比在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下是指两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即当历经比较窗或指定区域比较并比对以达成最大对应性时,具有约60%同一性、优选65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性),如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法在下述缺省参数下所测量,或通过手动比对和目视检查所测量。所述序列接着被称为“大致上同一”。这个定义也涉及或可应用于测试序列的互补序列。所述定义也包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。如下所述,优选算法可虑及空位等。优选地,历经长度是至少约25个氨基酸或核苷酸的区域,或更优选地,历经长度是50-100个氨基酸或核苷酸的区域存在同一性。
对于序列比较,通常一个序列充当测试序列与其进行比较的参照序列。当使用序列比较算法时,将测试序列和参照序列输入计算机中,必要时指定子序列坐标,并且指定序列算法程序参数。优选地,可使用缺省程序参数,或可指定替代性参数。序列比较算法接着基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。
如本文所用的“比较窗”包括提及具有选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组的任一数目的连续位置的区段,其中在两个序列最优比对之后,可将序列与具有相同数目的连续位置的参照序列进行比较。供比较的序列的比对方法在本领域中是熟知的。供比较的序列的最优比对可例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部比对算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的整体比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的类似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行程序(Wisconsin Genetics软件包(GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过手动比对和目视检查(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编1995补编))来进行。当比较如本文所述的序列时,常使用以缺省参数进行的Smith和Waterman比对。
适于确定序列同一性百分比和序列类似性百分比的算法的另一实例是BLAST和BLAST 2.0算法,其分别描述于Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)以及Altschul等,J.Mol.Biol.215:403410(1990)中。通常在缺省参数下使用BLAST和BLAST 2.0以确定本发明的核酸和蛋白质的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。这个算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度是W的短字符来鉴定高分序列对(HSP),所述短字符在与数据库序列中具有相同长度的字符比对时匹配或满足某一正值阈值计分T。T称为邻近字符计分阈值。这些初始邻近字符命中物充当用于引发搜索以发现含有它们的较长HSP的种子。字符命中物在两个方向上沿各序列延伸直至累积比对计分可得以增加。对于核苷酸序列,使用参数M(一对匹配残基的奖励计分;始终>0)和N(错配残基的惩罚计分;始终<0)来计算累积计分。对于氨基酸序列,计分矩阵用于计算累积计分。在以下情况下时停止字符命中物在各方向上的延伸:累积比对计分自它的最大达成值减少了数量X;由于一个或多个负计分残基比对的累积,累积计分达到零或低于零;或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用字长(W)11、预期值(E)10、截断值100、M=5、N=-4以及比较两个链作为缺省值。对于氨基酸(蛋白质)序列,BLASTP程序使用字长(W)3、预期值(E)10以及BLOSUM62计分矩阵作为缺省值(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。出于本发明的目的,BLAST2.0算法是在缺省参数下使用。
“噬菌体展示文库”是指外源性肽或蛋白质在其表面上表达的噬菌体的“文库”。外来肽或多肽被展示在噬菌体衣壳外表面上。外来肽可展示为作为噬菌体外壳蛋白的一部分并入的重组融合蛋白;通常不是噬菌体外壳蛋白,但能够变得并入衣壳外表面中的重组融合蛋白;或变得共价或非共价连接于所述蛋白质的蛋白质或肽。这是通过将外源性核酸序列***可被包装至噬菌体粒子中的核酸中来达成。所述外源性核酸序列可例如被***噬菌体外壳蛋白基因的编码序列中。如果外来序列是框内克隆,那么它编码的蛋白质将表达为外壳蛋白的一部分。因此,核酸序列的文库,如由编码一个或多个个体的整个B细胞谱系的基因区段制得的抗体谱系的文库,可被如此***噬菌体中以产生“噬菌体文库”。当代表由核酸文库编码的肽和蛋白质的那些肽和蛋白质由噬菌体展示时,产生“肽展示文库”。尽管多种噬菌体用于所述文库构建中,但通常使用丝状噬菌体(Dunn(1996)Curr.Opin.Biotechnol.7:547-553)。参见例如以下对噬菌体展示文库的描述。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源于两个或更多个物种的抗体。通常,轻链与重链两者的可变区均对应于抗体的源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的可变区,而恒定区与抗体中源于另一物种(通常是人)的序列同源以避免在那个物种中引发免疫应答。
术语“表位”或“抗原决定簇”或“抗原决定区”在本文中可互换使用,并且是指抗原的能够由特定抗体识别并特异性结合的部分。当抗原是多肽时,表位可由连续氨基酸以及通过蛋白质的三级折叠而相邻的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位在蛋白质变性后通常得以保留,而通过三级折叠形成的表位在蛋白质变性后通常丧失。表位通常包括至少3个、并且更通常至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。抗原决定簇可与完整抗原(即用于引发免疫应答的“免疫原”)竞争与抗体的结合。
通过其中所测试的免疫球蛋白抑制参照抗体特异性结合共同抗原的测定来测定抗体之间的竞争。已知众多类型的竞争性结合测定,例如:固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心式竞争测定(参见Stahli等,Methods inEnzymology 9:242-253(1983));固相直接生物素-抗生蛋白EIA(参见Kirkland等,J.Immunol.137:3614-3619(1986));固相直接标记测定、固相直接标记夹心式测定(参见Harlow和Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual,"Cold Spring Harbor Press(1988));使用1-125标记进行的固相直接标记RIA(参见Morel等,Molec.Immunol.25(1):7-15(1988));固相直接生物素-抗生蛋白EIA(Cheung等,Virology 176:546-552(1990));以及直接标记RIA(Moldenhauer等,Scand.J.Immunol.32:77-82(1990))。通常,所述测定涉及使用纯化的抗原结合于携带未标记的测试免疫球蛋白和标记的参照免疫球蛋白中的任一个的固体表面或细胞。通过测定在测试免疫球蛋白存在下结合于固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常,测试免疫球蛋白是过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参照抗体结合相同表位的抗体以及结合充分邻近于由参照抗体结合的表位的邻近表位以达成发生空间位阻的抗体。通常,当竞争性抗体过量存在时,它将抑制参照抗体与共同抗原的特异性结合至少50或75%。
可使用重组遗传学领域中的常规技术产生本发明的抗体,例如VH多肽、VL多肽或单链抗体。公开用于本发明中的一般性方法的基础教科书包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版2001)以及Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等编,1999)。
可通过将通常是鼠类抗体的供体抗体的特异性(即抗原结合环)移植于人框架来产生本发明的人源化抗体。本文提供的人轻链和重链的框架区可易于由从业者确定。重链和轻链的位置编号是根据常见编号流程,例如Kabat和Chothia编号流程来指定。Chothia编号流程与Kabat流程相同,但在CDR-L1和CDR-H1中在结构上不同的位置处放置***。除非另外指示,否则Kabat编号流程在本文中是关于序列位置加以使用。特定VH或VL序列中的氨基酸残基的位置不指特定序列中的氨基酸的编号,而是指如参照某一编号流程所指定的位置。
使用本领域中标准定义确定CDR的位置,以及因此人重链和轻链的框架区的位置。举例来说,通常使用以下四种定义。Kabat定义是基于序列可变性,并且被最通常使用。Chothia定义是基于结构环区域的位置。AbM定义是两者之间的折衷,由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用。接触定义新近已被引入,并且是基于对可用复合物晶体结构的分析。以下是使用四种不同定义获得的环位置,即CDR。
本发明的VH或VL序列包括与由SEQ ID NO:5-22、29-57、91-100或107-116所包含的序列通常具有至少70%同一性、更通常75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链或轻链。
此外,已在OS2966的CDR外部鉴定优选用于人源化VH和VL链中的许多重要残基。举例来说,在一个实施方案中,VH链中的一个或多个氨基酸残基与OS2966的VH链(SEQ ID NO:2)中的氨基酸残基是同一的,包括残基48、67、69、73、76、80、89、91和93。在一个实施方案中,VL链中的一个或多个氨基酸残基与OS2966的VL链(SEQ ID NO:4)中的氨基酸残基是同一的,包括残基36和71。
本发明的人源化抗体与供体抗体结合相同表位,例如结合例如OS2966所结合的相同整联蛋白β1表位,或竞争结合所述相同整联蛋白β1表位。用以确定抗体是否结合相同表位的方法在本领域中是熟知的,参见例如Harlow和Lane,Using Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999,其公开用以定位表位的技术或者用以确定抗体是否与供体抗体结合相同表位的竞争实验。
本发明的稳定人源化抗体在相较于供体抗体时可展现改变的亲和力。举例来说,在一些实施方案中,相较于包含OS2966VH和VL区的单链抗体,单链人源化抗整联蛋白β1的亲和力可例如降低。所述降低相比较来说可多达10倍,但通常,本发明的人源化抗体具有的亲和力是可比较野生型抗体的亲和力的至少25%、更常至少50%。(“可比较野生型抗体”是指同一实施方案的包含供体抗体VH和VL区的抗体,例如scFv)。在一些实施方案中,对表位的亲和力增加,以使本发明的人源化抗体具有的亲和力是可比较野生型抗体的亲和力的2倍,并且有时是5、10、50或100倍。
通常使用重组DNA技术获得本发明的重链和轻链区域。通常用于执行这个技术的重组DNA方法为本领域技术人员所熟知。通常,通过PCR,例如通过重叠延伸来产生编码框架和供体抗体的CDR的核酸序列。在这个技术中,通常通过将所需序列并入寡核苷酸中,以及使用PCR产生包含所需供体和人序列的一系列产物来使供体抗体的抗原结合序列接合于人框架区。可接着通常使用其它PCR反应使产物以适当定向接合以产生包含人框架区以及供体抗体CDR的VH和VL链。可直接或通过编码肽接头的DNA序列,使用为本领域技术人员所熟知的技术将VL和VH DNA序列连接在一起。这些技术包括PCR以及如体外连接的技术。VL和VH序列可以任一定向加以连接。
足以指导技术人员执行体外扩增方法的技术的实例在本领域中是熟知的。
不可商购的寡核苷酸可根据首先由Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetts.22:1859-1862(1981)所述的固相亚磷酰胺三酯方法,使用自动合成仪来化学合成,如Van Devanter等,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所述。寡核苷酸的纯化是通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过如Pearson和Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)中所述的阴离子交换HPLC来达成。
在克隆之后,可例如通过使用测序来验证克隆的基因和合成寡核苷酸的序列。
将PCR产物亚克隆至为本领域技术人员所熟知并且可商购的适合克隆载体中。接着确定重链或轻链编码区的核苷酸序列。
技术人员将了解利用对可变区提供的序列信息,使用为本领域技术人员所熟知的许多其它方法获得编码这些序列的核酸。因此,通过任何适合方法来制备编码Fv区的DNA,所述方法包括例如其它扩增技术,如连接酶链反应(LCR)、转录扩增和自持性序列复制、或克隆和限制适当序列。
编码本发明的抗体和抗体片段的核酸也可通过直接化学合成,使用如以下的方法来产生:磷酸三酯方法;磷酸二酯方法;二乙基亚磷酰胺方法;以及美国专利号4,458,066的固体载体方法。如果DNA序列是化学合成,那么将产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交,或通过用DNA聚合酶,使用单链作为模板进行聚合来转化成双链DNA。尽管有可能化学合成整个单链Fv区,但优选的是合成许多较短序列(约100至150个碱基),其通常稍后例如使用重叠延伸PCR剪接在一起。
对于核酸,大小是以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些是由琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、测序的核酸或公开的DNA序列获得的估计值。对于蛋白质,大小是以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数目给出。蛋白质大小是由凝胶电泳、测序的蛋白质、获得的氨基酸序列或公开的蛋白质序列所估计。
本发明的抗体的VH和VL结构域可直接连接或可由接头分隔例如以分别使轻链和重链的可变抗体结构域稳定化。适合接头为本领域技术人员所熟知,并且包括熟知GlyGlyGlyGlySer(SEQ ID NO:122)接头或其变体。举例来说,典型接头是(Gly4Ser)3(SEQID NO:123)。可用于本发明中的其它接头(包括铰链区)包括例如以下中所述的那些:Alfthan等,Protein Eng.8(7),725-31;Choi等,Eur.J Immunol.31(1),94-106;Hu等,Cancer Res.56(13),3055-61;Kipriyanov,等,Protein Eng.10(4),445-53;Pack,等,Biotechnology(N Y)11(11),1271-7;以及Roovers,等,Cancer Immunol.Immunother.50(l):51-9。
为获得克隆的基因或核酸,如编码人源化抗体(例如本发明的人源化抗体)或包含本发明的人源化抗体的免疫缀合物或嵌合抗体的那些cDNA的高水平表达,通常将编码抗体或免疫缀合物的核酸亚克隆至表达载体中,所述表达载体含有用以指导转录的适当启动子、转录/翻译终止子,以及如果对于编码蛋白质的核酸,则含有用于翻译起始的核糖体结合位点。适合细菌启动子在本领域中是熟知的,并且例如描述于Sambrook等以及Ausubel等中。用于表达蛋白质的细菌表达***可用于例如大肠杆菌(E.coli)、杆菌属(Bacillussp.)和沙门氏菌属(Salmonella)中(Palva等,Gene 22:229-235(1983);Mosbach等,Nature302:543-545(1983))。可商购所述表达***的试剂盒。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达***在本领域中是熟知的,并且也可商购。
常常,为在细胞中在高水平下表达蛋白质,在构建待表达的核酸序列时考虑表达***的密码子偏好。因此,来自一种生物体,例如人或小鼠的核酸可被工程化来适应表达***的密码子偏好。
用于指导异源核酸的表达的启动子取决于特定应用。启动子任选如同它在它的天然环境中离转录起始位点的距离一般,位于离异源转录起始位点大致相同的距离。然而,如本领域中所知,可接受这个距离的某一变化形式而不损失启动子功能。
除启动子之外,表达载体通常含有转录单元或表达盒,其含有为在宿主细胞中表达蛋白质编码核酸所需的所有其它元件。因此,典型表达盒含有可操作地连接于编码待表达的蛋白质的核酸序列的启动子和为转录物的高效聚腺苷酸化、核糖体结合位点以及翻译终止所需的信号。编码蛋白质的核酸序列可通常连接于可裂解信号肽序列以促进编码的蛋白质由转化细胞分泌。所述信号肽将尤其包括来自组织纤维蛋白溶酶原活化因子、胰岛素和神经元生长因子、以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信号肽。其它盒元件可包括增强子,并且如果基因组DNA用作结构基因,那么包括具有功能性剪接供体和接受***点的内含子。
除启动子序列之外,表达盒也应在结构基因的下游含有转录终止区以提供高效终止。终止区可自与启动子序列相同的基因获得或可自不同基因获得。
适用于特定宿主细胞中的表达控制序列常通过克隆在那个细胞中表达的基因来获得。通常使用的在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的原核控制序列包括所述通常用作β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子***(Change等,Nature(1977)198:1056)、色氨酸(trp)启动子***(Goeddel等,Nucleic Acids Res.(1980)8:4057)、tac启动子(DeBoer,等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:21-25);和λ源性PL启动子的启动子以及N-基因核糖体结合位点(Shimatake等,Nature(1981)292:128)。特定启动子***对于本发明来说并不关键,可使用在原核生物中起作用的任何可用启动子。
标准细菌表达载体包括质粒,如基于pBR322的质粒,例如pBLUESCRIPTTM、pSKF、pET23D、λ-噬菌体源性载体;以及融合表达***,如GST和LacZ。表位标签也可添加至重组蛋白中以提供便利分离方法,所述标签例如c-myc、HA标签、6-His标签(SEQ ID NO:124)、麦芽糖结合蛋白、VSV-G标签、抗DYKDDDDK标签(SEQ ID NO:125)或任何所述标签,其中许多为本领域技术人员所熟知。
用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达***在本领域中是熟知的,并且也可商购。在酵母中,载体包括酵母整合质粒(例如YIp5)和酵母复制质粒(YRp系列质粒)以及pGPD-2。含有来自真核病毒的调控元件的表达载体通常用于真核表达载体,例如SV40载体、***状瘤病毒载体和源于艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)的载体中。其它示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE以及允许在CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、多角体蛋白启动子或显示有效用于在真核细胞中表达的其它启动子指导下表达蛋白质的任何其它载体。
一些表达***具有提供基因扩增的标记,如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。或者,不涉及基因扩增的高产率表达***也是适合的,如在昆虫细胞中使用具有在多角体蛋白启动子或其它强烈杆状病毒启动子指导下的GPCR编码序列的杆状病毒载体。
通常包括在表达载体中的元件也包括在大肠杆菌中起作用的复制子、编码抗生素抗性以允许选择具有重组质粒的细菌的基因、以及在质粒的非必需区域中的用以允许***真核序列的独特限制位点。所选的特定抗生素抗性基因并不是关键的,本领域中已知的许多抗性基因中的任一个都是适合的。必要时,任选选择原核序列以使它们不干扰DNA在真核细胞中的复制。
标准转染方法用于产生表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系,所述蛋白质接着使用标准技术加以纯化(参见例如Colley等,J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989);Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,第182卷(Deutscher编,1990))。根据标准技术来进行真核和原核细胞的转化(参见例如Morrison,J.Bact.132:349-351(1977);Clark-Curtiss和Curtiss,Methods in Enzymology 101:347-362(Wu等编,1983))。
可使用用于将外来核苷酸序列引入宿主细胞中的任何熟知程序。这些程序包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传物质引入宿主细胞中的任何其它熟知方法(参见例如Sambrook和Russell(上文))。仅为必要的是所用特定遗传工程程序能够将至少一种基因成功引入能够表达本发明的多肽的宿主细胞中。
在将表达载体引入细胞之后,在有利于表达蛋白质的条件下培养转染的细胞,所述蛋白质使用以下鉴定的标准技术自培养物回收。
技术人员将认识到可对编码本发明的多肽(即抗体、标记或效应物或使用抗体形成的免疫缀合物)的核酸进行修饰而不减弱它的生物活性。可进行有助于克隆、表达靶标分子或将靶标分子并入融合蛋白中的一些修饰。所述修饰为本领域技术人员所熟知,并且包括例如终止密码子、在氨基末端处添加甲硫氨酸以提供起始位点、在任一末端上放置额外氨基酸以产生适宜定位的限制位点、或用以有助于纯化步骤的额外氨基酸(如多聚His)。
一旦表达,本发明的重组抗体、免疫缀合物和/或效应物分子即可根据本领域的标准程序加以纯化,所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法等(大体上参见R.Scopes,PROTEIN PURIFICATION,Springer-Verlag,N.Y.(1982))。具有至少约90至95%均质性的大致上纯的组合物是优选的,并且98至99%或更大均质性最优选用于药物用途。一旦部分纯化或纯化达到如所需的均质性,如果待在治疗上使用,那么多肽应大致上不含内毒素。
用于由如大肠杆菌的细菌表达单链抗体和/或再折叠成适当活性形式(包括单链抗体)的方法已被描述且是熟知的,并且可适用于本发明的抗体。参见Buchner,等,AnalBiochem.205:263-270(1992);Pluckthun,Biotechnology 9:545(1991);Huse,等,Science246:1275(1989)以及Ward,等,Nature 341:544(1989),都以引用的方式并入本文。
常常,自包涵体分离来自大肠杆菌或其它细菌的功能性异源蛋白质,并且需要使用强变性剂进行溶解以及后续再折叠。如本领域中所熟知,在溶解步骤期间,必须存在还原剂以分开二硫键。具有还原剂的示例性缓冲液是:0.1M Tris(pH 8)、6M胍、2mM EDTA、0.3MDTE(二硫赤藓糖醇)。二硫键的再氧化可在呈还原和氧化形式的低分子量硫醇试剂存在下发生,如以引用的方式并入本文的Saxena,等,Biochemistry 9:5015-5021(1970)中所述,并且尤其如由Buchner,等(上文)所述。
通常通过将变性和还原的蛋白质稀释(例如100倍)至再折叠缓冲液中来达成复性。示例性缓冲液是0.1M Tris(pH 8.0)、0.5M L-精氨酸、8mM氧化谷胱甘肽(GSSG)和2mMEDTA。
作为对双链抗体纯化方案的修改,分别溶解和还原重链和轻链区,接着在再折叠溶液中组合。当这两种蛋白质以使得一种蛋白质不超过另一种蛋白质5倍摩尔过量的摩尔比混合时,获得优选产率。可合乎需要的是在完成氧化还原改组之后添加过量氧化谷胱甘肽或其它氧化低分子量化合物至再折叠溶液中。
除重组方法之外,也可使用标准肽合成来完全或部分构建本发明的抗体和免疫缀合物。可通过使序列的C末端氨基酸连接于不溶性载体,随后依序添加序列中的剩余氨基酸来达成长度是小于约50个氨基酸的本发明多肽的固相合成。用于固相合成的技术由Barany和Merrifield,THE PEPTIDES:ANALYSIS,SYNTHESIS,BIOLOGY.第2卷:SPECIAL METHODS INPEPTIDE SYNTHESIS,PART A.第3-284页;Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156(1963)以及Stewart,等,SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS,第2版,Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)所述。可通过较短片段的氨基和羧基末端的缩合来合成长度更大的蛋白质。通过活化羧基末端(例如通过使用偶联试剂N,N'-二环己基碳二亚胺)来形成肽键的方法为技术人员所知。
本发明的抗体的保守修饰的变体在氨基酸水平上与目标蛋白质(如本发明的人源化抗体)具有至少80%序列类似性、通常至少85%序列类似性、90%序列类似性、或至少95%、96%、97%、98%或99%序列类似性。
如所指示,术语“保守修饰的变体”可应用于氨基酸序列与核酸序列两者。就特定核酸序列而言,保守修饰的变体是指编码同一或基本上同一氨基酸序列的那些核酸序列,或如果核酸不编码氨基酸序列,那么是指基本上同一核酸序列。由于遗传密码的简并性,许多在功能上相同的核酸编码任何给定多肽。举例来说,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在其中丙氨酸由密码子指定的每个位置处,所述密码子可改变成所述任何相应密码子而不改变编码的多肽。所述核酸变化是“沉默变化”,其是一种保守修饰的变化。本文每个编码多肽的核酸序列也描述核酸的每个可能的沉默变化。技术人员将认识到核酸中的各密码子(除AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)之外)可被修饰来产生在功能上相同的分子。因此,编码多肽的核酸的各沉默变化隐含于各所述序列中。
关于氨基酸序列,技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”,其中改变导致氨基酸被化学类似氨基酸取代。
本发明的一个实施方案提供一种包含连接于效应物分子或可检测标记的本发明的人源化抗体的免疫缀合物。优选地,效应物分子是治疗分子,例如像毒素、化学治疗剂、小分子、细胞因子或趋化因子、酶或放射性标记。示例性毒素包括但不限于假单胞菌外毒素或白喉毒素。适合毒素例如描述于Chaudhary,等(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84:4538;Chaudhary,等(1989)Nature 339:394;Batra,等(1991)Mol Cell Biol 11:2200;Brinkmann,等(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:8616;Siegall,(1995)Semin CancerBiol 6:289中。小分子的实例包括但不限于化学治疗化合物,如泰素(taxol)、多柔比星(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleiomycin)。示例性细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-12。适合的细胞因子和趋化因子例如描述于Rosenblum等(2000)Int J Cancer 88:267以及Xu等(2000)Cancer Res 60:4475和Biragyn等(1999)Nat Biotechnol 17:253中。示例性酶包括但不限于RNA酶、DNA酶、蛋白酶、激酶和胱天蛋白酶(caspase)。适合蛋白酶例如描述于Bosslet等(1992)Br J Cancer 65:234;Goshom等(1993)Cancer Res 53:2123;Rodrigues等(1995)Cancer Res 55:63;Michael等(1996)Immunotechnology 2:47;Haisma等(1998)Blood 92:184中。示例性放射性同位素包括但不限于32P和125I。适合放射性核素也例如描述于Colcher等(1999)Ann NY Acad Sci880:263中。其它示例性效应物部分是例如来自同源或异源抗体的Fc片段。
本领域技术人员应了解任何蛋白质效应物分子的序列都可以不实质上影响效应物蛋白质的功能性优势的方式改变。举例来说,甘氨酸和丙氨酸通常被视为可互换,天冬氨酸和谷氨酸以及天冬酰胺和谷氨酰胺也是如此。本领域技术人员将认识到效应物序列的许多不同变化形式将编码与天然效应物具有大致相同活性的效应物。
可通过如上所述的化学或重组手段来使效应物分子和抗体缀合。化学修饰包括例如出于直接或通过连接化合物彼此连接效应物分子和抗体的目的,通过蛋白质化学领域中熟知的方法进行衍生化。共价连接手段与非共价连接手段两者均可与本发明的人源化抗体一起使用。
用于使效应物分子连接于抗体的程序将根据待连接于抗体的部分的化学结构而变化。多肽通常含有多种官能团;例如羧酸(COOH)、游离胺(--NH2)或硫氢基(--SH),其可用于与抗体上的适合官能团反应以导致效应物分子的结合。
或者,使抗体衍生以暴露或连接其它反应性官能团。衍生可涉及连接许多接头分子中的任一个,所述接头分子如可自Pierce Chemical Company,Rockford Ill获得的那些。
接头能够与抗体和与效应物分子两者形成共价键。适合接头为本领域技术人员所熟知,并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当抗体和效应物分子是多肽时,接头可通过组成型氨基酸的侧基接合于它们(例如通过二硫键接合于半胱氨酸)。然而,在一优选实施方案中,接头将接合于末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
在一些情况下,可合乎需要的是当免疫缀合物已到达它的靶标部位时,自抗体释放效应物分子。因此,在这些情况下,免疫缀合物将包含在靶标部位附近可裂解的键联。裂解接头以自抗体释放效应物分子可由免疫缀合物在靶标细胞内部或在靶标部位附近所经受的酶活性或条件来促使。当靶标部位是肿瘤时,可使用在存在于肿瘤部位处的条件下可裂解(例如当暴露于肿瘤相关酶或酸性pH时)的接头。
在目前优选化学缀合实施方案中,连接效应物分子和抗体的手段包括最终有助于在效应物分子与抗体之间形成分子间二硫键的异双官能偶联试剂。适用于本发明的这个能力中的其它类型的偶联试剂例如描述于美国专利号4,545,985中。或者,可便利地在效应物分子和抗体的天然存在或通过遗传工程***的半胱氨酸之间形成分子间二硫化物。连接效应物分子和抗体的手段也可使用在异双官能交联试剂之间的硫醚键联或特定低pH可裂解交叉接头或特定蛋白酶可裂解接头或其它可裂解或不可裂解化学键联。连接效应物分子和抗体的手段也可包括在分别通过标准肽合成化学或重组手段合成的效应物分子与抗体之间形成肽基键。
本发明的效应物分子和抗体的示例性化学修饰包括根据熟知方法(参见例如Lisi,等,Applied Biochem.4:19(1982);Beauchamp,等,Anal Biochem.131:25(1982);以及Goodson,等,Bio/Technology 8:343(1990))用聚乙二醇(PEG)衍生化以延长在循环***中的滞留时间,并且降低免疫原性。
本发明的抗体可任选共价或非共价连接于可检测标记。适于所述用途的可检测标记包括可通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。适用于本发明中的标记包括磁性珠粒(例如DYNABEADS)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、得克萨斯红(Texas red)、若丹明(rhodamine)、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和通常用于ELISA中的其它酶)、以及比色标记,如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠粒。
检测所述标记的手段为本领域技术人员所熟知。因此,举例来说,可使用摄影胶片或闪烁计数器检测放射性标记,可使用用以检测发射的发光的光检测器检测荧光标记。通常通过向酶提供底物,以及检测通过酶作用于底物所产生的反应产物来检测酶标记,并且通过只是观察显色的标记来检测比色标记。
本发明的抗体和/或免疫缀合物组合物特别适用于胃肠外施用,如静脉内施用或向体腔中施用。
供施用的组合物将通常包含抗体和/或免疫缀合物溶解于药学上可接受的载体,优选是水性载体中的溶液。可使用多种水性载体,例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的,并且通常不含不合需要的物质。这些组合物可通过常规熟知灭菌技术来灭菌。组合物可含有如为接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质,如pH调整剂和缓冲剂、毒性调整剂等,例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的融合蛋白的浓度可广泛变化,并且将主要根据所选特定施用模式和患者的需要,基于流体体积、粘度、体重等来选择。
因此,供静脉内施用的本发明的典型药物组合物将为每天每名患者约0.1至10mg。可使用每天每名患者0.1直至约100mg的剂量。用于制备可施用组合物的实际方法将为本领域技术人员所知或显而易知,并且更详细描述于如REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCE,第19版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1995)的出版物中。
可施用本发明的组合物以达成治疗性治疗。在治疗应用中,组合物是以足以治愈或至少部分遏止疾病和它的并发症的量向罹患所述疾病的患者施用。足以达成这个作用的量定义为“治疗有效剂量”。有效用于这个用途的量将取决于疾病的严重性和患者的总体健康状态。化合物的有效量是提供如由临床医师或其它合格观察者所注意到的主观症状减轻或客观可识别改进的量。
视如由患者所需以及所耐受的剂量和频率而定来施用单次或多次组合物施药。在任何情况下,组合物都应提供足量的本发明的蛋白质以有效治疗患者。优选地,剂量是一次性施用,但可定期施加直至达成治疗结果或直至副作用成为中止疗法的根据。通常,剂量应足以治疗或改善疾病的症状或征象而不对患者产生不可接受的毒性。
本发明的免疫缀合物组合物的控制释放胃肠外制剂可制备成植入物、油性注射液或颗粒***。对于蛋白质递送***的广泛概述,参见以引用的方式并入本文的Banga,A.J.,THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS:FORMULATION,PROCESSING,AND DELIVERYSYSTEMS,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,Pa.,(1995)。颗粒***包括微球体、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球体和纳米粒子。微胶囊含有治疗性蛋白质作为中心核。在微球体中,治疗剂是分散在整个粒子中。小于约1μm的粒子、微球体和微胶囊通常分别称为纳米粒子、纳米球体和纳米胶囊。毛细血管具有约5μm的直径以致仅纳米粒子是静脉内施用。微粒的直径通常是约100μm,并且是皮下或肌肉内施用。参见例如Kreuter,J.,COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS,J.Kreuter编,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第219-342页(1994);以及Tice和Tabibi,TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY,A.Kydonieus编,Marcel Dekker,Inc.New York,N.Y.,第315-339页,(1992),其两者均以引用的方式并入本文。
聚合物可用于本发明的免疫缀合物组合物的离子控制释放。用于控制药物递送的各种可降解和不可降解聚合基质在本领域中是已知的(Langer,R.,AccountsChem.Res.26:537-542(1993))。举例来说,嵌段共聚物泊洛沙姆407(polaxamer 407)在低温下以粘稠但可移动液体形式存在,但在体温下形成半固体凝胶。已显示它是配制和持续递送重组白介素-2和脲酶的有效媒介物(Johnston,等,Pharm.Res.9:425-434(1992);以及Pec,等,J.Parent.Sci.Tech.44(2):58-65(1990))。或者,羟磷灰石已用作用于控制释放蛋白质的微载体(Ijntema,等,Int.J.Pharm.112:215-224(1994))。在另一方面,脂质体用于脂质囊封药物的控制释放以及药物靶向(Betageri,等,LIPOSOME DRUG DELIVERYSYSTEMS,Technomic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.(1993))。用于控制递送治疗性蛋白质的众多其它***是已知的。参见例如美国专利号5,055,303、5,188,837、4,235,871、4,501,728、4,837,028、4,957,735和5,019,369、5,055,303;5,514,670;5,413,797;5,268,164;5,004,697;4,902,505;5,506,206、5,271,961;5,254,342和5,534,496,其各自以引用的方式并入本文。
如本文所用,术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的其中细胞群体的特征在于细胞生长不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、良性或恶性肿瘤。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、***癌、阴门癌、甲状腺癌、脑癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈部癌、I型或II型神经纤维瘤病。所述癌症的其它实例包括具有疗法抗性、难治性或转移性的那些。
可治疗的其它疾病或病症包括“炎性疾病或病症”。如本文所用的“炎性疾病或病症”包括且不限于瘙痒、皮肤炎症、牛皮癣、多发性硬化症、类风湿性关节炎、骨关节炎、全身性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroidis)、重症肌无力、I型或II型糖尿病、哮喘、炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、异位性皮炎、过敏性接触性皮炎、刺激性接触性皮炎、脂溢性皮炎、肖格伦氏综合征(Sjoegren's syndrome)、角膜结膜炎、葡萄膜炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、关节、皮肤或肌肉的炎性疾病、急性或慢性特发性炎性关节炎、肌炎、脱髓鞘疾病、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、间质性肾炎和慢性活动性肝炎。
如本文所用的“转移”是指癌自来源部位散布或转移至其它身体区域,伴有在新位置处产生类似癌性病变所依的过程。“转移性”或“转移”细胞是丧失与相邻细胞的粘着接触,并且通过血流或淋巴液自原发性疾病部位迁移以侵袭相邻身体结构的细胞。
如本文所用,术语“受试者”是指将为特定治疗剂的接受者的任何动物(例如哺乳动物),包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等。通常,术语“受试者”和“患者”在本文中可关于人受试者互换使用。
如本文所用,术语“怀疑患有癌症的受试者”是指呈现一种或多种指示癌症的症状(例如显而易见的团块或肿块)或针对癌症加以筛选(例如在常规身体检查期间)的受试者。怀疑患有癌症的受试者也可具有一种或多种风险因素。怀疑患有癌症的受试者通常尚未针对癌症加以测试。然而,“怀疑患有癌症的受试者”涵盖已接受初始诊断,但其癌症时期未知的个体。所述术语进一步包括曾经患有癌症的人(例如处于缓解状态的个体)。
如本文所用,术语“处于癌症风险下的受试者”是指具有一种或多种显现特定癌症的风险因素的受试者。风险因素包括但不限于性别、年龄、遗传倾向性、环境暴露、先前癌症事件、先前存在非癌症疾病和生活方式。
如本文所用,术语“表征受试者的癌症”是指鉴定受试者的癌样品的一种或多种性质,包括但不限于良性、癌性前或癌性组织的存在性、癌症的时期、以及受试者的预后。可通过鉴定一种或多种癌症标记基因(包括但不限于本文公开的癌症标记)的表达来表征癌症。
如本文所用,术语“细胞癌症标记”、“癌细胞标记”、“肿瘤细胞标记”或“实体肿瘤细胞标记”是指一种或多种基因或由所述一种或多种基因表达的蛋白质、多肽或肽,相较于非致肿瘤细胞,单独或与其它基因组合的所述一种或多种基因的表达水平与致肿瘤癌细胞的存在相关,如整联蛋白β1。关联可涉及基因表达增加或降低(例如由基因编码的mRNA或肽的水平增加或降低)。
如本文所用,术语“相对于非癌性对照检测表达降低或增加”是指相对于非癌性对照样品中的水平测量基因表达水平(例如mRNA或蛋白质的水平)。可使用任何适合方法(包括但不限于本文所述的那些)来测量基因表达。
如本文所用,术语“相对于在不存在所述测试化合物下检测在所述测试化合物存在下细胞样品中的基因表达变化”是指相对于在不存在测试化合物下测量在所述测试化合物存在下的表达水平改变(例如增加或降低)。可使用任何适合方法测量基因表达。
如本文所用,术语“用于使用所述试剂盒以检测所述受试者的癌症的说明书”包括用于使用试剂盒中含有的试剂以检测和表征来自受试者的样品中的癌症的说明书。
如本文所用,“提供诊断”或“诊断信息”是指适用于确定患者是否患有疾病或病状和/或将所述疾病或病状分类至表型种类或关于所述疾病或病状的预后或对治疗(一般来说的治疗或任何特定治疗)的可能应答具有重要性的任何种类中的任何信息。类似地,诊断是指提供任何类型的诊断信息,包括但不限于受试者是否可能患有病状(如肿瘤)、与如例如高风险肿瘤或低风险肿瘤的肿瘤的性质或分类相关的信息、与预后相关的信息和/或适用于选择适当治疗的信息。选择治疗可包括选择特定化学治疗剂或其它治疗模态,如手术或放射,或关于停止或递送疗法的选择。
如本文所用,术语“提供预后”、“预后信息”或“预测信息”是指提供关于癌症(例如如通过本发明的诊断方法所确定)的存在对受试者的未来健康状况的影响的信息(例如预期罹病或死亡、患癌的可能性和转移风险)。
如本文所用,术语“手术后肿瘤组织”是指已自受试者移除(例如在手术期间)的癌性组织(例如活检组织)。
如本文所用,术语“诊断有癌症的受试者”是指已被测试并且发现具有癌性细胞的受试者。可使用任何适合方法,包括但不限于活检、x射线、血液测试和本发明的诊断方法来诊断癌症。
如本文所用,术语“活检组织”、“患者样品”、“肿瘤样品”和“癌样品”是指出于确定样品是否含有癌性组织(包括癌细胞)的目的或为测定那个癌性组织的基因表达谱而自受试者移除的细胞、组织或流体的样品。在某一实施方案中,获得活检组织或流体,因为受试者被怀疑患有癌症。接着考查活检组织或流体存在或不存在癌、癌细胞和/或癌细胞基因标志表达。
在本发明的某些实施方案中,癌细胞表达(如胰腺癌细胞表达、结肠癌细胞表达、乳癌细胞表达、肝癌细胞表达、肾癌细胞表达、脑癌细胞表达、GBM癌细胞表达等)包括相较于非致肿瘤结肠肿瘤细胞,整联蛋白β1的水平升高。整联蛋白是由α链与β链两者组成的异二聚细胞外基质(ECM)细胞表面蛋白质,其中各链与多种伴侣缔合以形成不同整联蛋白。整联蛋白在细胞粘着和迁移方面起使细胞可逆连接于细胞外基质或其它细胞上的受体的作用,并且因此可在癌症侵袭和转移中起关键作用。整联蛋白介导的粘着也影响细胞内信号传导,并且因此可调控细胞存活、增殖和分化。
整联蛋白β1可与最大多样性的已知α整联蛋白形成功能性受体,从而导致能够与不同范围的ECM环境相互作用,并且已牵涉于癌症中。举例来说,在临床上以及在乳癌细胞系中,β1整联蛋白信号传导增加均与乳癌的恶性进展相关。
整联蛋白β1已被鉴定为直接影响肿瘤生长。具体来说,用抗整联蛋白β1抗体处理肿瘤细胞会降低肿瘤尺寸,并且抑制转移。
在一些实施方案中,本发明提供用于检测作为癌症的标记的整联蛋白β1的表达的方法。在一些实施方案中,直接测量(例如在蛋白质水平上)表达,在一些实施方案中,检测组织样品(例如活检组织)中的表达。在其它实施方案中,检测体液(例如包括但不限于血浆、血清、全血、粘液和尿)中的表达。本发明进一步提供用于检测标记的试剂盒,在一些实施方案中,细胞癌症标记的存在用于向受试者提供预后。提供的信息也用于指导治疗过程。举例来说,如果发现受试者具有指示实体肿瘤细胞的标记,那么其它疗法(例如激素或放射疗法)可在它们更可能有效的较早时刻(例如在转移之前)开始。此外,如果发现受试者具有对激素疗法不应答的肿瘤,那么可避免所述疗法的花费和不便。
在实施方案中,通过测量蛋白质的水平来检测整联蛋白β1的基因表达。可通过任何适合方法来检测蛋白质表达。在一些实施方案中,通过利用本文所述的抗体进行免疫组织化学分析来检测蛋白质。
通过本领域中已知的技术(例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心式”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定(例如凝胶凝集测定、血凝集测定等)、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定和免疫电泳测定等)来检测抗体结合。
在一个实施方案中,通过检测初级抗体上的标记来检测抗体结合。在另一实施方案中,通过检测二级抗体或试剂与初级抗体的结合来检测初级抗体。在另一实施方案中,二级抗体被标记。本领域中已知用于在免疫测定中检测结合的许多方法,并且所述方法在本发明的范围内。
在一些实施方案中,利用自动检测测定。用于使免疫测定自动化的方法包括美国专利5,885,530、4,981,785、6,159,750和5,358,691中所述的那些,所述专利各自以引用的方式并入本文。在一些实施方案中,结果的分析和呈现也是自动的。举例来说,在一些实施方案中,利用基于存在或不存在对应于癌症标记的一系列蛋白质来产生预后的软件。
在其它实施方案中,可使用美国专利5,599,677和5,672,480中所述的免疫测定,所述专利各自以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中,基于计算机的分析程序用于将由检测测定产生的原始数据(例如一种或多种给定标记的存在、不存在或量)转变成供临床医师用的预测值的数据。临床医师可使用任何适合手段获取预测数据。因此,在一些实施方案中,本发明提供不可能在遗传学或分子生物学方面受训练的临床医师无需理解原始数据的进一步益处。数据被以它的最适用形式直接向临床医师呈现。临床医师接着能够立刻利用信息来优化对受试者的护理。
本发明涵盖能够向以及自进行测定的实验室、信息提供者、医疗人员和受试者接收、处理和传送信息的任何方法。举例来说,在本发明的一些实施方案中,自受试者获得样品(例如活检或血清或尿样品),并且提交至位于世界任何部分(例如在不同于受试者居住所处或最终使用信息所处的国家的国家)的剖析服务机构(例如在医学机构处的临床实验室、基因组剖析商行等)以产生原始数据。当样品包括组织或其它生物样品时,受试者可拜访医学中心以获得样品,并且递送至剖析中心,或受试者可自己收集样品,并且直接将它递送至剖析中心。当样品包括先前确定的生物信息时,信息可由受试者直接递送至剖析服务机构(例如含有信息的信息卡可由计算机扫描,并且使用电子通信***将数据传送至剖析中心的计算机)。一旦由剖析服务机构接收,样品即被处理,并且产生为受试者所需的诊断或预后信息所特有的剖析结果(例如表达数据)。
接着以适于由治疗临床医师解释的形式制取剖析数据。举例来说,并非提供原始表达数据,制取的形式可代表对受试者的诊断或风险评估以及关特定治疗选项的推荐。数据可通过任何适合方法向临床医师显示。举例来说,在一些实施方案中,剖析服务机构产生可被打印给临床医师(例如在护理点)或在计算机监视器上向临床医师显示的报告。
在一些实施方案中,首先在护理点或在区域性机构分析信息。接着将原始数据递送至中心处理机构供进一步分析和/或以使原始数据转化成适用于临床医师或患者的信息。中心处理机构提供隐私(所有数据都在统一安全协议下储存在中心机构中)、速度和数据分析统一性的优势。中心处理机构可接着在治疗受试者之后控制数据的去向。举例来说,使用电子通信***,中心机构可向临床医师、受试者或研究者提供数据。
在一些实施方案中,受试者能够使用电子通信***直接获取数据。受试者可基于结果选择进一步干预或咨询。在一些实施方案中,数据用于研究目的。举例来说,数据可用于进一步优化作为疾病的特定状况或时期的适用指标的标记的纳入或去除。
在其它实施方案中,本发明提供用于检测和表征癌症的试剂盒。在一些实施方案中,除检测试剂和缓冲液之外,试剂盒也含有对癌症标记具有特异性的抗体,如本发明的抗体。在其它实施方案中,试剂盒含有特异性用于检测mRNA或cDNA的试剂(例如寡核苷酸探针或引物)。在一些实施方案中,试剂盒含有为进行检测测定所必需和/或足以进行检测测定的所有组成部分,包括所有对照、用于进行测定的说明书、以及用于分析和呈现结果的任何必需软件。
本发明的另一实施方案包括一种用以测试例如组织样品中或体液中存在如整联蛋白β1的蛋白质的试剂盒。所述试剂盒可包括例如用于检测多肽的抗体。此外,所述试剂盒可包括参照或对照样品;用于处理样品、进行测试以及解释结果的说明书;以及为进行测试所必需的缓冲液和其它试剂。
在一些实施方案中,体内成像技术用于观察癌症标记在动物(例如人或非人哺乳动物)中的表达。举例来说,在一些实施方案中,使用本发明的标记的抗体来标记整联蛋白β1。可使用体内成像方法检测个体中特异性结合以及标记的抗体,所述方法包括但不限于放射性核素成像、正电子发射断层摄影术、计算机轴向断层摄影术、X射线或磁共振成像方法、荧光检测和化学发光检测。
本发明的体内成像方法适用于诊断表达本发明的实体肿瘤细胞癌症标记(例如在乳癌中)的癌症。体内成像用于观察指示癌症的标记的存在性。所述技术允许在不使用不合意活检下进行诊断。本发明的体内成像方法也适用于向癌症患者提供预后。举例来说,可检测指示癌细胞的标记的存在性。本发明的体内成像方法可进一步用于检测其它身体部分中的转移性癌症。
在一些实施方案中,对本发明的癌症标记具有特异性的试剂(例如抗体)被荧光标记。将标记的抗体引入受试者中(例如经口服或经胃肠外)。使用任何适合方法(例如使用以引用的方式并入本文的美国专利6,198,107中所述的装置)检测荧光标记的抗体。
在其它实施方案中,抗体被放射性标记。用于体内诊断的抗体的使用在本领域中是熟知的。
在一些实施方案中,鉴于整联蛋白β1在如上讨论的较广泛功能性活性方面的作用,本发明提供针对包括免疫性/炎性疾病和病症的疾病和病症的疗法。此外,可由本发明的组合物靶向的疾病和病症包括多发性硬化症、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、炎性肠病等。类似地,将预期可靶向某些眼相关疾病,包括湿性年龄相关的黄斑部变性(AMD)。
在一些实施方案中,本发明提供针对如癌症(例如乳癌、脑癌、***癌和结肠癌)的疾病的疗法。在一些实施方案中,疗法靶向癌症标记,如整联蛋白β1。
在一些实施方案中,本发明提供靶向表达例如整联蛋白β1的细胞癌症标记的肿瘤的抗体。
在一些实施方案中,治疗性抗体包括如上讨论的缀合于细胞毒性剂的本发明的抗体。
提供以下实施例以进一步说明本发明的优势和特征,但不意图限制本发明的范围。尽管它们代表可能使用的那些,但可或者使用为本领域技术人员所知的其它程序、方法或技术。
实施例1
可变区基因测序
使编码OS2966抗人整联蛋白β1单克隆抗体的基因经受可变(V)区序列分析。使用RNAqueous-4PCR KitTM(Ambion,Warrington,UK)自3至10×106个杂交瘤细胞提取总RNA,并且用于合成cDNA。使用如表1中所示的简并小鼠前导序列引物(Sigma)和独特恒定结构域引物(Sigma),通过PCR来扩增鼠类免疫球蛋白重链和κ轻链V区片段。将所得PCR片段亚克隆至pGEM-T Easy ITM载体***(Promega,Southampton,UK)中,并且使用载体特异性引物M13Forward(Sigma)将***物测序。所有DNA测序都由Geneservice Ltd Cambridge,UK)进行。获得OS2966的独特V区核苷酸序列(SEQ ID NO:1(VH)和SEQ ID NO:3(VL))。
表1.
序列 | 名称-池 | SEQ ID NO |
ATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT | MuIgVH5′-A | 58 |
ATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT | MuIgVH5′-B | 59 |
ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT | MuIgVH5′-C | 60 |
ATGGCTGTCYTRGBGCTGYTCYTCTG | MuIgVH5′-C | 61 |
ATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT | MuIgVH5′-C | 62 |
ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT | MuIgVH5′-D | 63 |
ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT | MuIgVH5′-D | 64 |
ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT | MuIgVH5′-D | 65 |
ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT | MuIgVH5′-E | 66 |
ATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRT | MuIgVH5′-E | 67 |
ATGGRATGGASCKKIRTCTTTMTCT | MuIgVH5′-E | 68 |
ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT | MuIgVH5′-F | 69 |
ATGTACTTGGGACTGAGCTGTGTAT | MuIgVH5′-F | 70 |
ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG | MuIgVH5′-F | 71 |
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG | MuIgVH5′-F | 72 |
CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG | MuIgGVH3′-2 | 73 |
ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT | MuIgkVL5′-A | 74 |
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT | MuIgkVL5′-B | 75 |
ATGGAGWAGACACACTSCTGYTATGGGT | MuIgkVL5′-C | 76 |
ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT | MuIgjVL5′-D | 77 |
TGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG | MuIgkVL5′-D | 78 |
ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT | MuIgkVL5′-E | 79 |
ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG | MuIgkVL5′-E | 80 |
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC | MuIgkVL5′-E | 81 |
ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG | MuIgkVL5′-F | 82 |
ATGAKGTHCYCIGXTCAGYTYCTIRG | MuIgkVL5′-F | 83 |
ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG | MuIgkVL5′-F | 84 |
ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT | MuIgkVL5′-f | 85 |
ATGAAGTTGCCTGTTTAGGCTGTTGGTGCT | muigkVL5′-G | 86 |
ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT | MuIgkVL5′-G | 87 |
ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG | MuIgkVL5′-G | 88 |
ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCRARGG | MuIgkVL5′-G | 89 |
ACTGGATGGTGGGAAGATGGA | MuIgkVL3′-I | 90 |
实施例2
产生嵌合抗体
PCR扩增OS2966单克隆抗体的重链和轻链可变结构域序列,并且亚克隆至pANT抗体表达载体中(图14),其中重链和轻链V区分别被克隆至pANT17和pANT13中。通过MluI和HindIII位点将重链V区基因与人χ1重链基因(G1m3(G1m(f))同种异型)或人χ4重链基因框内克隆至pANT17中,并且通过BssHII和BamHI位点将轻链V区基因与人κ轻链恒定区基因(Km3同种异型)框内克隆至pANT13中。重链基因与轻链基因两者的转录受控于CMV I/E启动子(爱荷华大学(University of Iowa)的US5168062和US5385839),并且pANT17质粒含有受控于SV40启动子的突变dhfr小基因(Simonsen和Levinson 1983,PNAS 80:2495-2499)和用于在真核细胞中进行选择的聚腺苷酸序列。pANT17与pANT13两者均含有用于原核选择的β-内酰胺酶(ApR)基因和用于在原核细胞中增殖的pMB1复制起点。所有质粒都在大肠杆菌XL1-blue(Stratagene目录号200130)中增殖。
接着通过基于磷酸钙的转染来将重链和轻链表达构建体短暂共转染至HEK293细胞中,或通过电穿孔来将重链和轻链表达构建体稳定转染至NS0细胞中。通过蛋白质A色谱法自细胞培养上清液纯化分泌的抗体。
实施例3
产生人源化抗体
使用EP1844074(Antitope Ltd)中所述的方法产生人源化抗体。使用Swiss PDB产生小鼠V区的结构模型,并且分析以鉴定来自OS2966 V区的可能对抗体的整联蛋白β1结合性质重要的重要氨基酸(‘约束性残基’)。人V区序列的数据库用于鉴定人V区序列的含有待用于设计人源化抗体的各约束性残基的区段。通常,两个或更多个替代性V区序列区段用于提供各约束性残基,从而产生人源化抗整联蛋白β1V区序列的大范围的可能序列。接着通过如Fothergill等(WO9859244,受让人Eclagen Ltd)中所述的计算机模拟分析来分析这些序列以预测非生殖系MHC II类肽结合,并且也使用包括在万维网上在URL:immuneepitope.org/处可用的“免疫表位数据库和分析资源(The Immune EpitopeDatabase and Analysis Resource)”的数据库分析已知CD4+T细胞表位。丢弃具有预测的非生殖系MHC II类结合肽或相对于T细胞表位数据库具有大量命中物的V区序列。这产生一组减少的V区序列。接着组合V区序列区段的所选组合以产生人源化重链和轻链可变区氨基酸序列。选择五个重链和四个轻链序列(分别指定为VH1至VH5以及Vκ1至Vκ4)(SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22)用于基因合成。此外,设计另一组重链和轻链V区序列(分别指定为VH6至VH15以及Vκ5至Vκ13)(分别是SEQ ID NO:29至38以及44至52)。
除以上所述之外,使用如Winter,Carr,Harris(EP0629240B1)中修改的Winter(US6,548,640B2)的一般性方法设计人源化抗体,借此使用OS2966的CDR序列(SEQ ID NO:23至28)设计序列以替换一组人生殖系V区序列中的CDR,其中添加人J区序列。此外,将如以上段落的人源化抗体中所用的约束性残基引入生殖系V区框架序列中。重链和轻链V区的所得序列分别被指定为VH16至VH20以及Vκ14至Vκ18,并且列为SEQ ID NO:39-43以及53-57。
除以上所述之外,使用Carr等(US7465572B2)的一般性方法设计去免疫的抗体,借此鉴定OS2966的V区序列(SEQ ID NO:2和4)内的CD4+T细胞表位,并且引入突变以潜在移除这些表位中的一个或多个。
合成编码人源化OS2966变异V区的DNA,并且如实施例2中所述将其亚克隆至表达载体pANT17和pANT13中。将人源化VH和Vκ链的所有组合(即VH1至VH5以及Vκ1至Vκ4的组合(即总计20对))短暂转染至HEK293中,并且也转染至NS0细胞中,且如实施例2中所述通过蛋白质A色谱法自培养上清液纯化抗体。
实施例4
分析人源化抗体
在竞争ELISA中相对于来自实施例2的嵌合抗体评估HEK源性OS2966人源化变体和NS0源性OS2966人源化变体与人整联蛋白β1的结合。使用Biotin TagTM微型生物素化试剂盒(Sigma–Aldrich)使OS2966嵌合抗体生物素化。在4℃下用0.5μg/ml人整联蛋白β1(100μl最终体积)将96孔MaxiSorp板(Nunc)涂布过夜。各板用洗涤缓冲液(含0.05%吐温20的杜贝卡氏-PBS(Dulbecco’s-PBS))洗涤,并且用杜贝卡氏PBS-2%BSA在室温下阻断1小时。各板接着用洗涤缓冲液洗涤3次。使测试人源化抗体在各种浓度下与生物素化嵌合抗体(0.02μg/ml最终浓度)预混合,接着添加至人整联蛋白β1涂布的板中(100μl最终体积)。在室温下孵育各板1小时,并且用洗涤缓冲液洗涤3次。添加100μl 1:500稀释的链霉亲和素HRP(Sigma-Aldrich),并且在室温下孵育1小时。各板用洗涤缓冲液洗涤3次,并且添加100μlSigmaFast OPD底物(Sigma-Aldrich,目录号P9187),且在室温下在黑暗中孵育4分钟。通过添加50μl 3M HCl来终止反应。使用Dynex板读取器在490nm下读取各板。
实施例5
产生scFv和Fab
使来自实施例3的人源化OS2966抗人整联蛋白变体转化成scF v,并且使用pCANTAB5E载体RPAS表达模块(Amersham Pharmaci a Biotech,Little Chalfont,UK),如Benhar I.和Reiter Y.,Current Protocols in Immunology,Unit 10.19B,Wiley OnlineLibrary,2002年5月(可在万维网上在URL:currentprotocols.com/protocol/im1019b处获得)中所述将其克隆至M13噬菌体展示载体中。使用提供末端SfiI和NotI限制位点、内部Gly4Ser接头和C末端his6标签的引物扩增人源化VH和VK基因。将scFv构建体以SfiI-NotI片段形式***pCANTAB5E载体中,并且转化至大肠杆菌HB2151中,从而产生排出至周质中以及部分排出至生长培养基中的scFv。使用HIS-Select HF柱筒(Sigma-Aldrich),通过镍-螯合亲和色谱法来自生长培养基纯化scFv。在如实施例4中详述的竞争测定中测试纯化的scFv。也使用用于scFv的方法使来自实施例3的人源化OS2966变体转化成Fab,例外之处是扩增的人源化VH和VK基因与CH1和Cκ恒定区基因一起进一步扩增以形成VH-CH1和VK-Cκ片段,其用引物进一步扩增以使这些片段在VH-CH1基因片段上游与VK-Cκ基因片段下游之间与22氨基酸pelB前导序列(Lei S.P.,Lin H.C.,Wang S.S.,Call away J.和Wilcox G.,JBacteriol.169(1987)p4379-4383)接合,从而产生双顺反子Fab基因。如上对于scFv所述来产生并纯化来自人源化抗体变体的Fab,并且在如实施例4中详述的人整联蛋白β1竞争测定中加以测试。
实施例6
分析CD4+T细胞应答
相较于人源化抗人整联蛋白β1K20(Poul等,Molecular Immunology 32(1995)第102-116页)对来自实施例3和5的人源化抗体的免疫原性潜力进行分析。自英国国家输血服务机构(UK National Blood Transfusion Service)(Addenbrooke’s Hospital,Cambridge,UK)获得的健康社区供体血沉棕黄层(来自在24小时内抽取的血液),并且根据由阿登布鲁克医院地方性研究伦理学委员会(Addenbrooke's Hospital Local ResearchEthics Committee)授予的核准来分离PBMC(外周血液单核细胞)。通过Lymphoprep(Axis-shield,Dundee,UK)密度离心来自血沉棕黄层分离PBMC,并且使用CD8+RosetteSepTM(StemCell Technologies Inc,London,UK)去除CD8+T细胞。通过使用基于HLA SSP-PCR的组织分型试剂盒(Biotest,Solihull,UK)鉴定HLA-DR单倍型来表征供体。也测定对包括回忆抗原破伤风毒素的对照抗原的T细胞应答(KLH(Pierce,Cramlingtom,UK)和源于甲型流感和艾伯斯坦巴尔病毒的肽)。接着冷冻PBMC,并且储存在液氮中直至需要。
为制备单核细胞源性树突细胞(DC),选择50个不同供体PBMC以提供HLA-DR和HLA-DQ同种异型的频率与总体世界人口中的频率类似的分布。在培养基中恢复PBMC,并且使用Miltenyi CD14微珠粒和LS柱(Miltenyi Biotech,Oxford,UK)分离CD14+细胞。将单核细胞再混悬于补充有1000U/ml IL-4和1000U/ml GM-CSF的(“DC”培养基)中以达到4-6×106PBMC/ml,接着分布在24孔板(2ml最终培养体积)中。在第2天通过更换一半体积DC培养基来喂食细胞。截至第3天,单核细胞已分化成半成熟DC,使其与40ug/ml测试人源化或嵌合抗体、100μg/ml KLH或仅培养基一起预孵育。使半成熟DC与抗原一起孵育24小时,此后通过洗涤细胞两次并再混悬于补充有50ng/ml TNF-α(Peprotech,London,UK)的DC培养基中来移除过量测试抗体。在第7天通过更换一半体积DC培养基(补充有50ng/ml TNFα)来喂食DC,随后在第8天收集成熟DC。对收集的成熟DC计数,并且使用台盼蓝拒染法评估活力。接着对DC进行γ照射(4000雷得),并且在每毫升2×105个细胞下再混悬于AIM-V培养基中,随后用于ELISpot和增殖测定中。另外,在第8天,也制备新鲜CD4+T细胞。为纯化CD4+T细胞,在培养基中恢复PBMC,并且使用Miltenyi CD4微珠粒和LS柱(Miltenyi Biotech,Oxford,UK)分离CD4+细胞,且在2×106个细胞/ml下再混悬于培养基中。
在第8天,建立T细胞增殖测定,借此添加1×105个自体CD4+T细胞至96孔U形底板中的1×104个人源化或嵌合抗体负载的DC(10:1比率)中,其中添加培养基以达到最终体积200μl/孔。在第14天,用于25ul AIMV中的1uCi[3H](Perkin Elmer,Beaconsfield,UK)/孔脉冲处理分析板6小时,随后使用TomTec Mach III(Hamden CT,USA)细胞收集器收集于过滤垫(Perkin Elmer)上。所有抗体制剂都在六个一组培养物中加以测试。通过在paralux的1450Microbeta Wallac Trilux液体闪烁计数器(Perkin Elmer)上以低本底计数方式进行MeltilexTM(Perkin Elmer)闪烁计数来测定各孔的每分钟计数(cpm)。相对于仅培养基对照使各抗体样品的每分钟计数标准化。
对于ELISpot测定,ELISpot板(Millipore,Watford,UK)用100ul/孔的含IL-2捕集抗体(R&D Systems,Abingdon,UK)的PBS涂布。接着于PBS中洗涤各板两次,在阻断缓冲液(含1%BSA(Sigma)的PBS)中孵育过夜,并且于AIM培养基中洗涤。在第8天,添加1×105个自体CD4+T细胞至96孔ELISpot板中的1×104个抗原负载的DC(10:1比率)中。所有抗体制剂都在六个一组培养物中加以测试。对于各供体PBMC,也包括阴性对照(单独AIM培养基)、无细胞对照和PHA(10ug/ml)阳性对照。
在另外7天孵育期之后,通过于dH2O和PBS中依序洗涤三次,随后添加100ul含过滤的生物素化检测抗体(R&D Systems,Abingdon,UK)的PBS/1%BSA来使ELISpot板显色。在37℃下孵育1.5小时之后,各板于PBS中再洗涤三次,并且添加100ul含过滤的链霉亲和素-AP(R&D Systems)的PBS/1%BSA,持续1小时(在室温下孵育)。丢弃链霉亲和素-AP,并且于PBS中洗涤各板四次。添加BCIP/NBT(R&D Systems)至各孔中,并且在室温下孵育30分钟。通过用dH2O洗涤各孔以及各孔的背面三次来终止斑点显色。在ImmunoscanTM分析器上扫描干燥板,并且使用ImmunoscanTM4版软件测定每孔的斑点数(spw)。
对于增殖测定与IL-2ELISpot测定两者,结果均被表示为刺激指数(SI),其定义为测试抗体相对于仅培养基对照的cpm(增殖测定)或斑点数(ELISpot测定)比率,对于阳性T细胞应答,使用SI阈值等于或大于2(SI≥2.0)。
实施例7
肿瘤动物模型
肿瘤动物模型可用于体内分析人源化抗整联蛋白β1抗体对肿瘤生长的抑制。举例来说,使用MDA-MB-231细胞的矫正乳癌模型可用作人整联蛋白β1敲入小鼠或免疫缺陷小鼠(例如nu/nu,重度联合免疫缺陷[SCID])中的原发性肿瘤生长和自发性转移的模型。
可用MDA-MB-231细胞以0.1ml体积皮下注射至整联蛋白β1敲入小鼠(7-10周龄,雄性和雌性在各组之间同等分布)的乳腺脂肪垫中。在施用肿瘤细胞之后次日(“第2天”)开始或当肿瘤可触知并且平均肿瘤体积是约100mm3时,本发明的抗整联蛋白β1抗体、OS2966或同种型匹配对照抗体可在1mg/kg-20mg/kg,如5mg/kg或10mg/kg剂量(给药体积10ml/kg)下每周注射。可在实验的过程期间,通过测径规测量每两周进行肿瘤测量。可追踪动物以测定结果。
实施例8
序列分析
对实施例中产生的重链和轻链进行序列分析以确定来自OS2966序列的CDR外部的优选包括在人源化序列中的重要VH和VL氨基酸残基。除CDR的那些残基之外,所述残基也与OS2966的那些残基是同一的。所述残基在图15和16中被识别为“c”残基。如所示,对于VH链,残基48、67、69、73、76、80、89、91和93优选与OS2966的相应残基是同一的(SEQ ID NO:2)。此外,对于VL链,残基36和71优选与OS2966的相应残基是同一的(SEQ ID NO:4)。
对应于VH和VL序列的密码子使用提供于图17中,而图18提供VH和VL链的氨基酸序列的概述。
实施例9
通过抑制整联蛋白β1来增加放射敏感性的方法
本发明的人源化抗体可用于通过抑制整联蛋白β1来增加放射敏感性,如美国专利申请公布号20070237711;Park等,Cancer Res 2008;68:(11)4398;以及Yao等,Cancer Res2007;67:(2)659中所公开,所有公布和文献都整体并入本文。本发明的抗体可用于与导致肿瘤细胞,特别是乳癌肿瘤细胞的细胞凋亡增加的电离辐射组合来共同施用本文所述的抗体或含有抗体的组合物的方法中。
实施例10
验证和分析复合人抗体变体
如实施例3中所讨论来产生复合人源化抗体。表2提供产生的各种抗体的清单,其显示利用哪些VH和Vk序列。
表2.根据V区识别符的变体标号。
人源化变体参考编号 | V区识别符 | 相应VH和VK SEQ ID NO. |
H1 | VH5VK3 | 14,20 |
H2 | VH3VK1 | 10,16 |
H3 | VH4VK4 | 12,22 |
H4 | VH5VK4 | 14,22 |
H5 | VH5VK2 | 14,18 |
H6 | VH5VK1 | 14,16 |
H7 | VH4VK3 | 12,20 |
H8 | VH4VK2 | 12,18 |
H9 | VH4VK1 | 12,16 |
H10 | VH3VK4 | 10,22 |
H11 | VH3VK3 | 10,20 |
H12 | VH3VK2 | 10,18 |
H13 | VH2VK4 | 8,22 |
H14 | VH2VK3 | 8,20 |
H15 | VH2VK2 | 8,18 |
H16 | VH2VK1 | 8,16 |
H17 | VH1VK3 | 6,20 |
H18 | VH1VK2 | 6,18 |
H19 | VH1VK1 | 6,16 |
在与OS2966鼠类嵌合抗体(鼠类OS2966Fab被切成人Fc)的竞争FACS测定中评估复合人抗体变体(来自表2)的结合。简而言之,使自25.0μg/ml起始的一系列稀释度(三倍)的嵌合或人源化抗体与含恒定浓度的鼠类OS2966(0.1875μg/ml)的FACS缓冲液(含1%BSA的1×PBS(pH 7.4))预混合,随后与3×105个Jurkat细胞混合。在冰上孵育1小时之后,洗涤细胞,并且用PE标记的山羊抗鼠类Fc(Jackson ImmunoResearch,目录号115-116-071)检测鼠类OS2966的结合。在冰上孵育45分钟之后,洗涤细胞,将其再混悬于300μl FACS缓冲液中,并且在Beckton Dickinson FACScaliburTM上分析。相对于抗体浓度绘制几何平均荧光强度(图20-24)。这些数据用于计算各抗体的IC50值,并且相对于包括在各FACS测定中的嵌合抗体的IC50使这些值标准化(表3)。
表3.人变体相对亲和力。通过用测试抗体的IC50除以在相同测定中测定的嵌合抗体的IC50来计算相对IC50。
变体 | 相对亲和力(IC50) |
H1 | 0.88 |
H2 | 0.97 |
H3 | 2.70 |
H4 | 3.26 |
H5 | 0.85 |
H6 | 1.24 |
H7 | 1.76 |
H8 | 1.18 |
H9 | 1.34 |
H10 | 2.76 |
H11 | 1.58 |
H12 | 1.15 |
H13 | 2.00 |
H14 | 1.17 |
H15 | 1.32 |
H16 | 1.08 |
H17 | 1.35 |
H18 | 1.20 |
H19 | 1.13 |
三个变体(H1、H2、H5)显示比鼠类OS2966抗体略微更大的相对亲和力,并且四个变体(H3、H4、H10、H13)具有比鼠类OS2966抗体显著更低的相对亲和力。
在粘着微板测定中在多种ECM上以及在多种癌细胞系PANC-1人胰腺癌(图25A和25B)、MDA-MB-231人三阴性乳癌(图25C)和AsPC-1人胰腺癌(图25D)中,评估人变异抗体对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。简而言之,用10μg/ml ECM组分或BSA(对照)进行ECM粘着测定。使细胞与10μg/ml抗体一起在无血清DMEM/F12培养基中预孵育30分钟。测试粘着,持续30分钟至1小时。自各盘移除非粘着细胞,用1%多聚甲醛固定细胞,并且用结晶紫染色各板30分钟。在彻底冲洗之后,使结晶紫溶解在曲通X-100(Triton X-100)中1小时,并且在A590下读取各板的吸光度。
所有19个人变体在减弱细胞粘着于所有ECM方面都具有功能活性,其中视ECM蛋白和细胞系而定具有一些显著变化。无论ECM类型或细胞系如何,在这个测定中,相对亲和力(表3)都未显示与功能的明显关联。相对于IgG阴性对照(BSA牛血清白蛋白作为阴性对照;IgG,同种型对照;OS2966,鼠类OS2966;TS2/16,阳性对照整联蛋白β1活化抗体;FN,纤维结合蛋白;LN,层粘连蛋白(laminin);C1,I型胶原蛋白;C4,IV型胶原蛋白)使这些数据标准化。
在微板“刮擦创伤”迁移测定中在ECM组分纤维结合蛋白上,使用人三阴性乳癌细胞(MDA-MB-231),评估人变异抗体对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。简而言之,各板用10μg/ml纤维结合蛋白涂布,并且用肿瘤细胞接种。黄色吸移管尖端用于刮擦单层汇合细胞,并且替换包括10μg/ml所述抗体的培养基。在37C下孵育8小时之后固定各板,并且成像。各板的10×放大图像显示在OS2966和复合人变体(H1、H2、H3)处理的孔中,向创伤中的迁移得以减弱(图26A)。在各条件下对无细胞区域的定量(一式三份并且重复进行)显示于图26B中。
通过用OS2966复合人变体处理,三阴性乳癌细胞的迁移得以显著减弱。
在血管生成的体外模型(即用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行的血管形成测定)中评估人变异抗体对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。简而言之,各板用基质胶ECM涂布,并且用HUVEC细胞接种。在37C下孵育8小时之后使各板成像,并且对血管形成(闭合单元形成)定量。各板的10×放大图像显示在OS2966和复合人变体(H1、H2、H3)处理的孔中,血管形成得以减弱(图27A)。在各条件下对闭合单元形成的定量(用内皮祖细胞至少一式三份并且重复进行)显示于图27B中。
在体外血管形成测定中,复合人变体完全阻断血管生成。
在人三阴性乳癌的体内模型中使用MDA-MB-231细胞系,评估人变异抗体对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。简而言之,将106个细胞注射至5至6周龄雌性无胸腺nu/nu裸小鼠中的第4乳腺脂肪垫中。在产生肿瘤(平均皮下体积=80-100mm3)之后,将小鼠随机分入治疗组中。每周两次在5mg/kg下经腹膜內(IP)施用对照和实验抗体。在相等剂量下的人IgG充当对照(Sigma)。每周两次用测径规测量原位肿瘤。如图28A中所示,相较于IgG对照,人变体H1-H3在体内显著减弱MDA-MB-231肿瘤的生长。相较于鼠类OS2966,复合人变体具有优越功效的趋势是明显的,特别是对于H3而言。药力学蛋白质印迹分析显示相较于可已促进增殖降低和细胞凋亡升高的对照,处理的肿瘤中的关键促生长信号传导路径中的活性(磷酸化细胞外相关激酶、ERK和磷酸化粘着斑激酶FAK)得以降低(图28B)。
在人三阴性乳癌的自发性肺转移的体内模型中使用MDA-MB-231细胞系,评估人变异抗体对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。简而言之,将106个细胞注射至5至6周龄雌性无胸腺nu/nu裸小鼠中的第4乳腺脂肪垫中。在产生肿瘤(平均皮下体积=80-100mm3)之后,将小鼠随机分入治疗组中。每周两次在5mg/kg下经腹膜內(IP)施用对照和实验抗体。在相等剂量下的人IgG充当对照(Sigma)。在7周之后,灌注小鼠,收集肺,并且冠向切片以供H&E分析。在50%(6分之3)的给与IgG对照抗体的小鼠中观察到自发性肺转移。在给与OS2966或复合人变体H1-H3的任何小鼠中都未观察到自发性肺转移(0%,0/28小鼠)。结果显示于图29中。
在三阴性乳癌的原位模型中,复合人变体完全防止自发性肺转移。
在人吉西他滨抗性胰腺癌的体内模型中使用PANC1-GEMR细胞系,评估人变异抗体对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。简而言之,将106个细胞皮下注射至5至6周龄雄性无胸腺nu/nu裸小鼠中。在产生肿瘤(平均皮下体积=80-100mm3)之后,将小鼠随机分入治疗组中。每周两次在5mg/kg下经腹膜內(IP)施用对照和实验抗体,或在50mg/kg下施用吉西他滨。在相等剂量下的人IgG充当对照(Sigma)。每周两次用测径规测量皮下肿瘤。图30A显示PANC1-GEMR株系中的吉西他滨抗性的体内验证。图30B显示相较于IgG对照,复合人变体H3在体内显著减弱PANC1-GEMR肿瘤的生长。图30C显示相较于可已促进增殖降低和细胞凋亡升高的对照,处理的肿瘤中的关键促生长信号传导路径(磷酸化细胞外相关激酶、ERK和磷酸化粘着斑激酶FAK)的药力学蛋白质印迹分析。
在产生的人成胶质细胞瘤的体内模型中使用U87MG细胞系,评估人变异抗体对整联蛋白β1亚单位的功能性抑制。简而言之,将107个细胞皮下注射至5至6周龄雄性无胸腺nu/nu裸小鼠中。在充分产生肿瘤(平均皮下体积=~200-250mm3)之后,将小鼠随机分入治疗组中。每周两次在5mg/kg下经腹膜內(IP)施用对照和实验抗体。在相等剂量下的人IgG充当对照(Sigma)。每周两次用测径规测量皮下肿瘤。图31A显示相较于IgG对照,复合人变体H3在体内显著减弱产生的成胶质细胞瘤肿瘤的生长。H3的功效等效于鼠类OS2966。药力学蛋白质印迹分析显示相较于可已促进增殖降低和细胞凋亡升高的对照,H3处理的肿瘤中的关键促生长信号传导路径中的活性(磷酸化细胞外相关激酶、ERK和磷酸化AkT)得以降低,如图31B中所示。
EpiScreenTM时程T细胞增殖测定用于测定抗体变体H3的临床免疫原性的潜力。测试完全人源化和嵌合抗体诱导CD4+T细胞应答的能力,如通过相对于一组12个HLA分型供体的增殖所度量。对嵌合(鼠类/人)OS2966抗体、人源化H3抗体和阳性对照人源化抗体的健康供体T细胞增殖应答显示于图32A中。使CD4+T细胞与用样品负载的自体成熟DC一起孵育,并且在孵育7天之后评估增殖。使用不成对双样品学生t检验(student’s t test),SI≥2.00(由红色点线指示)的显著(p<0.05)增殖应答被视为阳性。图32B提供供体组的健康供体T细胞增殖应答的概述。显示阳性(SI≥2.00,显著,p<0.05)T细胞增殖应答(“P”)。显示边界应答(显著,p<0.05,SI≥1.90)(*)。增殖测定阳性应答的频率在各列的底部显示为百分比。A33(人源化A33)是临床基准对照mAb,其在临床中显示高免疫原性水平,并且通常在EpiScreen测定中诱导20-30%T细胞应答。对于各供体,也包括免疫原性可重现性对照(细胞与100μg/ml KLH一起孵育)。
复合人变体H3显示相较于OS2966鼠类/人嵌合体(25%应答),免疫原性显著降低(0%应答)。根据提供对由于Antitope复合人抗体技术所致的免疫原性降低的确认的EpiScreenTM测定,推断人抗体H3展现临床上可接受的免疫原性分布。
尽管本发明已关于以上实施例加以描述,但应了解修改和变化涵盖在本发明的精神和范围内。因此,本发明仅由以下权利要求限制。
Claims (53)
1.一种特异性结合整联蛋白β1的人源化抗体,其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区,其中所述VH区与具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VH区具有小于约97%、96%或95%同一性,其中所述VL区与具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的VL区具有小于约97%、96%或95%同一性,其中所述VH区的互补决定区(CDR)具有如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列,并且其中所述VL区的所述CDR具有如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体,其中所述VH区与具有所述如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的所述VH区具有小于90%、85%、80%或75%同一性。
3.如权利要求1所述的抗体,其中所述VL区与具有所述如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的所述VL区具有小于90%、85%、80%或75%同一性。
4.如权利要求1所述的抗体,其中所述VH区与具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH区具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29-43、SEQ ID NO:91-99和SEQID NO:100。
5.如权利要求1所述的抗体,其中所述VL区与具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL区具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:44-57、SEQ ID NO:107-115和SEQ ID NO:116。
6.如权利要求1所述的抗体,其中所述VH区框架与具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH区框架具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性:SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29-43、SEQ ID NO:91-99和SEQ ID NO:100,其中所述VH区的互补决定区(CDR)具有如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的抗体,其中所述VL区框架与具有选自由SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:44-57、SEQ ID NO:107-115和SEQ ID NO:116组成的组的氨基酸序列的VL区框架具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性,其中所述VL区的CDR具有如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的抗体,其中所述VH区具有选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29-43、SEQ ID NO:91-99和SEQ IDNO:100组成的组的氨基酸序列,并且所述VL区具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:44-57和SEQ ID NO:107-116。
9.如权利要求1所述的抗体,其中所述VH区和所述VL区的CDR来自供体抗体。
10.如权利要求9所述的抗体,其中所述供体是OS2966。
11.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体包含Fc区。
12.如权利要求11所述的抗体,其中所述Fc区是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
13.如权利要求12所述的抗体,其中所述Fc区是人IgG1或IgG4。
14.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体包含轻链恒定区。
15.如权利要求14所述的抗体,其中所述轻链恒定区具有同种型κ。
16.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是scFv或Fab。
17.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是人源化抗体。
18.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是嵌合抗体。
19.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
20.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体与OS2966竞争与整联蛋白β1的特异性结合。
21.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体以至少10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10- 7M、10-8M、10-9M或10-10M的平衡解离常数(Kd)结合整联蛋白β1。
22.如权利要求1至21中任一项所述的抗体,其在体外测试来自人群体的具有HLA-DR同种异型分布的血液样品中的CD4+辅助T细胞应答的诱导时产生小于10%的T细胞应答。
23.如权利要求22所述的抗体,其在测试时产生小于5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%的T细胞应答。
24.一种多特异性抗体,其包括一种或多种权利要求1至22的抗体。
25.一种核酸分子,其编码权利要求1至23中任一项所述的抗体。
26.一种载体,其包含权利要求25所述的核酸分子。
27.如权利要求26所述的载体,其中所述载体是表达载体。
28.一种分离的宿主细胞,其包含权利要求26或27所述的载体。
29.如权利要求28所述的宿主细胞,其中所述细胞是原核的或真核的。
30.如权利要求28所述的宿主细胞,其中所述细胞是哺乳动物的。
31.一种药物组合物,其包含权利要求1至23中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
32.一种药物组合物,其包含权利要求25所述的核酸分子以及药学上可接受的载体。
33.一种免疫缀合物,其包含连接于可检测或治疗部分的权利要求1至23中任一项所述的抗体。
34.如权利要求33所述的免疫缀合物,其中所述治疗部分是细胞毒性部分。
35.如权利要求33所述的免疫缀合物,其中所述治疗部分是化学治疗剂。
36.如权利要求33所述的免疫缀合物,其中所述可检测部分是荧光部分。
37.权利要求1至23中任一项所述的抗体、权利要求25所述的核酸分子、权利要求31至32中任一项所述的药物组合物或权利要求33至36中任一项所述的免疫缀合物在制备用于治疗受试者的疾病的药物中的应用。
38.如权利要求37所述的应用,其中所述疾病是细胞增生性病症。
39.如权利要求38所述的应用,其中所述细胞增生性病症是癌症。
40.如权利要求39所述的应用,其中所述癌症是疗法抗性、难治性或转移性的。
41.如权利要求38所述的应用,其中所述细胞增生性病症是良性或恶性肿瘤。
42.如权利要求41所述的应用,其中所述细胞增生性病症是I型或II型神经纤维瘤病。
43.如权利要求37所述的应用,其中所述疾病是炎性疾病。
44.如权利要求39所述的应用,其进一步包括共同施用化学治疗剂。
45.权利要求1至23中任一项所述的抗体在制备用于检测受试者的疾病的剂中的应用,其中所述检测包括:
a)使权利要求1至23中任一项所述的抗体与来自所述受试者的样品接触;
b)通过所述抗体与整联蛋白β1的特异性结合来检测整联蛋白β1的水平;以及
c)比较整联蛋白β1的所述检测水平与正常样品中的整联蛋白β1的水平,其中相较于所述正常样品,来自所述受试者的所述样品中的整联蛋白β1的水平增加指示疾病。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述疾病是细胞增生性病症。
47.如权利要求46所述的方法,其中所述细胞增生性病症是癌症。
48.一种VH区,其与具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH区具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29-43、SEQ ID NO:91-99和SEQ ID NO:100,并且其中所述VH区的互补决定区(CDR)具有如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
49.如权利要求48所述的VH区,其中所述VH区具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29-43、SEQ ID NO:91-99和SEQ ID NO:100。
50.一种核酸分子,其编码权利要求48和49中任一项所述的VH区。
51.一种VL区,其与具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL区具有超过75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:44-57、SEQ ID NO:107-115和SEQ ID NO:116,并且其中所述VL区的所述CDR具有如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
52.如权利要求47所述的VL区,其中所述VL区具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:44-57、SEQ IDNO:107-115和SEQ ID NO:116。
53.一种核酸分子,其编码权利要求51和52中任一项所述的VL区。
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