BR112015015465B1 - Anticorpo humanizado anti-integrina beta1, região de vh, região de vl, molécula de ácido nucleico, imunoconjugado, uso dos anteriores, vetor, célula hospedeira procariótica, composição farmacêutica, e método in vitro para detectar uma doença de proliferação celular ou doença inflamatória - Google Patents

Abstract

ANTICORPO HUMANIZADO ANTI- INTEGRINA BETA1, REGIÃO DE VH, REGIÃO DE VL, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, IMUNOCONJUGADO, USO DOS ANTERIORES, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E MÉTODO PARA DETECTAR UMA DOENÇA. A presente invenção refere-se a regiões de estrutura de cadeia variável humana e anticorpo humanizado compreendendo as regiões de estrutura, os anticorpos sendo específicos para integrina (Beta)1. A invenção também refere-se a métodos para utilização dos anticorpos, por exemplo, para tratar doenças, tal como câncer.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO(S) RELACIONADO(S)

[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119(e) ao Pedido dos Estados Unidos N° de Série 61/746.023, depositado em 26 de dezembro de 2012. A descrição do pedido anterior é considerada parte de, e é incorporada por referência em sua totalidade na descrição deste pedido.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O material na Listagem de Sequências acompanhante é, desse modo, incorporado por referência neste pedido. O arquivo de texto da listagem de sequências acompanhante, nome Listagem de Sequências ONCO1100_1WO, foi criado em 23 de dezembro de 2013, e é de 81 KB. O arquivo pode ser avaliado usando Microsoft Word em um computador que usa Windows OS.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção se relaciona geralmente ao campo de imunologia, e, mais especificamente, a anticorpos de anti-integrina, e métodos de uso destes.

INFORMAÇÃO ANTECEDENTE

[004] O câncer é uma das causas condutoras de morte no mundo desenvolvido, resultando em mais do que 500.000 mortes por ano nos Estados Unidos sozinho. Mais de um milhão de pessoas são diagnosticadas com câncer nos Estados Unidos a cada ano, e, no todo, é estimado que mais do que 1 em 3 pessoas desenvolverá alguma forma de câncer durante seu tempo de vida. Embora existam mais do que 200 tipos diferentes de câncer, quatro deles, incluindo mama, pulmão, colorretal, e próstata, representam mais da metade de todos os novos casos.

[005] O câncer de mama é o câncer mais comum em mulheres, com uma estimativa de 12% de mulheres em risco de desenvolverem a doença durante sua vida. Embora as taxas de mortalidade tenham diminuído devido à detecção precoce e tratamentos aperfeiçoados, o câncer de mama permanece uma causa condutora de morte em mulheres de média idade. Além disso, o câncer de mama metastático é ainda uma doença incurável. Mediante apresentação, muitos pacientes com câncer de mama metastático têm somente um ou dois sistemas de órgão afetados, mas a medida que a doença progride, múltiplos locais usualmente tornam-se envolvidos. Os locais mais comuns de envolvimento metastático são recorrências locorregionais na pele e tecidos moles da parede torácica, bem como nas áreas da axila e supraclavicular. O local mais comum para metástase à distância é o osso (30 - 40% de metástase à distância), seguido pelos pulmões e fígado. Embora somente aproximadamente 1-5% de mulheres com câncer de mama recentemente diagnosticado tenham metástase à distância no momento do diagnóstico, aproximadamente 50% dos pacientes com doença local eventualmente recaem com metástase dentro de cinco anos. No presente, a sobrevivência média a partir da manifestação de metástase à distância é cerca de três anos.

[006] Os métodos atuais de diagnose e estágio de câncer de mama incluem o sistema de metástase de tumor-nódulo (TNM) que depende do tamanho do tumor, presença do tumor em nódulos linfáticos, e a presença de metástase à distância, conforme descrito no American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual. Philadelphia, Pa.: Lippincott-Raven Publishers, 5th ed., 1997, pp 171180, e em Harris, J R: "Staging of breast carcinoma" in Harris, J. R., Hellman, S., Henderson, I. C, Kinne D. W. (eds.): Breast Diseases. Philadelphia, Lippincott, 1991. Estes parâmetros são usados para proporcionar uma prognose, e selecionar uma terapia apropriada. A aparência morfológica do tumor pode também ser avaliada, mas porque tumores com aparência histopatológica similares podem exibir variabilidade clínica significante, esta abordagem tendo sérias limitações. Finalmente, ensaios para marcadores de superfície de célula podem ser usados para dividir certos tipos de tumores em subclasses. Por exemplo, um fator considerado na prognose e tratamento de câncer de mama é a presença do receptor de estrógeno (ER) como cânceres de mama de ER positivo que tipicamente respondem mais prontamente a terapias hormonais, tais como inibidores de tamoxifeno ou aromatase do que tumores de ER negativo. Ainda estas análises, embora úteis, são somente parcialmente preditivas do comportamento clínico de tumores de mama, e existe muita diversidade fenotípica presente em cânceres de mama que ferramentas diagnósticas atuais falham em detectar e terapias atuais falham em tratar.

[007] O câncer de próstata é o câncer mais comum nos homens no mundo desenvolvido, representando uma estimativa de 33% de todos os novos casos nos Estados Unidos, e é a segunda causa mais frequente de morte. Desde a introdução do teste de sangue de antígeno específico de próstata (PSA), a detecção precoce de câncer de próstata tem aperfeiçoado dramaticamente as taxas de sobrevivência, e a taxa de sobrevivência de cinco anos para pacientes com cânceres de próstata de estágio local e regional no momento da diagnose é próxima de 100%. Ainda, mais do que 50% de pacientes eventualmente desenvolverão doença localmente avançada ou metastática.

[008] Atualmente, a prostatectomia radical e terapia de radiação proporcionam tratamento curativo para a maioria de tumores de próstata localizados. Contudo, as opções terapêuticas são muito limitadas para casos avançados. Para doença metastática, ablação andrógena com agonista de hormônio de liberação de hormônio de luteinização (LHRH) sozinho, ou em combinação com antiandrógenos, é o tratamento padrão. Ainda apesar do bloqueio de andrógeno máximo, a doença quase sempre progride com a maioria desenvolvendo doença independente de andrógeno. No presente, não existe tratamento uniformemente aceito para câncer de próstata refratário de hormônio, e regimes quimioterapêuticos são comumente usados.

[009] O câncer de pulmão é o câncer mais comum ao redor do mundo, o terceiro câncer mais comumente diagnosticado nos Estados Unidos, e, de longe, a causa mais frequente de mortes. O tabagismo é acreditado ser responsável por uma estimativa de 87% de todos os cânceres de pulmão, tornando-a a doença mais mortalmente evitável. O câncer de pulmão é dividido em dois maiores tipos que respondem por mais de 90% de todos os cânceres de pulmão: câncer de pulmão de célula pequena (SCLC), e câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC). O SCLC responde por 15-20% dos casos, e é caracterizado por sua origem em grandes vias aéreas centrais e composição histológica de folhas de células pequenas com pouco citoplasma. O SCLC é mais agressivo do que o NSCLC, crescendo rapidamente e metastizando precocemente e frequentemente. O NSCLC responde por 80-85% de todos os casos, e é adicionalmente dividido em três maiores subtipos baseados em histologia: adenocarcinoma, carcinoma de célula escamosa (carcinoma epidermoide), e carcinoma não diferenciado de célula grande.

[0010] O câncer de pulmão tipicamente apresenta atraso em seu curso, e, desse modo, tem uma sobrevivência média de somente 6-12 meses após diagnose, e uma taxa de sobrevivência total de 5 anos de somente 5-10%. Embora a cirurgia ofereça a melhor chance de uma cura, somente uma pequena fração de pacientes com câncer de pulmão é eligível, com a maioria dependendo de quimioterapia e radioterapia. Apesar de tentativas de manipular a regulação e intensidade de dose destas terapias, as taxas de sobrevivência têm aumentado pouco sobre os últimos 15 anos.

[0011] O câncer colorretal é o terceiro câncer mais comum, e a quarta causa mais frequente de mortes de câncer ao redor do mundo. Aproximadamente 5-10% de todos os cânceres colorretais são hereditários, com uma das formas principais sendo polipose adenomatosa familiar (FAP), uma doença dominante autossomal em que cerca de 80% dos indivíduos afetados contêm uma mutação de linha germinativa no gene coli de polipose adenomatoso (APC). O carcinoma coloretal tem uma tendência a invadir localmente por crescimento circunferencial, e em outro lugar, por difusão linfática, hematogenosa, transperitoneal, e perineural. O local mais comum de envolvimento extralinfático é o fígado, com os pulmões o órgão extraabdominal mais frequentemente afetado. Outros locais de difusão hematogenosa incluem os ossos, rins, glândulas adrenais, e cérebro.

[0012] O sistema de estágio atual para câncer colorretal é baseado no grau de penetração de tumor através da parede do intestino, e na presença ou ausência de envolvimento nodal. Este sistema de estágio é definido pelas três maiores classificações de Duke: A doença A de Duke é confinada a camadas de submucosa de cólon ou reto; a doença B de Duke tem tumores que invadem através da muscularis própria, e podem penetrar a parede do cólon ou reto; e a doença C de Duke inclui qualquer grau de invasão da parede do intestino com metástase de nódulo linfático regional. Enquanto que ressecção cirúrgica é altamente efetiva para cânceres colorretais de estágio precoce, proporcionando taxas de cura de 95% em pacientes A de Duke, a taxa é reduzida a 75% em pacientes B de Duke, e a presença de nódulo linfático positivo em doença C de Duke prevê uma probabilidade de 60% de recorrência dentro de cinco anos. O tratamento de pacientes C de Duke com um curso pós-cirúrgico de quimioterapia reduz a taxa de recorrência a 40%- 50%, e é agora o padrão de cuidado para estes pacientes.

[0013] Os carcinomas epiteliais da cabeça e pescoço ocorrem a partir das superfícies de mucosa na área da cabeça e pescoço, e são tipicamente células escamosas na origem. Esta categoria inclui tumores dos seios paranasais, da cavidade oral, e da nasofaringe, orofaringe, hipofaringe, e laringe.

[0014] O número anual de novos casos de cânceres de cabeça e pescoço nos Estados Unidos é aproximadamente 40.000 por ano, respondendo por cerca de 5 por cento de malignidades de adulto. Os cânceres de cabeça e pescoço são mais comuns em alguns outros países, e a incidência ao redor do mundo provavelmente excede meio milhão de casos anualmente. Na América do Norte e Europa, os tumores usualmente ocorrem a partir da cavidade oral, orofaringe, ou laringe, pelo que o câncer nasofaringeal é mais comum nos países do Mediterrâneo e no Extremo Oriente.

[0015] Os modos tradicionais de terapia (terapia de radiação, quimioterapia, e terapia hormonal), enquanto úteis, têm sido limitados pela emergência de células de câncer resistentes ao tratamento. Claramente, novas abordagens são necessárias para identificar alvos para tratamento de câncer de cabeça e pescoço e câncer geralmente.

[0016] O câncer pancreático é um neoplasma maligno que se origina de células transformadas que ocorrem em tecidos que formam o pâncreas. O tipo mais comum de câncer pancreático, que responde por 95% destes tumores, é adenocarcinoma (tumores que exibem arquitetura glandular na microscopia de luz) que ocorre dentro do componente exócrino do pâncreas. Uma minoria ocorre de células de ilhotas, e são classificadas como tumores neuroendócrinos. O câncer pancreático é a quarta causa mais comum de mortes relacionadas a câncer nos Estados Unidos, e a oitava ao redor do mundo.

[0017] Glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor de cérebro maligno mais comum em adultos com uma sobrevivência média de menos do que um ano com terapia máxima. Até aqui, somente três drogas foram aprovadas pelo FDA para tratamento de GBM, e a sobrevivência total não se aperfeiçoou em mais de 25 anos.

[0018] As integrinas são moléculas de adesão de célula que são responsáveis por mecanodetecção do microambiente, e induzindo sinalização induzida por matriz extracelular (ECM) em ambos estados normal e patológico, tais como inflamação e câncer. Importantemente, as integrinas ocorrem na interface da célula e microambiente, desempenhando um papel na progressão do tumor e regulação de trajetórias de crescimento e sobrevivência. A suprarregulação de muitos tipos de integrinas foi associada com malignidades epiteliais, particularmente durante os processos de invasão, metástase, e angiogênese. Importantemente, as β1 integrinas, que coordenam muitas atividades funcionais mais amplas, tais como inflamação, proliferação, adesão, e invasão, foram recentemente implicadas em resistência terapêutica em modelos de câncer sólido múltiplo e malignidades hematopoiéticas. Importantemente, esta resistência mediada por β1 integrina é para ocorrer no nível das próprias células de tumor. Em adição ao acima, a β1 integrina tem funções importantes durante a vascularização do tumor, tal como angiogênese dependente de VEGF e independente de VEGF por promoção de migração de células endoteliais vasculares. A inibição de β1 integrina supera a resistência a terapia de antiangiogênese, via mecanismos potenciais múltiplos: (1) prevenção de cooptação de vaso (e/ou crescimento/invasão após qualquer substrato de ECM clássico; (2) redução da viabilidade de células de tumor após insultos, tal como radiação de ionização; (3) inibição diretamente de proliferação de célula de tumor; (4) inibição diretamente do processo de vascularização; e (5) inibição do fenótipo mesenquimal agressivo, incluindo crescimento esferoidal, tipicamente visto após o estabelecimento de resistência à terapia.

[0019] As composições de anti-integrina β1, tais como anticorpos direcionados a integrina β1, podem também serem importantes em doenças imunológicas/doenças inflamatórias e distúrbios dão o papel da integrina β1 em atividades funcionais mais amplas conforme discutido acima. Adicionalmente, as doenças e distúrbios que podem ser direcionados através da trajetória de integrina β1 incluem esclerose múltipla, doença de Crohn, artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, e similares. Similarmente, é para ser esperado que certas doenças relacionadas ao olho possam ser direcionadas incluindo degeneração macular relacionada à idade (AMD) úmida.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0020] A presente invenção é baseada na geração de anticorpo humanizado tendo sequências de estrutura humana que especificamente ligam integrina β1. A integrina β1 é conhecida por ser uma proteína sobre-expressa em tumores sólidos, e, desse modo, como um marcador de célula de câncer útil na caracterização, estudo, diagnose, e tratamento de câncer. Em adição, a integrina β1 demonstrou acionar resistência ao câncer a terapias convencionais (por exemplo, quimioterapia e radiação de ionização) e terapias direcionadas (por exemplo, trastuzumab, bevicizumab, lapatinib) por crescimento de orquestração e sinais de sobrevivência a partir do microambiente do tumor. Os esforços de humanização foram limitados no passado pelo número de estruturas humanas disponíveis. Esta invenção encontra a necessidade de sequências de estrutura humana adicional para um anticorpo especificamente ligar a Integrina β1.

[0021] Em uma concretização, a presente invenção proporciona um anticorpo humanizado que liga especificamente integrina β1. O anticorpo inclui uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), no qual a região de VH tem menos do que cerca de 97%, 96% ou 95% de identidade para uma região de VH tendo uma sequência de aminoácido conforme colocada em SEQ ID NO:2, e no qual a região de VL tem menos do que cerca de 97%, 96% ou 95% de identidade para uma região de VL tendo uma sequência de aminoácido conforme colocada em SEQ ID NO:4.

[0022] Em outra concretização, a região de VH tem mais do que 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade para uma região de VH tendo uma sequência de aminoácido conforme colocada em SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NOs:29-43 e SEQ ID NOs:91-100. Em concretizações, a região de VL tem mais do que 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade para uma região de VL tendo uma sequência de aminoácido conforme colocada em SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NOs:44-57 e SEQ ID NOs:107-116.

[0023] Em outra concretização, o anticorpo tem CDRs das regiões de VH e VL de um anticorpo doador, tal como OS2966. Em concretizações, as CDRs da região de VH têm sequências de aminoácido conforme colocada em SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, e as CDRs da região de VL têm sequências de aminoácido conforme colocada em SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:28.

[0024] Em um aspecto, a invenção proporciona um anticorpo que inclui regiões de VH e VL da presente invenção.

[0025] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo da presente invenção.

[0026] Em outro aspecto, a invenção proporciona um vetor que inclui uma molécula de ácido nucleico da presente invenção.

[0027] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma célula hospedeira isolada que inclui o vetor da presente invenção.

[0028] Em outro aspecto, a invenção proporciona composições farmacêuticas. Em uma concretização, a composição farmacêutica inclui o anticorpo da presente invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma concretização, a composição farmacêutica inclui a molécula de ácido nucleico da presente invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0029] Em outro aspecto, a invenção proporciona um imunoconjugado incluindo o anticorpo da presente invenção ligado a detecção ou fração terapêutica.

[0030] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma proteína quimérica incluindo o anticorpo da presente invenção operavelmente ligado a um peptídeo separado, tal como citocina.

[0031] Em outra concretização, a invenção proporciona um método de tratamento de uma doença em um indivíduo. Em concretizações, o método inclui administrar ao indivíduo o anticorpo da presente invenção, a molécula de ácido nucleico da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção, o imunoconjugado da presente invenção, ou a proteína quimérica da presente invenção, tratando, desse modo, a doença. Em uma concretização, a doença é um distúrbio proliferativo de célula, tal como câncer.

[0032] Em outra concretização, a invenção proporciona um método de detecção de uma doença em um indivíduo. O método inclui contatar o anticorpo ou imunoconjugado da presente invenção com uma amostra a partir do indivíduo; detectar o nível de integrina β1, via ligação específica com integrina β1; e comparar o nível detectado de integrina β1 àquele de integrina β1 em uma amostra normal, no qual um nível aumentado de integrina β1 na amostra a partir do indivíduo conforme comparado à amostra normal, é indicativo de uma doença.

[0033] Em outra concretização, a invenção proporciona uma região de VH tendo mais do que 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade para uma região de VH tendo uma sequência de aminoácido conforme colocada em SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NOs:29-43 e SEQ ID NOs:91- 100.

[0034] Em outra concretização, a invenção proporciona uma região de VL tendo mais do que 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade para uma região de VL tendo uma sequência de aminoácido conforme colocada em SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NOs:44-57 e SEQ ID NOs:107-116.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] A Figura 1 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VH de anticorpo OS2966 produzida pelo hibridoma OS2966.

[0036] A Figura 2 é a representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VL de anticorpo OS2966 produzida pelo hibridoma OS2966.

[0037] A Figura 3 é uma representação pictórica representando análise de CDRs de anticorpo OS2966 produzidas por hibridoma OS2966 que são utilizadas nas regiões de VH e VL do anticorpo da presente invenção.

[0038] A Figura 4 é uma representação pictórica representando as sequências de aminoácido de CDRs de anticorpo OS2966 produzidas por hibridoma que são utilizadas nas regiões de VH e VL do anticorpo da presente invenção.

[0039] A Figura 5 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VH do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0040] A Figura 6 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VH do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0041] A Figura 7 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VH do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0042] A Figura 8 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VH do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0043] A Figura 9 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VH do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0044] A Figura 10 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VL do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0045] A Figura 11 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VL do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0046] A Figura 12 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VL do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0047] A Figura 13 é uma representação pictórica representando sequências de ácido nucleico e de aminoácido da região de VL do anticorpo da presente invenção em uma concretização. As CDRs conservadas são sublinhadas.

[0048] A Figura 14 é um diagrama esquemático de vetores.

[0049] A Figura 15 é uma representação pictórica representando análise de sequência e alinhamento de cadeias de VH humanizadas da invenção com comparação a VH de anticorpo OS2966 (SEQ ID NO:2). As sequências da Figura 15 são conforme segue: OS2966 é SEQ ID NO:2; Variante 1 é SEQ ID NO:6; Variante 2 é SEQ ID NO:8; Variante 3 é SEQ ID NO:10; Variante 4 é SEQ ID NO:12; Variante 5 é SEQ ID NO:14; Variante 6 é SEQ ID NO:29; Variante 7 é SEQ ID NO:30; Variante 8 é SEQ ID NO:31; Variante 9 é SEQ ID NO:32; Variante 10 é SEQ ID NO:33; Variante 11 é SEQ ID NO:34; Variante 12 é SEQ ID NO:35; Variante 13 é SEQ ID NO:36; Variante 14 é SEQ ID NO:37; Variante 15 é SEQ ID NO:38; VH2 é SEQ ID NO:91; Variante 16 é SEQ ID NO:92; VH4 é SEQ ID NO:93; Variante 17 é SEQ ID NO:94; VH5 é SEQ ID NO:95; Variante 18 é SEQ ID NO:96; VH6 é SEQ ID NO:97; Variante 19 é SEQ ID NO:98; VH7 é SEQ ID NO:99; e Variante 20 é SEQ ID NO:100.

[0050] A Figura 16 é uma representação pictórica representando análise de sequência e alinhamento de regiões J humanizadas (VH) da invenção correspondente aos alinhamentos mostrados na Figura 15. As sequências são conforme segue: J1 é SEQ ID NO:101; J2 é SEQ ID NO:102; J3 é SEQ ID NO:103; J4 é SEQ ID NO:104; J5 é SEQ ID NO:105; e J6 é SEQ ID NO:106.

[0051] A Figura 17 é uma representação pictórica representando análise de sequência e alinhamento de cadeias de VL humanizadas da invenção com comparação a VL de anticorpo OS2966 (SEQ ID NO:4). As sequências são conforme segue: OS2966 é SEQ ID NO:4; Variante 1 é SEQ ID NO:16; Variante 2 é SEQ ID NO:18; Variante 3 é SEQ ID NO:20; Variante 4 é SEQ ID NO:22; Variante 5 é SEQ ID NO:44; Variante 6 é SEQ ID NO:45; Variante 7 é SEQ ID NO:46; Variante 8 é SEQ ID NO:47; Variante 9 é SEQ ID NO:48; Variante 10 é SEQ ID NO:49; Variante 11 é SEQ ID NO:50; Variante 12 é SEQ ID NO:51; Variante 13 é SEQ ID NO:52; VkI é SEQ ID NO:107; Variante 14 é SEQ ID NO:108; VkII é SEQ ID NO:109; Variante 15 é SEQ ID NO:110; VkIII é SEQ ID NO:111; Variante 16 é SEQ ID NO:112; VkIV é SEQ ID NO:113; Variante 17 é SEQ ID NO:114; VkVI é SEQ ID NO:115; e Variante 18 é SEQ ID NO:116.

[0052] A Figura 18 é uma representação pictórica representando análise de sequência e alinhamento de regiões J humanizadas (cadeias eleve capa) da invenção correspondente aos alinhamentos mostrados na Figura 17. As sequências são conforme segue: J1 é SEQ ID NO:117; J2 é SEQ ID NO:118; J3 é SEQ ID NO:119; J4 é SEQ ID NO:120; e J5 é SEQ ID NO:121.

[0053] A Figura 19 é uma representação pictórica representando utilização de códon das cadeias de VH e VL da presente invenção.

[0054] A Figura 20 é uma representação gráfica representando afinidade relativa de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (aquelas mostradas na Tabela 2).

[0055] A Figura 21 é uma representação gráfica representando afinidade relativa de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (aquelas mostradas na Tabela 2).

[0056] A Figura 22 é uma representação gráfica representando afinidade relativa de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (aquelas mostradas na Tabela 2).

[0057] A Figura 23 é uma representação gráfica representando afinidade relativa de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (aquelas mostradas na Tabela 2).

[0058] A Figura 24 é uma representação gráfica representando afinidade relativa de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (aquelas mostradas na Tabela 2).

[0059] A Figura 25A-D é uma série de representações gráficas ilustrando validação funcional em ensaios de adesão de matriz extracelular (ECM) de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção. A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (da Tabela 2) foi avaliada em um ensaio de microplaca de adesão em ECM múltiplos e em linhas de célula de câncer múltiplas. A Figura 25A utiliza PANC-1 câncer pancreático humano. A Figura 25B utiliza PANC- 1 câncer pancreático humano. A Figura 25B utiliza PANC-1 câncer pancreático humano. A Figura 25C utiliza MDA-MB-231 câncer de mama negativo triplo humano. A Figura 25D utiliza AsPC-1 câncer pancreático humano.

[0060] A Figura 26A-B é uma série de representações pictóricas e gráficas ilustrando validação funcional em ensaios de migração de matriz extracelular (ECM) de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção. A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (da Tabela 2) foi avaliada em um ensaio de migração de "scratch wound" de microplaca em fibronectina de componente de ECM com células câncer de mama negativa tripla (MDA-MB-231). A Figura 26A é uma série de imagens em ampliação 10x de placas demonstrando atenuação de migração no ferimento em OS2966, e variantes humanas compostas (H1, H2, H3) tratadas em cavidades. A Figura 26B é um gráfico de quantificação de área livre de célula para cada condição (realizada em triplicata e repetida).

[0061] A Figura 27A-B é uma série de representações pictóricas e gráficas ilustrando validação funcional em ensaios de angiogênese de formação de tubo com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção. A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (da Tabela 2), foi avaliada em um modelo in vitro de angiogênese; o ensaio de formação de tubo com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). A Figura 27A é uma série de imagens em ampliação 10x de placas demonstrando atenuação de formação de tubo vascular em OS2966 e variante humana composta (H1, H2, H3) tratadas em cavidades. A Figura 27B é uma série de gráficos de quantificação de formação de unidade fechada para cada condição (realizada em pelo menos triplicata e repetida com células progenitoras endoteliais).

[0062] A Figura 28A-B é uma série de representações pictóricas e gráficas ilustrando validação funcional em um modelo de xenoenxerto ortotópico humano de câncer de mama negativo triplo de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção. A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (da Tabela 2), foi avaliada em um modelo in vivo de câncer de mama negativo triplo humano com a linha de célula de MDA-MB-231. A Figura 28A é um gráfico mostrando grupo de volume médio de tumor por tempo. A Figura 28B é uma imagem de um western blot.

[0063] A Figura 29 é uma série de representações pictóricas ilustrando validação funcional em um modelo de xenoenxerto ortotópico humano de metástase de pulmão espontânea de câncer de mama negativo triplo de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção.

[0064] A Figura 30A-C é uma série de representações pictóricas e gráficas ilustrando validação funcional em um modelo de xenoenxerto humano de câncer pancreático de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção. A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (da Tabela 2), foi avaliada em um modelo in vivo de câncer pancreático resistente à gencitabina humana com a linha de célula de PANC1-GEMR. A Figura 30A é um gráfico mostrando grupo de volume médio de tumor por tempo. A Figura 30B é um gráfico mostrando grupo de volume médio de tumor por tempo. A Figura 30C é uma imagem de um western blot.

[0065] A Figura 31A-B é uma série de representações pictóricas e gráficas ilustrando validação funcional em um modelo de xenoenxerto humano de glioblasoma estabelecido de variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção. A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com variantes de anticorpo humano compostas da presente invenção (da Tabela 2), foi avaliada em um modelo in vivo de glioblastoma humano estabelecido com a linha de célula de U87MG. A Figura 31A é um gráfico mostrando grupo de volume médio de tumor por tempo. A Figura 3B é uma imagem de uma mancha.

[0066] A Figura 32A-B representa resultados de um ensaio de classificação de imunogenicidade (EpiScreen™). A Figura 32A é um histograma. A Figura 32B é um resumo de respostas de proliferação de célula T doadora saudável ao coorte doador.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0067] A presente invenção proporciona sequências de estrutura de VH e VL humanas, e sequências de ácido nucleico que codificam as mesmas. Tais sequências são usadas, por exemplo, para proporcionar estruturas para enxerto de CDRs de um anticorpo doador, por exemplo, um anticorpo de roedor. Desse modo, um anticorpo compreendendo uma estrutura de VH e/ou VL da invenção com a especificidade de ligação de um anticorpo doador, pode ser criado.

[0068] A invenção também proporciona anticorpo humanizado tendo a especificidade de um anticorpo denominado OS2966, por exemplo, ligação específica a integrina β1, via CDRs de OS2966 de murina, providas nas regiões de estrutura de VH e VL humanas colocadas em SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 29-57, 91100 e 107-116.

[0069] Os anticorpos humanizados da invenção são usados para uma variedade de propostas terapêuticas e diagnósticas, conforme aqui descrito. Usos incluem diagnose e tratamento de doenças, tal como câncer.

[0070] Antes das presentes composições e métodos serem descritos, é para ser compreendido que esta invenção não é limitada ao dispositivo particular, métodos, e condições experimentais descritas, tal que os dispositivos, métodos, e condições podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia usada aqui é para a proposta de descrever concretizações particulares somente, e não é pretendida para ser limitante, visto que o escopo da presente invenção será limitado somente nas reivindicações em anexo.

[0071] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", e "o" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, referências a "a composição" ou "o método" incluem uma ou mais composições e métodos, e/ou etapas do tipo aqui descritas que tornar-se-ão aparentes àqueles técnicos no assunto após leitura desta descrição, e assim por diante.

[0072] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.

[0073] O termo "integrina β1" é sinônimo com CD29, e inclui referência a uma proteína codificada pelo gene ITGB1. A integrina β1 é associada com receptores de antígeno posteriores, e é conhecido por se unir com um número de subunidades alfa incluindo alfa-1 a alfa-9, por exemplo, complexando a subunidade de alfa-3 cria complexo de α3β1 que reage a tais moléculas como netrina-1 e reelin.

[0074] Conforme aqui usado, o termo "anti-integrina β1" em referência a um anticorpo, se refere a um anticorpo que liga especificamente integrina β1.

[0075] O termo "anticorpo" se refere a um polipeptídeo codificado por um gene de imunoglobulina, ou fragmentos funcionais destes, que ligam especificamente e reconhecem um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon, e mu, bem como os genes de região variável de imunoglobulina miríade. As cadeias leves são classificadas como, ou capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

[0076] Uma unidade estrutural de imunoglobulina exemplar (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). O N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) se referem a estas cadeias leve e pesada, respectivamente.

[0077] Exemplos de fragmentos funcionais de anticorpo incluem, mas não são limitados a, moléculas completas de anticorpo, fragmentos de anticorpo, tal como Fv, Fv de cadeia simples (scFv), regiões de determinação de complementaridade (CDRs), VL (região variável de cadeia leve), VH (região variável de cadeia pesada), Fab, F(ab)2', e qualquer combinação destes, ou qualquer outra porção funcional de um peptídeo de imunoglobulina capaz de se ligar ao antígeno alvo (ver, por exemplo, Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993). Conforme apreciado por um técnico no assunto, vários fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por uma variedade de métodos, por exemplo, digestão de um anticorpo intacto com uma enzima, tal como pepsina; ou de novo síntese. Os fragmentos de anticorpo são frequentemente sintetizados de novo, ou quimicamente, ou pelo uso de metodologia de DNA recombinante. Desse modo, o termo anticorpo, conforme aqui usado, inclui fragmentos de anticorpo, ou produzidos por modificação de anticorpos inteiros, ou aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia simples), ou aqueles identificados usando bibliotecas de descrição de fago. O termo anticorpo também inclui moléculas bivalentes ou bi específicas, diacorpos, triacorpos, e tetracorpos. Moléculas bivalentes e bi específicas são conhecidas na técnica.

[0078] Referências a "VH" ou a "VH" se referem à região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo um Fv, scFv, um Fv estabilizado por disulfeto (dsFv) ou Fab. Referências a "VL" ou a "VL" se referem à região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina, incluindo de um Fv, scFv, dsFv ou Fab.

[0079] As CDRs são principalmente responsáveis pela ligação a um epítopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2, e CDR3, numeradas sequencialmente, partindo do N-terminal, e são também tipicamente identificadas pela cadeia na qual a CDR particular está localizada. Desse modo, uma CDR3 de VH está localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo na qual ela é encontrada, pelo que uma CDR1 de VL CDR1 é a CDR1 a partir do domínio variável da cadeia leve do anticorpo na qual ela é encontrada. A numeração das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve aqui é de acordo com com Kabat (ver, por exemplo, Johnson et al., (2001) "Kabat Database e its applications: future directions" Nucleic Acids Research, 29: 205-206; e the Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest, Feb. 22, 2002 Dataset), a menos que de outro modo indicado.

[0080] As posições das CDRs e regiões de estrutura podem ser determinadas usando várias definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database (IMGT), and AbM (ver, por exemplo, Johnson et al., supra; Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 1997, 273(4)). As definições de locais de combinação de antígeno são também descritas no seguinte: (Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); e Lefranc, M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(l):207-9 (2001); MacCallum et al., Antibodyantigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996); and Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); and Rees et al., In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).

[0081] Estrutura exemplar e sequências de CDR para regiões de VH e VL humanas aqui reveladas são mostradas na Figura 4.

[0082] "OS2966" se refere a um anticorpo de IgG1 de murina que se ligam especificamente a integrina β1 humana. OS2966 é comercialmente disponível (sob uma designação diferente) de várias fontes, tais como o Developmental Studies Hybridoma Bank of the University of Iowa. As cadeias pesadas e leves de OS2966 foram clonadas. As sequências de nucleotídeo e sequências de aminoácido da região de VH de OS2966 são colocadas em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente. As sequências de nucleotídeo e sequências de aminoácido da região de VL de OS2966 são colocadas em SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, respectivamente. As CDRs de OS2966 conforme designadas para o anticorpo humanizado exemplar aqui descritas são colocadas em SEQ ID NOs:23-28, e mostradas na Figura 4.

[0083] Um "anticorpo humanizado" se refere a um anticorpo que compreende uma especificidade de ligação de anticorpo doador, isto é, as regiões de CDR de um anticorpo doador, tipicamente, um anticorpo monoclonal de camundongo, enxertado em sequências de estrutura humana. Um "anticorpo humanizado", conforme aqui usado, se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo doador e, tipicamente, tem pelo menos 25% da afinidade de ligação. Um ensaio exemplar para afinidade de ligação é descrito no Exemplo 5. Métodos para determinar se o anticorpo se liga ao mesmo epítopo são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, que revela técnicas para mapeamento de epítopo, ou, alternativamente, experimentos de competição, para determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo doador. Um anticorpo humanizado que compreende uma nova região de estrutura provida na invenção.

[0084] Uma "região" ou "estrutura" de "VH" ou "VL" da invenção se refere a sequência de aminoácido de VH ou VL que tem pelo menos 70% de identidade, frequentemente, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, a uma sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NOs:29-57, SEQ ID NOs:91-100, ou SEQ ID NOs:107-116. Uma "estrutura" de uma cadeia de VH ou VL se refere às regiões de estrutura da cadeia não incluindo as CDRs. O termo conforme aplicado a cada cadeia envolve todas as regiões de estrutura.

[0085] Um "anticorpo de anti-integrina β1 humanizado" se refere a um anticorpo humanizado compreendendo uma sequência de estrutura humana que tem a especificidade de ligação da OS2966 de murina enxertada àquela estrutura. Uma CDR de um anticorpo de anti-integrina β1 humanizado da invenção tem pelo menos 85%, mais tipicamente, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para uma CDR das sequências de cadeia leve e pesada colocadas em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4, respectivamente. As CDRs da região de VH são colocadas em SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, e SEQ ID NO:25. As CDRs da região de VH são colocadas em SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, e SEQ ID NO:28.

[0086] Em um aspecto, a invenção proporciona anticorpo humanizado composto. A tecnologia de anticorpo humano composto gera anticorpos não imunogênicos humanizados, evitando-se epítopos de célula T (deimunização) em sequências de região variável (região V) (EP 2.388.871). Diferente de outras tecnologias de humanização que usam estruturas de região V humana simples como ‘aceitadores’ para regiões de determinação de complementaridade (CDRs) a partir do anticorpo de partida (tipicamente, murina), Composite Human Antibodies™ compreendem segmentos de sequência múltiplos (‘compostos’) derivados de regiões V de anticorpos humanos não relacionados. As propriedades chaves de Anticorpos Humanos Compostos são conforme segue:

[0087] Segmentos de sequência derivados de bases de dados de regiões V humanas não relacionadas são selecionados após determinação de aminoácidos que são considerados críticos para ligação de antígeno do anticorpo de partida. Todos os segmentos de sequência selecionados derivados de bases de dados de região V humana são filtrados para a presença de epítopos de célula T potenciais usando ferramentas de Antitope’s in silico. Os Composite Human Antibodies™ retêm afinidade e especificidade melhores do que o anticorpo humanizado padrão devido a ajuste próximo de segmentos de sequência humanos com todas as seções das regiões V de anticorpo de partida. Composite Human Antibodies™ são exauridos de epítopos de célula T e, portanto, considerados ambos humanizados e deimunizados.

[0088] Em uma concretização, os anticorpos da invenção são preparados por identificação de resíduos candidatos na região de estrutura que sofre mutação em locais específicos dentro dos epítopos de célula T. Os anticorpos da invenção podem exibir afinidade de ligação alterada, e/ou imunogenicidade alterada, conforme comparado a anticorpos doadores.

[0089] Métodos conhecidos na técnica podem ser usados para mapear epítopos de célula T dentro de uma sequência de proteína. Por exemplo, EpiScreen™ (EP1989544, Antitope, UK) é usado para mapear epítopos de célula T dentro de uma sequência de proteína para determinar potencial para imunogenicidade, que é baseada no número e potência de epítopos de célula T dentro de uma sequência. O mapeamento de epítopo de célula T EpiScreen™ tipicamente usa PBMCs exauridas de célula T CD8+ de um mínimo de 50 doadores tipados por HLA (selecionados para representar a população humana de interesse). Tipicamente, peptídeos de 15 meros com 12 aminoácidos que se sobrepõem com abrangência uma sequência de proteína são analisados em um grande número de culturas replicadas para estimulação de célula T CD4+ in vitro por incorporação de 3H TdR. A estimulação de célula T CD4+ é frequentemente detectada em dois ou três peptídeos adjacentes e de sobreposição, visto que o 9mer de núcleo que liga a ranhura de ligação de classe II de MHC estará presente em mais do que uma sequência de peptídeo. Após a identificação precisa de peptídeos que estimula células T CD4+ in vitro, tecnologias in silico podem ser usadas para designar variantes exauridas de epítopo (deimunizadas) por determinação da localização precisa de sequências de núcleo 9mer, e a localização de resíduos de âncora de classe II de MHC chave.

[0090] A frase "Fv de cadeia simples" ou "scFv", se refere a um anticorpo em que os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo de duas cadeias tradicional foram unidos para formar uma cadeia. Tipicamente, um peptídeo ligante é inserido entre as duas cadeias para permitir estabilização dos domínios variáveis sem interferência com o dobramento correto e criação de um local de ligação ativo. Um anticorpo humanizado de cadeia simples da invenção, por exemplo, anticorpo de anti-integrina β1 humanizado, pode se ligar como um monômero. Outros anticorpos de cadeia simples exemplares podem formar diacorpos, triacorpos, e tetracorpos. (Ver, por exemplo, Hollinger et al., 1993, supra). Adicionalmente, o anticorpo humanizado da invenção, por exemplo, anticorpo de anti-integrina β1 humanizado, pode também formar um componente de um anticorpo ou fragmento de anticorpo "reconstituído", por exemplo, um Fab, um monômero de Fab', um dímero de F(ab)'2, ou uma molécula de imunoglobulina inteira. Desse modo, um anticorpo humanizado da presente invenção pode adicionalmente compreender uma região de Fc humana.

[0091] "Unir" ou "ligar" ou "conjugar" se refere a qualquer método conhecido na técnica para conectar funcionalmente os domínios de proteína, incluindo, sem limitação, fusão recombinante com ou sem domínios de intervenção, fusão mediada por inteína, associação não- covalente, e ligação covalente, por exemplo, ligação de disulfeto, ligação de peptídeo; ligação de hidrogênio; ligação eletrostática; e ligação conformacional, por exemplo, anticorpo-antígeno, e associações de biotina-avidina. No contexto da presente invenção, os termos incluem referência a união de uma fração de anticorpo para uma molécula efetora (EM). A ligação pode ser, ou por meio químico ou por meio recombinante. O meio químico se refere a uma reação entre a fração de anticorpo e a molécula efetora, tal que existe uma ligação covalente formada entre as duas moléculas para formar uma molécula.

[0092] O termo "fração efetora" significa a porção de um imunoconjugado pretendida para ter um efeito em uma célula direcionada pelo direcionamento da fração, ou para identificar a presença do imunoconjugado. Desse modo, a fração efetora pode ser, por exemplo, uma fração terapêutica, tal como um agente citotóxico ou droga, ou uma fração detectável, tal como uma etiqueta fluorescente.

[0093] Uma "fração terapêutica" é a porção de um imunoconjugado pretendida para agir como um agente terapêutico.

[0094] O termo "agente terapêutico" inclui qualquer número de compostos atualmente conhecidos, ou mais tarde desenvolvidos, para agirem como agentes quimioterapêuticos, compostos anti-neoplásticos, compostos anti-inflamatórios, compostos anti-infectivos, ativadores ou inibidores de enzima, modificadores alostéricos, antibióticos ou outros agentes administrados para induzir um efeito terapêutico desejado em um paciente. O agente terapêutico pode também ser uma toxina, ou um radioisótopo, onde o efeito terapêutico pretendido é, por exemplo, a morte de uma célula de câncer.

[0095] Os termos "quantidade efetiva" ou "efetiva quantidade para", ou "quantidade terapeuticamente efetiva" se referem a uma quantidade suficiente para induzir uma resposta terapêutica detectável no indivíduo. De preferência, a resposta terapêutica é efetiva na redução da proliferação de células de câncer, ou na inibição do crescimento de células de câncer presentes em um indivíduo. Ensaios para determinação das respostas terapêuticas são bem conhecido na técnica.

[0096] O termo "imunoconjugado" se refere a uma composição compreendendo um anticorpo ligado a uma segunda molécula, tal como uma etiqueta detectável ou molécula efetora. Frequentemente, o anticorpo é ligado à segunda molécula por ligação covalente.

[0097] No contexto de um imunoconjugado, uma "etiqueta detectável" ou "fração detectável" se refere a uma porção do imunoconjugado que tem uma propriedade, tornando sua presença detectável. Por exemplo, o imunoconjugado pode ser etiquetado com um isótopo radioativo que permite que as células em que o imunoconjugado está presente seja detectada em ensaios de imuno- histoquímica. Uma "etiqueta detectável", ou uma "fração detectável", é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos, ou outros meios físicos. Por exemplo, etiquetas úteis incluem radioisótopos (por exemplo, 3H, 35S, 32P, 51Cr, ou 125I), corantes fluorescentes, reagentes densos de elétrons, enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, ou outros comumente usados em um ELISA), biotina, dioxigenina, ou haptenos e proteínas que pode ser tornados detectáveis, por exemplo, por incorporação de uma radioetiqueta no peptídeo, ou usado para detectar anticorpos especificamente reativos com o peptídeo.

[0098] O termo "condições imunologicamente reativas" incluem referência a condições que permitem que um anticorpo gerado em um epítopo particular se ligue àquele epítopo a um grau detectavelmente maior do que, e/ou a exclusão substancial de, ligação a substancialmente todos os outros epítopos. As condições imunologicamente reativas são dependentes do formato da reação de ligação de anticorpo e, tipicamente, são aquelas utilizadas em protocolos de imunoensaio, ou aquelas condições encontradas in vivo. Ver Harlow & Lane, supra, para uma descrição de formatos de imunoensaio e condições. De preferência, as condições imunologicamente reativas empregadas nos métodos da presente invenção são "condições fisiológicas" que incluem referência a condições (por exemplo, temperatura, osmolaridade, pH), que são típicas dentro de um mamífero vivo ou em uma célula de mamífero. Enquanto que é reconhecido que alguns órgãos são submetidos a condições extremas, o ambiente intraorganismo e intracelular normalmente está ao redor de pH 7 (isto é, de pH 6,0 a pH 8,0, mais tipicamente, pH 6,5 a 7,5), contém água como o solvente predominante, e existe a uma temperatura acima de 0 grau C e abaixo de 50 graus C. A osmolaridade está dentro da faixa que é favorável à viabilidade e proliferação da célula.

[0099] O termo "se liga especificamente", "especificidade de ligação", "se liga especificamente a um anticorpo", ou "especificamente imunorreativo com", quando se referindo a um epítopo, se refere a uma reação de ligação que é determinativa da presença do epítopo em uma população heterogênea de proteínas e outros biológicos. Desse modo, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados se ligam a um epítopo particular pelo menos duas vezes o antecedente e, mais tipicamente, mais do que 10 a 100 vezes o antecedente. Uma variedade de formatos de imunoensaio pode ser usada para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína particular ou hidrato de carbono. Por exemplo, imunoensaios ELISA de fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína ou hidrato de carbono. Ver, Harlow & Lane, ANTIBODOIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, New York (1988) and Harlow & Lane, USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, New York (1999), para uma descrição de formatos de imunoensaio e condições que podem ser usadas para determinar imunoreatividade específica. Conforme aqui usado, "se liga especificamente" significa que um anticorpo se liga a uma proteína com uma Kd de pelo menos cerca de 0,1 mM, pelo menos cerca de 1 μM, pelo menos cerca de 0,1 μM, ou melhor, ou 0,01 μM, ou melhor.

[00100] "Ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados intercambeavelmente aqui para se referir a deoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros destes, na forma, ou de trançado único, ou de trançado duplo. O termo envolve ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos, ou resíduos de suporte modificados ou ligações, que são sintéticos, que ocorrem naturalmente, e não-naturalmente, que têm propriedades de ligação similares como o ácido nucleico de referência, e que são metabolizados em uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, quiral-metil fosfonatos, 2-O-metil ribonucleotídeos, peptídeo-ácido nucleicos (PNAs). Conforme apreciado por um técnico no assunto, o complemento de uma sequência de ácido nucleico pode prontamente ser determinado a partir da sequência do outro trançado. Desse modo, qualquer sequência de ácido nucleico particular aqui colocada também revela o trançado complementar.

[00101] "Polipeptídeo," "peptídeo" e "proteína" são usados intercambiavelmente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente, bem como, polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um mimético químico artificial de um aminoácido que ocorre naturalmente correspondente.

[00102] "Aminoácido" se refere a aminoácidos que ocorrem naturalmente, e aminoácidos sintéticos, bem como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam em uma maneira similar aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são mais tarde modificados, por exemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato, e O- fosfoserina. "Análogos de aminoácido" se referem a compostos que têm a mesma estrutura química fundamental como um aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um carbono alfa que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxil, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina), ou suportes de peptídeo modificados, mas retêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente. "Miméticos de aminoácido" se referem a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona em uma maneira similar a um aminoácido que ocorre naturalmente. Os aminoácidos podem ser referidos aqui por, ou seus símbolos de três letras comumente conhecidos, ou por símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.

[00103] "Variantes conservativamente modificadas" se aplicam a ambas sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácido. Com relação a sequências de ácido nucleico particulares, variantes conservativamente modificadas se referem àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácido idênticas, ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácido, a sequências essencialmente idênticas. Devido a degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos de funcionalidade idêntica codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em toda posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer dos códons correspondentes descritos sem alteração do polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie variações conservativamente modificadas. Toda sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve toda variação silenciosa possível do ácido nucleico. Um técnico no assunto reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofano), pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[00104] Com relação a sequências de aminoácido, um técnico no assunto reconhecerá que substituições individuais, anulações ou adições a um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo, ou sequência de proteína, que alteram, adicionam ou anulam um aminoácido simples, ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada, é uma "variante conservativamente modificada", onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são em adição a, e não excluem variantes polimórficas, homólogos de interespécie, e alelos da invenção.

[00105] Por exemplo, substituições podem ser feitas no qual um aminoácido alifático (G, A, I, L, ou V) é substituído com outro membro do grupo, ou substituição tal como a substituição de um resíduo polar por outro, tal como arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico, ou glutamina por asparagina. Cada um dos seguintes oito grupos contém outros aminoácidos exemplares que são substituições conservativas para um outro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).

[00106] Estruturas macromoleculares, tais como estruturas de polipeptídeo podem ser descritas em termos de vários níveis de organização. Para uma discussão geral desta organização, ver, por exemplo, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd ed., 1994) and Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I. The Conformation of Biological Macromolecules (1980). "Estrutura primária" se refere à sequência de aminoácido de um peptídeo particular. "Estrutura secundária" se refere a estruturas tridimensionais localmente ordenadas, dentro de um polipeptídeo. "Estrutura terciária" se refere a estrutura tridimensional completa de um monômero de polipeptídeo. Os domínios são porções de um polipeptídeo que formam uma unidade compacta do polipeptídeo, e são tipicamente de 50 a 350 aminoácidos de comprimento. Os domínios típicos são compostos de seções de organização menores, tais como trechos de β-folha e a-hélices. "Estrutura quaternária" se refere a estrutura tridimensional formada por associação não-covalente de unidades terciárias independentes.

[00107] Os termos "isolados" ou "substancialmente purificados", quando aplicados a um ácido nucleico, ou proteína, denotam que o ácido nucleico ou proteína é essencialmente livre de outros componentes celulares com o qual está associado no estado natural. Ele está, de preferência, em um estado homogêneo, embora possa estar em solução, ou seca, ou aquosa. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analítica, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida, ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada.

[00108] Os termos "idêntico" ou percentagem "de identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas, ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, cerca de 60% de identidade, de preferência 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou identidade mais alta sobre uma região especificada, quando comparada e alinhada para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada), conforme medida usando os algoritmos de comparação de sequência BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros de falta descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual. Tais sequências são, em seguida, referidas como sendo "substancialmente idênticas". Esta definição também se refere a, ou pode ser aplicada a, o cumprimento de uma sequência de teste. A definição também inclui sequências que têm anulações e/ou adições, bem como aquelas que têm substituições. Conforme descrito acima, os algoritmos preferidos podem contar com folgas e similares. De preferência, identidade existe sobre uma região que é pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou, mais de preferência, sobre uma região que é de 50-100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento.

[00109] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência, a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são admitidas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. De preferência, parâmetros de programa de falta podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência, em seguida, calcula a percentagem de identidades de sequência para as sequências de teste relativas às sequências de referência, baseado nos parâmetros do programa.

[00110] Uma "janela de comparação", conforme aqui usado, inclui referência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguas selecionadas a partir do grupo consistindo em 20 a 600, usualmente cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequências para comparação, são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de alinhamento local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento global de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa para o método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)). O alinhamento de Smith & Waterman com os parâmetros de falha são frequentemente usados quando comparando com sequências conforme aqui descritas.

[00111] Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determinação de percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são usados, tipicamente com os parâmetros de falta, para determinar a percentagem identidade de sequência para ácidos nucleicos e proteínas da invenção. Software para realização de análise de BLAST é publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares de sequência de alta classificação (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de pesquisa, que ou se equiparam ou satisfazem alguma classificação limite de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. T é referido como o limite de classificação de palavra vizinha. Estes acessos de palavra vizinha inicial agem como sementes para inicialização dos pesquisadores encontrarem HSPs mais longos contendo os mesmos. Os acessos de palavra são extendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência para que a classificação de alinhamento cumulativo possa ser aumentada. Classificações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (classificação de recompensa para um par de resíduos de equiparação; sempre >0) e N (classificação de penalidade para resíduos de desequiparação; sempre <0). Para sequências de aminoácido, uma matriz de classificação é usada para calcular a classificação cumulativa. A extensão da palavra em cada direção é interrompida quando: a classificação de alinhamento cumulativa diminui pela quantidade X de seu valor alcançado máximo; a classificação cumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou o final de sua sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como faltas um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os trançados. Para sequências de aminoácido (proteína), o programa BLASTP usa como faltas um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de classificação de BLOSUM62 (ver Henikoff& Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)). Para a proposta desta invenção, o algoritmo BLAST2.0 é usado com os parâmetros de falta.

[00112] Uma "biblioteca de descrição de fago" se refere a uma "biblioteca" de bacteriófagos em cuja superfície é expressa peptídeos exógenos ou proteínas. Os peptídeos ou polipeptídeos estranhos são revelados na superfície externa do capsídeo de fago. O peptídeo estranho pode ser revelado como proteínas de fusão recombinante incorporadas como parte de uma proteína de camada de fago, como proteínas de fusão recombinante que não são normalmente proteínas de camada de fago, mas que são capazes de tornarem-se incorporadas na superfície externa do capsídeo, ou como proteínas ou peptídeos que tornam-se ligados, covalentemente ou não, a tais proteínas. Isto é acompanhado pela inserção de uma sequência de ácido nucleico exógena em um ácido nucleico que pode ser acondicionada em partículas de fago. Tais sequências de ácido nucleico exógenas podem ser inseridas, por exemplo, na sequência de codificação de um gene de proteína de camada de fago. Se a sequência estranha é clonada na estrutura, a proteína que ela codifica será expressa como parte da proteína de camada. Desse modo, bibliotecas de sequências de ácido nucleico, tais como aquelas de um repertório de anticorpo produzidas a partir dos segmentos de gene que codificam o repertório de célula B inteira de um ou mais indivíduos, podem ser, desse modo, inseridas em fagos para criar "bibliotecas de fago". Como peptídeos e proteínas representativos daqueles codificados pela biblioteca de ácido nucleico são revelados pelo fago, uma "biblioteca de descrição de peptídeo" é gerada. Enquanto que uma variedade de bacteriófagos é usada em tais construções de biblioteca, tipicamente, fagos filamentosos são usados (Dunn (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7:547-553). Ver, por exemplo, descrição de bibliotecas de descrição de fago, abaixo.

[00113] O termo "anticorpos quiméricos" se refere a anticorpos no qual a sequência de aminoácido da molécula de imunoglobulina é derivada de duas ou mais espécies. Tipicamente, a região variável de ambas cadeias leves e cadeias pesadas correspondem à região variável de anticorpos derivada de uma espécie de mamíferos (por exemplo, camundongo, rato, coelho, e similares) com a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas, enquanto que as regiões constantes são homólogas ás sequências em anticorpos derivados entre si (usualmente ser humano) para evitar indução de uma resposta imune naquela espécie.

[00114] O termo "epítopo", ou "determinante antigênico", ou "região de determinação de antígeno", são usados aqui intercambiavelmente, e se refere àquela porção de um antígeno capaz de ser reconhecido e especificamente ligado por um anticorpo particular. Quando o antígeno é um polipeptídeo, epítopos podem ser formados ambos de aminoácidos contíguos e aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Os epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos após desnaturação de proteína, pelo que epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos após desnaturação da proteína. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e, mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Um determinante antigênico pode competir com o antígeno intacto (isto é, o "imunogene" usado para induzir a resposta imune) para ligação a um anticorpo.

[00115] A competição entre anticorpos é determinada por um ensaio em que a imunoglobulina sob teste inibe ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum. Numerosos tipos de ensaios de ligação competitivos são conhecidos, por exemplo: rádio- imunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição intercalado (ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); biotina-avidina EIA direta de fase sólida (ver Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); ensaio etiquetado direto de fase sólida, ensaio intercalado direto de fase sólida (ver Harlow e Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de etiqueta direto de fase sólida usando 1-125 etiquetas (ver Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); biotina-avidina EIA direto de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); e RIA etiquetado direto (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células suportando qualquer destes, uma imunoglobulina de teste não etiquetada, e uma imunoglobulina de referência etiquetada. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de etiqueta ligada a uma superfície sólida, ou células na presença da imunoglobulina de teste. Usualmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem ligação de anticorpos ao mesmo epítopo como o anticorpo de referência, e ligação de anticorpos a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência, para que impedimento estérico ocorra. Usualmente, quando um anticorpo de competição está presente em excesso, ele inibirá ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum por pelo menos 50 ou 75%.

[00116] Os anticorpos da presente invenção, por exemplo, polipeptídeos de VH, polipeptídeos de VL, ou anticorpos de cadeia simples, podem ser gerados usando técnicas de rotina no campo de genéticas recombinantes. Textos básicos revelando os métodos gerais nesta invenção incluem Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001) and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1999).

[00117] O anticorpo humanizado da invenção pode ser gerado por enxerto da especificidade, isto é, os loops de ligação de antígeno, de um anticorpo doador, tipicamente um anticorpo de murina, a uma estrutura humana. As regiões de estrutura das cadeias leves e cadeias pesadas humanas aqui providas podem prontamente serem determinadas pelo praticante. Os números de posição das cadeias pesadas e leves são designados de acordo com esquemas de numeração comuns, por exemplo, o esquema de numeração de Kabat e Chothia. O esquema de número de Chothia é idêntico ao esquema de Kabat, mas coloca as inserções em CDR-L1 e CDR-H1 em posições estruturalmente diferentes. A menos que de outro modo indicado, o esquema de numeração de Kabat é usado aqui em referência às posições de sequência. A posição de um resíduo de aminoácido em uma sequência de VH ou VL particular não se refere ao número de aminoácidos em uma sequência particular, mas preferivelmente se refere à posição conforme designada com referência a um esquema de numeração.

[00118] As posições das CDRs e, consequentemente, as posições das regiões de estrutura das cadeias pesadas e cadeias leves humanas são determinadas usando definições que são padrões no campo. Por exemplo, as seguintes quatro definições são comumente usadas. A definição de Kabat é baseada na variabilidade de sequência, e é a mais comumente usada. A definição de Chothia é baseada na localização das regiões de loop estruturais. A definição de AbM é um compromisso entre os dois software de modelagem de anticorpo de AbM usados por Oxford Molecular. A definição de contato foi recentemente introduzida, e é baseada em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis. Os seguintes são as posições de loop, isto é, CDRs, usando as quatro definições diferentes.

[00119] Uma sequência de VH ou VL da invenção compreende uma cadeia pesada ou cadeia leve que tipicamente tem pelo menos 70% de identidade, mais tipicamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade a uma sequência compreendida por SEQ ID NOs:5-22, 29-57, 91-100 ou 107-116.

[00120] Além disso, um número de resíduos importantes foi identificado fora das CDRs de OS2966 que são, de preferência, utilizadas nas cadeias humanizadas de VH e VL. Por exemplo, em uma concretização, um ou mais resíduos de aminoácido na cadeia de VH são idênticos àqueles de OS2966 (SEQ ID NO:2), incluindo resíduos 48, 67, 69, 73, 76, 80, 89, 91 e 93. Em uma concretização, um ou mais resíduos de aminoácido na cadeia de VL são idênticos àqueles de OS2966 (SEQ ID NO:4), incluindo resíduos 36 e 71.

[00121] Um anticorpo humanizado da invenção se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo doador, por exemplo, se liga ao mesmo epítopo de integrina β1, ou compete para ligação ao mesmo epítopo de integrina β1, que OS2966 se liga a, por exemplo. Métodos para determinar se o anticorpo se liga ao mesmo epítopo são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, que revela técnicas para mapeamento de epítopo ou, alternativamente, experimentos de competição, para determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo doador.

[00122] Um anticorpo humanizado estável da invenção pode exibir afinidade alterada quando comparada ao anticorpo doador. Por exemplo, em algumas concretizações, a afinidade de uma anti-integrina β1 humanizada de cadeia simples, pode, por exemplo, ser diminuída comparada a um anticorpo de cadeia simples compreendendo as regiões de OS2966 de VH e VL. Tal diminuição pode ser por mais de 10 vezes em comparação, mas tipicamente um anticorpo humanizado da invenção tem uma afinidade que é pelo menos 25%, mais frequentemente pelo menos 50% daquele do anticorpo tipo selvagem comparável. (Um "anticorpo tipo selvagem comparável" se refere a um anticorpo da mesma concretização, por exemplo, scFv, que compreende as regiões de VH e VL do anticorpo doador). Em algumas concretizações, a afinidade para o epítopo é aumentada, tal que um anticorpo humanizado da invenção tem uma afinidade que é 2 vezes e, as vezes, 5, 10, 50, ou 100 vezes a afinidade do anticorpo tipo selvagem comparável.

[00123] As regiões de cadeia pesada e leve da invenção são tipicamente obtidas usando tecnologia de DNA recombinante. As metodologias de DNA recombinante que são comumente empregadas para realizar isto são bem conhecidas àqueles técnicos no assunto. Tipicamente, sequências de ácido nucleico que codificam as estruturas e CDRs dos anticorpos doadores são geradas por PCR, por exemplo, por extensão de sobreposição. Nesta técnica, as sequências de ligação de antígeno do anticorpo doador são tipicamente unidas às regiões de estrutura humanas por incorporação das sequências desejadas em oligonucleotídeos, e criando uma série de produtos usando PCR, que compreende as sequências humanas e doadoras desejadas. Os produtos podem, em seguida, serem unidos, tipicamente usando reações de PCR adicionais, na orientação correta, para criar as cadeias de VH e VL que compreendem regiões de estrutura humanas com CDRs de anticorpo doador. As sequências de DNA de VL e VH podem ser ligadas juntas, ou diretamente, ou através de uma sequência de DNA que codifica um ligante de peptídeo, usando técnicas bem conhecidas àqueles técnicos no assunto. Estas técnicas incluem PCR, bem como técnicas, tais como ligação in vitro. As sequências de VL e VH podem ser ligadas em qualquer orientação.

[00124] Exemplos de técnicas suficientes para direcionar técnicos no assunto através de métodos de amplificação in vitro são bem conhecido na técnica.

[00125] Os oligonucleotídeos que não são comercialmente disponíveis podem ser quimicamente sintetizados de acordo com o método de fosforamidita triéster de fase sólida primeiro descrito por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981), usando um sintetizador automático, conforme descrito em Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984). A purificação de oligonucleotídeos é por, ou eletroforese de gel de acrilamida nativa, ou por HPLC de troca de ânion, conforme descrito em Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983).

[00126] A sequência dos genes clonados e de oligonucleotídeos sintéticos pode ser verificada após clonagem usando, por exemplo, sequenciamento.

[00127] Os produtos de PCR são subclonados em vetores de clonagem adequados que são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto, e comercialmente disponíveis. A sequência de nucleotídeo das regiões de codificação de cadeia pesada ou leve é, em seguida, determinada.

[00128] Um técnico no assunto apreciará que, utilizando a informação de sequência provida para as regiões variáveis, os ácidos nucleicos que codificam estas sequências são obtidos usando qualquer número de métodos adicionais bem conhecidas àqueles técnicos no assunto. Desse modo, o DNA que codifica as regiões de Fev. é preparado por qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, outras técnicas de amplificação, tais como reação de cadeia de ligase (LCR), amplificação de transcrição, e replicação de sequência autos- sustentada, ou clonagem e restrição de sequências apropriadas.

[00129] Os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção podem também serem gerados por síntese química direta usando métodos, tais como método de fosfotriéster; o método de fosfodiéster; o método de dietilfosforamidita; e o método de suporte sólido da Patente dos Estados Unidos No. 4.458.066. Se a sequência de DNA é sintetizada quimicamente, um oligonucleotide de trançado único resultará. Este pode ser convertido em DNA de trançado duplo por hibridização com uma sequência complementar, ou por polimerização com uma polimerase de DNA usando o trançado único como um gabarito. Enquanto que é possível sintetizar quimicamente uma região de Fv de cadeia simples total, é preferível sintetizar um número de sequências mais curtas (cerca de 100 a 150 bases) que são tipicamente mais tarde repartidas juntas, por exemplo, usando PCR de extensão de sobreposição.

[00130] Para os ácidos nucleicos, os tamanhos são dados em kilobases (kb), ou pares bases (bp). Estes são estimativas derivadas de eletroforese de gel de agarose ou acrilamida, de ácidos nucleicos sequenciados, ou de sequências de DNA publicadas. Para as proteínas, os tamanhos são dados em kilodáltons (kDa), ou números de resíduo ácido. Os tamanhos da proteína são estimados de eletroforese de gel, de proteínas sequenciadas, de sequências de aminoácido derivadas, ou de sequências de proteína derivadas.

[00131] Os domínios de VH e VL de um anticorpo da invenção podem ser diretamente ligados, ou podem ser separados por um ligante, por exemplo, para estabilizar os domínios de anticorpo variável da cadeia leve e cadeia pesada, respectivamente. Ligantes adequados são bem conhecidas àqueles técnicos no assunto, e incluem os bem conhecidos ligante GlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO:122), ou uma variante destes. Por exemplo, um ligante típico é (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:123). Outros ligantes, incluindo regiões de articulação, que podem ser usados na invenção, incluem aqueles descritos, por exemplo, em Alfthan et al., Protein Eng. 8(7), 725-31; Choi et al., Eur. J Immunol. 31(1), 94-106; Hu et al, Cancer Res. 56(13), 3055-61; Kipriyanov, et al., Protein Eng. 10(4), 445-53; Pack, et al., Biotechnology (N Y) 11(11), 1271-7; and Roovers, et al., Cancer Immunol. Immunother. 50(l):51-9.

[00132] Para obter expressão de alto nível de um gene clonado ou ácido nucleico, tais como aqueles cDNAs que codificam o anticorpo humanizado, por exemplo, um anticorpo humanizado da invenção, ou um imunoconjugado ou anticorpo quimérico compreendendo um anticorpo humanizado da invenção, tipicamente subclona um ácido nucleico que codificam o anticorpo ou imunoconjugado em um vetor de expressão que contém um promotor apropriado para direcionar transcrição, um terminador de transcrição/translação, e se para um ácido nucleico que codifica uma proteína, um local de ligação de ribossomo para iniciação translacional. Promotores bacteriais adequados são bem conhecido na técnica, e descritos, por exemplo, em Sambrook et al. and Ausubel et al. Sistemas de expressão bacterial para expressão de proteína são disponíveis em, por exemplo, E. coli, Bacillus sp., and Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983). Kits para tais sistemas de expressão são comercialmente disponíveis. Sistemas de expressão eucarióticos para células de mamífero, levedura, e células de inseto, são bem conhecidos na técnica, e são também comercialmente disponíveis.

[00133] Frequentemente, de modo a expressar uma proteína em altos níveis em uma célula, a preferência de códon para o sistema de expressão é considerada na construção da sequência de ácido nucleico a ser expressa. Desse modo, um ácido nucleico de um organismo, por exemplo, um humano ou camundongo, pode ser projetado para acomodar a preferência de códon do sistema de expressão.

[00134] O promotor usado para direcionar expressão de um ácido nucleico heterólogo depende da aplicação particular. O promotor é, opcionalmente, posicionado sobre a mesma distância a partir do local de partida de transcrição heteróloga conforme é a partir do local de partida de transcrição em seu assentamento natural. Conforme é conhecido na técnica, contudo, alguma variação nesta distância pode ser acomodada sem perda de função do promotor.

[00135] Em adição ao promotor, o vetor de expressão tipicamente contém uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais requeridos para a expressão da proteína que codifica ácido nucleico em células hospedeiras. Um cassete de expressão típico, desse modo, contém um promotor operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína a ser expressa, e sinais requeridos para poliadenilação eficiente da transcrição, locais de ligação de ribossomo, e terminação de translação. A sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína pode, tipicamente, ser ligada a uma sequência de peptídeo de sinal clivável para promover secreção da proteína codificada pela célula transformada. Tais peptídeos de sinal incluiriam, entre outros, os peptídeos de sinal de ativador de plasminogene de tecido, insulina, e fator de crescimento de neurônio, e esterase de hormônio juvenil de Heliothis virescens. Elementos adicionais do cassete podem incluir intensificadores e, se DNA genômico é usado como o gene estrutural, íntrons com doador de repartição funcional e locais aceitadores.

[00136] Em adição a uma sequência promotora, o cassete de expressão deve também conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para proporcionar terminação eficiente. A região de terminação pode ser obtida do mesmo gene como a sequência promotora, ou pode ser obtida de genes diferentes.

[00137] As sequências de controle de expressão que são adequadas para uso em uma célula hospedeira particular são frequentemente obtidas por clonagem de um gene que é expresso naquela célula. Sequências de controle procarióticas comumente usadas, que são aqui definidas para incluir promotores para iniciação de transcrição, opcionalmente com um operador, junto com sequências de local de ligação de ribossomo, incluem tais promotores comumente usados como os sistemas de promotores de beta-lactamase (penicilinase) e lactose (lac) (Change et al., Nature (1977) 198: 1056), o sistema de promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057), o promotor tac (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25); e o promotor P.sub.L derivado de lambda e local de ligação de ribossomo N-gene (Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128). O sistema de promotor particular não é crítico à invenção, qualquer promotor disponível que funciona em procariotes pode ser usado.

[00138] Os vetores de expressão bacteriais padrões incluem plasmídeos, tais como plasmídeos à base de pBR322, por exemplo, pBLUESCRIPTTM, pSKF, pET23D, vetores derivados de fago-.lamda., e sistemas de expressão de fusão, tais como GST e LacZ. As etiquetas de epítopo podem também serem adicionadas a proteínas recombinantes para proporcionar métodos convenientes de isolamento, por exemplo, c-myc, HA-etiqueta, 6-His etiqueta (SEQ ID NO:124), proteína de ligação de maltose, VSV-G etiqueta, anti-DYKDDDDK etiqueta (SEQ ID NO:125), ou qualquer tal etiqueta, um número maior do qual são bem conhecidas àqueles técnicos no assunto.

[00139] Sistemas de expressão eucarióticos para células de mamífero, levedura, e células de inseto, são bem conhecidos na técnica, e são também comercialmente disponíveis. Em levedura, vetores incluem plasmídeos Yeast Integrating (por exemplo, YIp5) e plasmídeos Yeast Replicating (os plasmídeos série YRp) e pGPD-2. Vetores de expressão contendo elementos regulatórios de vírus eucariótico são tipicamente usados em vetores de expressão eucarióticos, por exemplo, vetores SV40, vetores de vírus de papilloma, e vetores derivados de vírus Epstein-Barr. Outros vetores eucarióticos exemplares incluem pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovírus pDSVE, e qualquer outro vetor que permite expressão de proteínas sob a direção do promotor de CMV, promotor precoce de SV40, promotor de SV40, promotor de metalotioneína, promotor de vírus de tumor mamário de murina, promotor de vírus de sarcoma de Rous, promotor de poli- hedrina, ou outros promotores mostrados efetivos para expressão em células eucarióticas.

[00140] Alguns sistemas de expressão têm marcadores que proporcionam amplificação de gene, tais como timidina cinase, higromicina B fosfotransferase, e di-hidrofolato reductase. Alternativamente, sistemas de expressão de alto rendimento não envolvendo amplificação de gene são também adequados, tal como usando um vetor de baculovírus em células de inseto, com uma sequência que codifica GPCR sob a direção do promotor de poli- hedrina, ou outros promotores de baculovírus fortes.

[00141] Os elementos que são tipicamente incluídos nos vetores de expressão também incluem um replicon que funciona em E. coli, um gene que codifica resistência á antibiótico para permitir seleção de bactéria que abrigam plasmídeos recombinantes, e locais de restrição únicos em regiões não-essenciais do plasmídeo, para permitir inserção de sequências eucarióticas. O gene de resistência de antibiótico particular escolhido não é crítico, qualquer um dos muitos genes de resistência conhecidos na técnica é adequado. As sequências procarióticas são, opcionalmente, escolhidas, tal que elas não interferem com a replicação do DNA em células eucarióticas, se necessário.

[00142] Métodos de transfecção padraõ são usados para produzir linhas de célula bacteriais, de mamífero, de levedura ou de inseto, que expressam grandes quantidades de proteína, que são, em seguida, purificadas usando técnicas-padrão (ver, por exemplo, Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). Transformações de células eucarióticas e procarióticas são realizadas de acordo com técnicas-padrão (ver, por exemplo, Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983).

[00143] Qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introdução de sequências de nucleotídeo estranhas em células hospedeiras pode ser usado. Estes incluem o uso de transfecção de fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, lipossomos, microinjeção, vetores de plasma, vetores virais, e qualquer dos métodos bem conhecidos para introdução de DNA genômico clonado, cDNA, DNA sintético, ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (ver, por exemplo, Sambrook and Russell, supra). É somente necessário que procedimento de engenharia genética particular usada seja capaz de introduzir com sucesso pelo menos um gene na célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo da invenção.

[00144] Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão da proteína, que é recuperada a partir da cultura usando técnicas-padrão identificadas abaixo.

[00145] Um técnico no assunto reconheceria que modificações podem ser feitas a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente invenção (isto é, um anticorpo, uma etiqueta, ou efetor, ou um imunoconjugado formado usando o anticorpo) sem diminuir sua atividade biológica. Algumas modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, expressão, ou incorporação do direcionamento da molécula em uma proteína de fusão. Tais modificações são bem conhecidas àqueles técnicos no assunto e incluem, por exemplo, códons de terminação, uma metionina adicionada no terminal amino para proporcionar aminoácidos de iniciação, local, adicional, colocados em qualquer terminal para criar locais de restrição convenientemente localizados, ou aminoácidos adicionais (tal como um poli His) para auxiliar em etapas de purificação.

[00146] Uma vez expressos, os anticorpos recombinantes, imunoconjugados, e/ou moléculas efetoras da presente invenção, podem ser purificados de acordo com procedimentos padrões da técnica, incluindo precipitação de sulfato de amônia, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, e similares (ver, geralmente, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Composições substancialmente puras de pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são mais preferidas para usos farmacêuticos. Uma vez purificado, parcialmente ou para homogeneidade conforme desejado, se para serem usados terapeuticamente, os polipeptídeos devem ser substancialmente livres de endotoxina.

[00147] Métodos para expressão de anticorpos de cadeia simples e/ou redobramento a uma forma ativa apropriada, incluindo anticorpos de cadeia simples, de bactérias, tal como E. coli, foram descritos, e são bem conhecidos e são aplicáveis aos anticorpos desta invenção. Ver, Buchner, et al., Anal Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989) and Ward, et al., Nature 341:544 (1989), todos incorporados por referência aqui.

[00148] Frequentemente, proteínas heterólogas funcionais de E. coli, ou outras bactérias, são isoladas de corpos de inclusão, e requerem solubilização usando desnaturantes fortes, e redobramento subsequente. Durante a solubilização, conforme é bem conhecido na técnica, um agente de redução deve estar presente para separar ligações de disulfeto. Um tampão exemplar com um agente de redução é: 0,1 M de Tris pH 8, 6 M de guanidina, 2 mM de EDTA, 0,3 M de DTE (ditioeritritol). Reoxidação das ligações de disulfeto pode ocorrer na presença de reagentes de tiol de baixo peso molecular na forma reduzida e oxidada, conforme descrito em Saxena, et al., Biochemistry 9: 5015-5021 (1970), incorporado por referência aqui, e especialmente conforme descrito por Buchner, et al., supra.

[00149] A renaturação é tipicamente acompanhada por diluição (por exemplo, 100 vezes) da proteína desnaturada e reduzida em tampão de redobramento. Um tampão exemplar é 0,1 M de Tris, pH 8,0, 0,5 M de L-arginina, 8 mM de glutationa oxidada (GSSG), e 2 mM de EDTA.

[00150] Como uma modificação ao protocolo de purificação de anticorpo de duas cadeias, as regiões de cadeia pesada e leve são separadamente solubilizadas e reduzidas e, em seguida, combinadas na solução de redobramento. Um rendimento preferido é obtido quando estas duas proteínas são misturadas em uma razão molar, tal que um excesso molar de 5 vezes de uma proteína sobre a outra não é excedido. É desejável adicionar glutationa oxidada ou outros compostos de oxidação de baixo peso molecular à solução de redobramento após o misturação redox ser completada.

[00151] Em adição a métodos recombinantes, os anticorpos e imunoconjugados da invenção podem também serem construídos no todo ou em parte usando síntese de peptídeo padrão. A síntese de fase sólida dos polipeptídeos da presente invenção de menos do que cerca de 50 aminoácidos de comprimento pode ser acompanhada por fixação do aminoácido de C-terminal da sequência a um suporte insolúvel, seguido por adição sequencial dos aminoácidos remanescentes na sequência. Técnicas para síntese de fase sólida são descritas por Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDESYNTHESIS, PART A. pp. 3-284; Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), e Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDESYNTHESIS, 2ND ED., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984). Proteínas de comprimento maior podem ser sintetizadas por condensação dos terminais amino e carboxila de fragmentos mais curtos. Métodos de formação de ligações de peptídeo por ativação de uma extremidade terminal de carboxila (por exemplo, pelo uso do reagente de acoplamento N, N'-dicicilo- hexilcarbodiimida), são conhecidos àqueles técnicos no assunto.

[00152] Variantes conservativamente modificadas de anticorpos da presente invenção têm pelo menos 80% de similaridade de sequência, frequentemente pelo menos 85% de similaridade de sequência, 90% de similaridade de sequência, ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de similaridade de sequência, no nível de aminoácido, com a proteína de interesse, tal como um anticorpo humanizado da invenção.

[00153] Conforme notado, o termo "variantes conservativamente modificadas" pode ser aplicado a ambos aminoácido e sequências de ácido nucleico. Com relação a sequências de ácido nucleico particulares, variantes conservativamente modificadas se referem àquelas sequências de ácido nucleico que codificam sequências de aminoácido idênticas, ou essencialmente idênticas, ou se o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácido, as sequências de ácido nucleico essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dado polipeptídeo. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em toda posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para quaisquer dos códons correspondentes descritos sem alteração do polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Toda sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve toda variação silenciosa possível do ácido nucleico. Um técnico no assunto reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[00154] Como para sequências de aminoácido, um técnico no assunto reconhecerá que substituições individuais, anulações ou adições a um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo, ou sequência de proteína, que alteram, adicionam, ou anulam um aminoácido simples, ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada, é uma "variante conservativamente modificada" onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar.

[00155] Uma concretização da presente invenção proporciona um imunoconjugado compreendendo um anticorpo humanizado da invenção, ligado a uma molécula efetora, ou etiqueta detectável. De preferência, a molécula efetora é uma molécula terapêutica, tal como, por exemplo, uma toxina, um agente quimioterapêutico, uma pequena molécula, uma citocina, ou uma quimiocima, uma enzima, ou uma radioetiqueta. Toxinas exemplares incluem, mas não são limitadas a, Pseudomonas exotoxina ou toxina da difteria. Toxinas adequadas são descritas em, por exemplo, Chaudhary, et al. (1987) Proc Natl Acad Sci US A 84:4538, Chaudhary, et al. (1989) Nature 339:394, Batra, et al. (1991) Mol Cell Biol 11:2200. Brinkmann, et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8616, Siegall, (1995) Semin Cancer Biol 6:289. Exemplos de moléculas pequenas incluem, mas não são limitadas a, compostos quimioterapêuticos, tais como taxol, doxorrubicina, etoposida, e bleiomicina. Citocinas exemplares incluem, mas não são limitadas a, IL- 1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, e IL-12. Citocionas e quimiocinas adequadas são descritas em, por exemplo, Rosenblum et al. (2000) Int J Cancer 88:267 e Xu et al. (2000) Cancer Res 60:4475 and Biragyn et al. (1999) Nat Biotechnol 17:253. Enzimas adequadas incluem, mas não são limitadas a, RNAses, DNAses, proteases, cinases, e caspases. Proteases adequadas são descritas em, por exemplo, Bosslet et al. (1992) Br J Cancer 65:234, Goshom et al. (1993) Cancer Res 53:2123, Rodrigues et al. (1995) Cancer Res 55:63, Michael et al. (1996) Immunotechnology 2:47, Haisma et al. (1998) Blood 92:184. Radioisótopos exemplares incluem, mas não são limitados a, 32P e 125I. Radionuclídeos adequados são também descritos em, por exemplo, Colcher et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263. Frações efetoras exemplares adicionais são, por exemplo, fragmentos de Fc de anticorpos homólogos ou heterólogos.

[00156] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que a sequência de qualquer molécula efetora de proteína pode ser alterada em uma maneira que não afeta substancialmente as vantagens funcionais da proteína efetora. Por exemplo, glicina e alanina são tipicamente consideradas para serem intercambiáveis como são ácido aspártico e ácido glutâmico e asparagina e glutamina. Um técnico no assunto reconhecerá que muitas variações diferentes de sequências efetoras codificarão efetores com grosseiramente a mesma atividade como o efetor nativo.

[00157] A molécula efetora e o anticorpo podem ser conjugados por meios químicos, ou por meios recombinantes, conforme descrito acima. Modificações químicas incluem, por exemplo, derivzação para a proposta de ligação da molécula efetora e o anticorpo entre si, ou diretamente, ou através do composto de ligação, por métodos que são bem conhecido na técnica de química de proteína. Ambos meios de fixação covalentes e não covalentes podem ser usados com o anticorpo humanizado da presente invenção.

[00158] O procedimento para fixação de uma molécula efetora a um anticorpo variará de acordo com a estrutura química da fração a ser fixada ao anticorpo. Os polipeptídeos tipicamente contêm uma variedade de grupos funcionais; por exemplo, grupos de ácido carboxílico (COOH), amina livre (--NH.sub.2) ou sulfidril (--SH), que são disponíveis para reação com um grupo funcional adequado em um anticorpo para resultar na ligação da molécula efetora.

[00159] Alternativamente, o anticorpo é derivado para expor ou para fixar grupos funcionais reativos adicionais. A derivatização pode envolver fixação de qualquer de um número de moléculas ligantes, tais como aquelas disponíveis de Pierce Chemical Company, Rockford Ill.

[00160] O ligante é capaz de formar ligações covalentes a ambos o anticorpo e para a molécula efetora. Ligantes adequados são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto e incluem, mas não são limitados a, ligantes de carbono de cadeia reta ou ramificada, ligantes de carbono heterocíclico, ou ligantes de peptídeo. Onde o anticorpo e a molécula efetora são polipeptídeos, os ligantes podem ser unidos ao aminoácidos constituintes através de grupos laterais (por exemplo, através de uma ligação de dissulfeto a cisteína). Contudo, em uma concretização preferida, os ligantes serão unidos aos grupos alfa carbono amino e carboxila dos aminoácidos terminais.

[00161] Em algumas circunstâncias, é desejável livrar a molécula efetora do anticorpo quando o imunoconjugado tiver alcançado seu local-alvo. Portanto, nestas circunstâncias, os imunoconjugados compreenderão ligações que são cliváveis na vizinhança do local-alvo. A clivagem do ligante para liberar a molécula efetora do anticorpo pode ser promovida por atividade enzimática, ou condições as quais o imunoconjugado é submetido, ou dentro da célula-alvo, ou na vizinhança do local-alvo. Quando o local-alvo é um tumor, um ligante que é clivável sob condições presentes no local do tumor (por exemplo, quando exposto a enzimas associadas a tumor ou pH ácido), pode ser usado.

[00162] Na concretização de conjugação química atualmente preferida, os meios de ligação da molécula efetora e do anticorpo compreendem um reagente de acoplamento hetero-bifuncional que finalmente contribui para formação de uma ligação de bissulfeto intermolecular entre a molécula efetora e o anticorpo. Outros tipos de reagentes de acoplamento que são úteis nesta capacidade para a presente invenção são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 4.545.985. Alternativamente, um dissulfeto intermolecular pode convenientemente ser formado entre cisteínas na molécula efetora e o anticorpo que ocorrem naturalmente, ou são inseridos por engenharia genética. Os meios de ligação da molécula efetora e o anticorpo podem também usar ligações de tioéter entre reagentes de reticulação hetero-bifuncional, ou reticuladores cliváveis de baixo pH específicos, ou ligantes cliváveis de protease específicos, ou outros ligantes químicos cliváveis ou não cliváveis. O meio de ligação da molécula efetora e o anticorpo pode também compreender uma ligação de peptidila formada entre a molécula efetora e o anticorpo que são separadamente sintetizados por química de síntese de peptídeo padrão ou meio recombinante.

[00163] Modificações químicas exemplares da molécula efetora e o anticorpo da presente invenção também incluem derivação com polietileno glicol (PEG) a tempo de residência prolongado no sistema circulatório e redução de imunogenicidade, de acordo com métodos bem conhecidos (Ver, por exemplo, Lisi, et al., Applied Biochem. 4:19 (1982); Beauchamp, et al., Anal Biochem. 131:25 (1982); and Goodson, et al., Bio/Technology 8:343 (1990)).

[00164] Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, serem covalentemente ou não covalentemente ligados a uma etiqueta detectável. As etiquetas detectáveis adequadas para tal uso incluem qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, óticos, ou químicos. Etiquetas úteis da presente invenção incluem contas magnéticas (por exemplo, DYNABEADS), corantes fluorescentes (por exemplo, fluoresceína isotiocianato, vermelho Texas, rodamina, proteína fluorescente verde, e similares), radioetiquetas (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, ou 32P), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, e outras comumente usadas em um ELISA), e etiquetas colorimétricas, tais como contas de ouro coloidal ou vidro ou plástico colorido (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

[00165] Meios de detecção de tais etiquetas são bem conhecidas àqueles técnicos no assunto. Desse modo, por exemplo, radioetiquetas podem ser detectadas usando película fotográfica ou contadores de cintilação, marcadores fluorescentes podem ser detectados usando um fotodetector para detectar iluminação emitida. Etiquetas enzimáticas são tipicamente detectadas por provisão da enzima com um substrato, e detecção do produto de reação produzido pela ação da enzima no substrato, e etiquetas colorimétricas são detectadas por simples visualização da etiqueta colorida.

[00166] O anticorpo e/ou composições de imunoconjugado desta invenção são particularmente úteis para administração parenteral, tais como administração intravenosa, ou administração em uma cavidade do corpo.

[00167] As composições para administração compreenderão comumente uma solução do anticorpo e/ou imunoconjugado dissolvida em um veículo farmaceuticamente aceitável, de preferência, um veículo aquoso. Uma variedade de veículos aquosos pode ser usada, por exemplo, saline tamponada, e similares. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria indesejável. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização bem conhecidas convencionais. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme requeridas para condições fisiológicas aproximadas, tais como agentes de ajuste de pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste de toxicidade, e similares, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, e similares. A concentração de proteína de fusão nestas formulações pode variar amplamente, e será selecionada principalmente baseada em volumes de fluido, viscosidades, peso corpóreo, e similares, de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do paciente.

[00168] Desse modo, uma composição farmacêutica típica da presente invenção para administração intravenosa seria cerca de 0,1 a 10 mg por paciente por dia. Dosagens de 0,1 até cerca de 100 mg por paciente por dia podem ser usadas. Métodos atuais para preparação de composições administráveis serão conhecidos ou aparentes àqueles técnicos no assunto, e são descritos em mais detalhe em tais publicações como REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19TH ED., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995).

[00169] As composições da presente invenção podem ser administradas para tratamentos terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente que sofre de uma doença, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente deter a doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para efetuar isto é definida como uma "dose terapeuticamente efetiva". Quantidades efetivas para este uso dependerão da severidade da doença e do estado geral as saúde do paciente. Uma quantidade efetiva do composto é aquela que proporciona, ou alívio subjetivo de um sintoma(s), ou um aperfeiçoamento objetivamente identificável conforme notado pelo clínico ou outro observador qualificado.

[00170] Administrações simples ou múltiplas das composições são administradas dependendo da dosagem e frequência conforme requerido e tolerado pelo paciente. Em qualquer evento, a composição deve proporcionar uma quantidade suficiente das proteínas desta invenção para tratar efetivamente o paciente. De preferência, a dosagem é administrada uma vez, mas pode ser aplicada periodicamente até que um resultado terapêutico seja alcançado, ou até que efeitos colaterais garantam descontinuação de terapia. Geralmente, a dose é suficiente para tratar ou melhorar sintomas ou sinais de doença sem produção de toxicidade inaceitável ao paciente.

[00171] As formulações parenterais de liberação controlada das composições de imunoconjugado da presente invenção podem ser produzidas como implantes, injeções oleosas, ou como sistemas particulados. Para uma visão geral mais ampla de sistemas de distribuição de proteína, ver, Banga, A. J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995), aqui incorporado por referência. Os sistemas particulados incluem microcontas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanocontas, e nanopartículas. As microcápsulas contêm a proteína terapêutica como um núcleo central. Em microcontas, o terapêutico é disperso através da partícula. Partículas, microcontas, e microcápsulas menores do que cerca de 1 μm são geralmente referidas como nanopartículas, nanocontas, e nanocápsulas, respectivamente. Os capilares têm um diâmetro de aproximadamente 5 μm, de modo que somente nanopartículas são administradas intravenosamente. As micropartículas são tipicamente ao redor de 100 μm de diâmetro, e são administradas subcutaneamente ou intramuscularmente. Ver, por exemplo, Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., pp. 219-342 (1994); and Tice & Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., pp.315-339, (1992), ambos dos quais são aqui incorporados por referência.

[00172] Os polímeros podem ser usados para liberação controlada de íon de composições de imunoconjugado da presente invenção. Várias matrizes poliméricas degradáveis e não degradáveis para uso na liberação controlada de droga são conhecidas na técnica (Langer, R., Accounts Chem. Res. 26:537-542 (1993)). Por exemplo, o copolímero de bloco, polaxâmero 407, existe como um líquido viscoso ainda móvel a baixas temperaturas, mas forma um gel semisólido na temperatura do corpo. Ele tem se mostrado ser um veículo efetivo para formulação e distribuição sustentada de interleucina-2 recombinante e urease (Johnston, et al., Pharm. Res. 9:425-434 (1992); e Pec, et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65 (1990)). Alternativamente, hidroxiapatita foi usada como um microveículo para liberação controlada de proteínas (Ijntema, et al., Int. J. Pharm. 112:215-224 (1994)). Em ainda outro aspecto, lipossomos são usados para liberação controlada, bem como direcionamento de droga da droga capsulada com lipídeo (Betageri, et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa. (1993)). Numerosos sistemas adicionais para distribuição controlada de proteínas terapêuticas são conhecidos. Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.055.303, 5.188.837, 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028, 4.957.735, 5.019.369, 5.055.303; 5.514.670; 5.413.797; 5.268.164; 5.004.697; 4.902.505; 5.506.206, 5.271.961; 5.254.342 e 5.534.496, cada uma da qual sendo incorporada aqui por referência.

[00173] Conforme aqui usado, os termos "câncer" e "canceroso" se referem a, ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos em que uma população de células são caracterizadas por crescimento de célula suprarregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, tumores benignos ou malignos. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer vulval, câncer de tiroide, câncer de cérebro, carcinoma hepático, e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, neurofibromatose tipo I ou II. Outros exemplos de tais cânceres incluem aqueles que são resistentes à terapia, refratários, ou metastáticos.

[00174] Outras doenças ou distúrbios que podem ser tratados incluem "doenças inflamatórias ou distúrbios." "Doença inflamatória ou distúrbio", conforme aqui usado, incluem, e não são limitadas a, prurite, inflamação da pele, psoríase, esclerose múltipla, artrite reumatoide, osteoartrite, lúpus eritematoso sistêmico, tiroides de Hashimoto, miastenia gravis, diabetes tipo I ou II, asma, dano inflamatório do pulmão, dano inflamatório do fígado, dano inflamatório glomerular, dermatite atópica, dermatite de contato alérgico, dermatite de contato irritante, dermatite seborreica, síndrome de Soerem, queratoconjuntivite, uveíte, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, uma doença inflamatória das juntas, pele, ou músculo, artrite inflamatória idiopática aguda ou crônica, miosite, uma doença de demielinação, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença de pulmão intersticial, nefrite intersticial, e hepatite ativa crônica.

[00175] "Metástase", conforme aqui usado, se refere ao processo pelo qual um câncer se espalha ou se transfere a partir do local de origem para outras regiões do corpo com o desenvolvimento de uma lesão cancerosa similar na nova localização. Uma célula "metastática" ou de "metastação" é uma que perde contatos adesivos com células vizinhas e migram, via a corrente sanguínea ou linfa a partir do local primário de doença, para invadir estruturas corpóreas vizinhas.

[00176] Conforme aqui usado, o termo "indivíduo" se refere a qualquer animal (por exemplo, um mamífero), incluindo, mas não limitado a, humanos, primatas não humanos, roedores, e similares, que é para ser o recipiente de um tratamento particular. Tipicamente, os termos "indivíduo" e "paciente" são usados intercambiavelmente aqui em referência a indivíduo humano.

[00177] Conforme aqui usado, o termo "indivíduo suspeito de ter câncer" se refere a um indivíduo que apresenta um ou mais sintomas indicativos de um câncer (por exemplo, um caroço ou massa perceptível), ou está sendo classificado para um câncer (por exemplo, durante uma física de rotina). Um indivíduo suspeito de ter câncer pode também ter um ou mais fatores de risco. Um indivíduo suspeito de ter câncer não foi geralmente testado para câncer. Contudo, um "indivíduo suspeito de ter câncer" envolve um indivíduo que recebeu uma diagnose inicial, mas para quem o estágio de câncer não é conhecido. O termo adicionalmente inclui pessoas que tiveram câncer uma vez (por exemplo, um indivíduo em remissão).

[00178] Conforme aqui usado, o termo "indivíduo em risco para câncer" se refere a um indivíduo com um ou mais fatores de risco para desenvolvimento de um câncer específico. Os fatores de risco incluem, mas não são limitados a, gênero, idade, predisposição genética, exposição ambiental, incidentes prévios de câncer, doenças de não câncer pré-existentes, e estilo de vida.

[00179] Conforme aqui usado, o termo "caracterização de câncer em um indivíduo" se refere à identificação de uma ou mais propriedades de uma amostra de câncer em um indivíduo, incluindo, mas não limitadas a, a presença de tecido pré-canceroso ou canceroso benigno, o estágio do câncer, e a prognose do indivíduo. Os cânceres podem ser caracterizados pela identificação da expressão de um ou mais genes de marcador de câncer, incluindo, mas não limitados a, os marcadores de câncer aqui revelados.

[00180] Conforme aqui usado, os termos "marcador(es) de célula de câncer", "marcador(es) de célula de câncer", "marcador(es) de célula de tumor", ou "marcador de célula de tumor sólido", se referem a um gene ou genes ou uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo, expressos pelo gene ou genes cujo nível de expressão, sozinho ou em combinação com outros genes, é correlacionado com a presença de células de câncer tumorigênicas comparado a células não tumorigênica, tal como integrina β1. A correlação pode se relacionar a qualquer expressão aumentada ou diminuída do gene (por exemplo, níveis aumentados ou diminuídos de mRNA, ou o peptídeo codificado pelo gene).

[00181] Conforme aqui usado, o termo "detecção de uma expressão aumentada ou diminuída relativa a controle não canceroso" se refere a medição do nível de expressão de um gene (por exemplo, o nível de mRNA ou proteína) relativo ao nível em amostra de controle não- cancerosa. A expressão de gene pode ser medida usando qualquer método adequado, incluindo, mas não limitado a, aqueles aqui descritos.

[00182] Conforme aqui usado, o termo "detecção de uma mudança na expressão de gene em uma amostra de célula na presença de referido composto de teste relativa à ausência de referido composto de teste", se refere à medição de um nível alterado de expressão (por exemplo, aumentado ou diminuído) na presença de um composto de teste relativo a ausência do composto de teste. A expressão de gene pode ser medida usando qualquer método adequado.

[00183] Conforme aqui usado, o termo "instruções para uso de referido kit para detecção de câncer no referido indivíduo" inclui instruções para uso dos reagentes contidos no kit para a detecção e caracterização de câncer em uma amostra de um indivíduo.

[00184] Conforme aqui usado, "provisão de uma diagnose", ou "informação diagnóstica", se refere a qualquer informação que é útil na determinação se um paciente tem uma doença ou condição, e/ou na classificação da doença ou condição em uma categoria fenotípica, ou qualquer categoria tendo significância com relação à prognose de ou provável resposta ao tratamento (ou tratamento em geral, ou qualquer tratamento particular) da doença ou condição. Similarmente, diagnose se refere à provisão de qualquer tipo de informação diagnóstica, incluindo, mas não limitado a, se um indivíduo é provável de ter uma condição (tal como um tumor), informação relacionada à natureza ou classificação de um tumor como, por exemplo, um tumor de alto risco, ou um tumor de baixo risco, informação relacionada à prognose, e/ou informação útil na seleção de um tratamento apropriado. A seleção de tratamento pode incluir a escolha de um agente quimioterapêutico particular, ou outra modalidade de tratamento, tal como cirurgia ou radiação, ou uma escolha sobre se recusar ou distribuir terapia.

[00185] Conforme aqui usado, os termos "proporcionando uma prognose", "informação de prognóstico", ou "informação prevista", se referem à provisão de informação relacionada ao impacto da presença de câncer (por exemplo, conforme determinado pelos métodos de diagnóstico da presente invenção) em uma saúde futura do indivíduo (por exemplo, morbidez ou mortalidade esperada, a probabilidade de obter câncer, e o risco de metástase).

[00186] Conforme aqui usado, o termo "tecido de tumor pós- cirúrgico" se refere a tecido canceroso (por exemplo, tecido de biópsia) que foi removido de um indivíduo (por exemplo, durante cirurgia).

[00187] Conforme aqui usado, o termo "indivíduo diagnosticado com um câncer" se refere a um indivíduo que foi testado e verificado ter células cancerosas. O câncer pode ser diagnosticado usando qualquer método adequado, incluindo, mas não limitado a, biópsia, raio x, teste de sangue, e os métodos de diagnóstico da presente invenção.

[00188] Conforme aqui usado, os termos "tecido de biópsia", "amostra do paciente", "amostra de tumor", e "amostra de câncer", se referem a uma amostra de células, tecido ou fluido que é removida de um indivíduo para a proposta de determinar se a amostra contém tecido canceroso, incluindo células de câncer, ou para determinar perfil de expressão de gene daquele tecido canceroso. Em algumas concretizações, o tecido de biópsia ou fluido é obtido porque um indivíduo é suspeito de ter câncer. O tecido de biópsia ou fluido é, em seguida, examinado para a presença ou ausência de câncer, células de câncer, e/ou expressão de assinatura de gene de célula de câncer.

[00189] Em certas concretizações da presente invenção, a expressão de célula de câncer, tal como câncer pancreático, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de rim, câncer de cérebro, GBM e similares, compreende níveis elevados de integrina β1 comparados a células de tumor de cólon não tumorigênicas. As integrinas são proteínas de superfície de célula de matriz extracelular heterodiméricas (ECM) que consistem de ambos uma cadeia alfa e uma cadeia beta com cadeias se associando com parceiros múltiplos para formar integrinas diferentes. As integrinas funcionam em adesão e migração celular para conectar reversivelmente células à matriz extracelular, ou para receptores em outras células, e, desse modo, podem desempenhar um papel crítico em invasão e metástase de câncer. A adesão mediada por integrina também afeta a sinalização intracelular, e pode, desse modo, regular a sobrevivência, proliferação e diferenciação de célula.

[00190] A integrina beta 1 pode formar receptores funcionais com a maior diversidade de alfa integrinas conhecidas, resultando na capacidade de interagir com uma faixa diversa de ambientes de ECM, e foi implicada em câncer. Por exemplo, a sinalização aumentada de beta 1 integrina está associada com progressão maligna de câncer de mama, ambos clinicamente, e em linhas de célula de câncer de mama.

[00191] A integrina β1 foi identificada como afetando diretamente o crescimento de tumor. Especificamente, o tratamento de células de tumor com anticorpos de anti-integrina β1 reduz o tamanho do tumor, e inibe metástase.

[00192] Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona métodos para detecção de expressão de integrina β1 como um marcador para câncer. Em algumas concretizações, a expressão é medida diretamente (por exemplo, no nível de proteína), em algumas concretizações, a expressão é detectada em amostras de tecido (por exemplo, tecido de biópsia). Em outras concretizações, a expressão é detectada nos fluidos corpóreos (por exemplo, incluindo, mas não limitado a, plasma, soro, sangue total, muco, e urina). A presente invenção adicionalmente proporciona kits para a detecção de marcadores, em algumas concretizações, a presença de um marcador de célula de câncer é usada para proporcionar uma prognose a um indivíduo. A informação provida é também usada para direcionar o curso de tratamento. Por exemplo, se um indivíduo é verificado ter um marcador indicativo de uma célula de tumor sólido, terapias adicionais (por exemplo, terapias hormonal ou de radiação) podem ser iniciadas a um ponto anterior quando elas são mais prováveis de serem efetivas (por exemplo, antes da metástase). Em adição, se um indivíduo é verificado ter um tumor que não é responsivo à terapia hormonal, o custo e inconveniência de tais terapias podem ser evitados.

[00193] Em concretizações, a expressão de gene de integrina β1 é detectada por medição do nível da proteína. A expressão de proteína pode ser detectada por qualquer método adequado. Em algumas concretizações, as proteínas são detectadas por imuno-histoquímica utilizando os anticorpos aqui descritos.

[00194] A ligação do anticorpo é detectada por técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, rádio-imunoensaio, ELISA (ensaio imunosorvente ligado à enzima), imunoensaios "intercalados", ensaios imunoradiométricos, reações de precipitação de difusão de gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (por exemplo, usando ouro coloidal, enzima ou etiquetas de radioisótopo, por exemplo), Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação (por exemplo, ensaios de aglutinação de gel, ensaios de hemaglutinação, etc.), ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A, e ensaios de imunoeletroforese, etc.

[00195] Em uma concretização, a ligação do anticorpo é detectada por detecção de uma etiqueta no anticorpo primário. Em outra concretização, o anticorpo primário é detectado por detecção da ligação de um anticorpo secundário ou reagente, ao anticorpo primário. Em uma concretização adicional, o anticorpo secundário é etiquetado. Muitos métodos são conhecido na técnica para detecção da ligação em um imunoensaio, e estão dentro do escopo da presente invenção.

[00196] Em algumas concretizações, um ensaio de detecção automático é utilizado. Métodos para a automação de imunoensaios incluem aqueles descritos nas Patentes dos Estados Unidos 5.885.530, 4.981.785, 6.159.750, e 5.358.691, cada uma da qual é aqui incorporada por referência. Em algumas concretizações, a análise e apresentação dos resultados são também automáticas. Por exemplo, em algumas concretizações, o software que gera uma prognose baseada na presença ou ausência de uma série de proteínas correspondentes a marcadores de câncer, é utilizado.

[00197] Em outras concretizações, o imunoensaio descrito nas Patentes dos Estados Unidos 5.599.677 e 5.672.480, cada uma da qual é aqui incorporada por referência, pode ser usado.

[00198] Em algumas concretizações, um programa de análise à base de computador é usado para traduzir o dado bruto gerado pelo ensaio de detecção (por exemplo, a presença, ausência, ou quantidade de um dado marcador ou marcadores) em dado de valor previsto para um clínico. O clínico pode avaliar o dado previsto usando qualquer meio adequado. Desse modo, em algumas concretizações, a presente invenção proporciona, adicionalmente, o benefício que o clínico, que não é provavelmente treinado em genética ou biologia molecular, não necessita compreender o dado bruto. O dado é apresentado diretamente ao clínico em sua forma mais útil. O clínico é, em seguida, capaz de imediatamente utilizar a informação de modo a otimizar o cuidado do indivíduo.

[00199] A presente invenção contempla qualquer método capaz de receber, processar, e transmitir a informação para, e de laboratórios que conduzem os ensaios, provedores de informação, pessoal médico, e indivíduos. Por exemplo, em algumas concretizações da presente invenção, uma amostra (por exemplo, uma biópsia, ou uma amostra de soro ou urina) é obtida de um indivíduo, e submetida a um serviço de avaliação (por exemplo, laboratório clínico em uma facilidade médica, empresa de avaliação genômica, etc.), localizada em qualquer parte do mundo (por exemplo, em um país diferente do que o país onde o indivíduo reside, ou onde a informação é finalmente usada) para gerar dado bruto. Onde a amostra compreende um tecido ou outra amostra biológica, o indivíduo pode visitar um centro médico para ter a amostra obtida e enviada ao centro de avaliação, ou os indivíduos podem coletar as próprias amostra, e enviá-las diretamente a um centro de avaliação. Onde a amostra compreende informação biológica previamente determinada, a informação pode ser diretamente enviada ao serviço de avaliação pelo indivíduo (por exemplo, um cartão de informação contendo a informação pode ser escaneado por um computador, e o dado transmitido a um computador do centro de avaliação usando um sistema de comunicação eletrônico). Uma vez recebida pelo serviço de avaliação, a amostra é processada, e um perfil é produzido (por exemplo, dado de expressão), específico para a informação diagnóstica ou prognóstica desejada para o indivíduo.

[00200] O dado de perfil é, em seguida, preparado em um formato adequado para interpretação por uma clínica de tratamento. Por exemplo, preferivelmente do que proporcionar dado de expressão bruto, o formato preparado pode representar uma diagnose ou avaliação de risco para o indivíduo, junto com recomendações para opções particulares de tratamento. O dado pode ser revelado ao clínico por qualquer método adequado. Por exemplo, em algumas concretizações, o serviço de avaliação gera um relatório que pode ser impresso para o clínico (por exemplo, no ponto de cuidado), ou revelado ao clínico em um monitor de computador.

[00201] Em algumas concretizações, a informação é primeiro analisada no ponto de cuidado, ou em uma facilidade regional. O dado bruto é, em seguida, enviado a uma facilidade de processamento central para, adicionalmente, análise e/ou conversão de dado bruto para informação útil para um clínico ou paciente. A facilidade de processamento central proporciona a vantagem de privacidade (todo dado é armazenado em uma facilidade central com protocolos de segurança uniformes), velocidade, e uniformidade de análise de dados. A facilidade de processamento central pode, em seguida, controlar o destino do dado em seguida ao tratamento do indivíduo. Por exemplo, usando um sistema de comunicação eletrônico, a facilidade central pode proporcionar dado ao clínico, ao indivíduo, ou aos pesquisadores.

[00202] Em algumas concretizações, o indivíduo é capaz de acessar diretamente os dados usando o sistema de comunicação eletrônico. O indivíduo pode escolher adicionalmente intervenção ou aconselhamento baseado nos resultados. Em algumas concretizações, o dado é usado para proposta de pesquisa. Por exemplo, o dado pode ser usado para adicionalmente otimizar a inclusão ou eliminação de marcadores como indicadores úteis de uma condição ou estágio particular de doença.

[00203] Em ainda outras concretizações, a presente invenção proporciona kits para a detecção e caracterização de câncer. Em algumas concretizações, os kits contêm anticorpos específicos para um marcador de câncer, tal como os anticorpos da presente invenção, em adição a detecção de reagentes e tampões. Em outras concretizações, os kits contêm reagentes específicos para a detecção de mRNA ou cDNA (por exemplo, sondas ou iniciadores de oligonucleotídeo). Em algumas concretizações, os kits contêm todos os componentes necessários e/ou suficientes para realizar um ensaio de detecção, incluindo todos os controles, direções para realização de ensaios, e qualquer software necessário para análise e apresentação dos resultados.

[00204] Outra concretização da presente invenção compreende um kit para testar a presença de proteínas, tal como integrina β1, por exemplo, em uma amostra de tecido, ou em um fluido corpóreo. O kit pode compreender, por exemplo, um anticorpo para detecção de um polipeptídeo. Em adição, o kit pode compreender uma amostra de referência ou amostra de controle; instruções para processamento das amostras, realização do teste e interpretação dos resultados; e tampões e outros reagentes necessários para realização do teste.

[00205] Em algumas concretizações, técnicas de formação de imagem in vivo são usadas para visualizar a expressão de marcadores de câncer em um animal (por exemplo, um mamífero humano ou mamífero não humano). Por exemplo, em algumas concretizações, a integrina β1 é etiquetada usando um anticorpo etiquetada da presente invenção. Um anticorpo especificamente ligado e anticorpo etiquetado podem ser detectados em um indivíduo usando um método de formação de imagem in vivo, incluindo, mas não limitado a, imagem de radionuclídeo, tomografia de emissão de positron, tomografia axial computadorizada, método de formação de imagem de ressonância de raio-X ou magnética, detecção de fluorescência, e detecção quiluminescente.

[00206] Os métodos de imagem in vivo da presente invenção são úteis na diagnose de cânceres que expressam marcadores de câncer de célula de tumor sólido da presente invenção (por exemplo, em câncer de mama). A imagem in vivo é usada para visualizar a presença de um marcador indicativo do câncer. Tais técnicas permitem a diagnose sem o uso de uma biópsia desagradável. Os métodos de imagem in vivo da presente invenção são também úteis para provisão de prognose para pacientes de câncer. Por exemplo, a presença de um marcador indicativo de células de câncer pode ser detectada. Os métodos de imagem in vivo da presente invenção podem, adicionalmente, ser usados para detectar cânceres metastáticos em outras partes do corpo.

[00207] Em algumas concretizações, reagentes (por exemplo, anticorpos) específicos para os marcadores de câncer da presente invenção, são fluorescentemente etiquetados. Os anticorpos etiquetados são introduzidos em um indivíduo (por exemplo, oralmente ou parenteralmente). Os anticorpos fluorescentemente etiquetados são detectados usando qualquer método adequado (por exemplo, usando o aparelho descrito na Patente dos Estados Unidos 6.198.107, aqui incorporada por referência).

[00208] Em outras concretizações, os anticorpos são radioativamente etiquetados. O uso de anticorpos para diagnose in vivo é bem conhecido na técnica.

[00209] Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona terapias para doenças e distúrbios, incluindo doenças imunológicas/doenças inflamatórias e distúrbios, dados o papel de integrina β1 em atividades funcionais mais amplas, conforme discutido acima. Adicionalmente, doenças e distúrbios que podem ser direcionados pelas composições da presente invenção incluem esclerose múltipla, doença de Crohn, artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, e similares. Similarmente, é para ser esperado que certas doenças relacionadas ao olho podem ser direcionadas, incluindo degeneração macular relacionada à idade (AMD) úmida.

[00210] Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona terapias para doenças, tal como câncer, por exemplo, câncer de mama, câncer de cérebro, câncer de próstata, e câncer de cólon. Em algumas concretizações, as terapias têm como alvo marcadores de câncer, tal como integrina β1.

[00211] Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona anticorpos que têm como alvo tumores que expressam um marcador de célula câncer, por exemplo, integrina β1.

[00212] Em algumas concretizações, os anticorpos terapêuticos compreendem um anticorpo da presente invenção conjugado a um agente citotóxico conforme discutido acima.

[00213] O seguinte exemplo é proporcionado para adicionalmente ilustrar as vantagens e características da presente invenção, mas não são pretendidos para limitar o escopo da invenção. Enquanto que eles são típicos daqueles que podem ser usados, outros procedimentos, metodologias, ou técnicas conhecidas àqueles técnicos no assunto, podem alternativamente serem usados.

EXEMPLO 1 SEQUENCIAMENTO DE GENE DE REGIÃO VARIÁVEL

[00214] Os genes que codificam o anticorpo monoclonal de integrina β1 anti-humana de OS2966 foram submetidos à análise de sequência de região variável (V). O RNA total foi extraído de 3 a 10x106 células de hibridoma usando o KitTM RNAqueous-4PCR (Ambion, Warrington, UK) e usado para sintetizar cDNA. Os fragmentos de região-V de cadeia pesada de imunoglobulina murina e leve capa foram amplificados por PCR usando iniciadores de sequência líder de camundongo degenerado (Sigma) e iniciadores de domínio constante único (Sigma), conforme mostrado na Tabela 1. Os fragmentos de PCR resultantes foram subclonados no sistema de vetor pGEM-T Easy ITM (Promega, Southampton, UK), e insertos foram sequenciados usando o primer específico de vetor, M13Forward (Sigma). Todo sequenciamento de DNA foi realizado por Geneservice Ltd, Cambridge, UK). Sequências de nucleotídeo de região-V única foram obtidas para OS2966 (SEQ ID NOs: 1 (VH) e 3 (VL)). Tabela 1.

EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE ANTICORPOS QUIMÉRICOS

[00215] As sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve do anticorpo monoclonal OS2966 foram amplificadas por PCR, e subclonadas em vetores de expressão de anticorpo pANT (Figura 14) com regiões-V de cadeia pesada e leve clonadas em pANT17 e pANT13, respectivamente. Os genes de região-V de cadeia pesada foram clonados em pANT17, via locais MluI e HindIII, em estrutura, com ou o gene de cadeia pesada humano D1 (G1m3 (G1m(f)) alotipo), ou o gene de cadeia pesada humano4, e genes de região-V de cadeia leve, foram clonados em pANT13, via locais BssHII e BamHI em estrutura com o gene de região constante de cadeia leve capa humano (Km3 alotipo). A transcrição de ambos genes de cadeia pesada e leve foi sob o controle do promotor de CMV I/E (US5168062 e US5385839, University of Iowa) e o plasmídeo pANT17 continha um mutante dhfr minigene (Simonsen & Levinson 1983, PNAS 80:2495-2499) sob o controle de um promotor SV40, e sequência polyA para seleção em células eucarióticas. Ambos pANT17 e pANT13 continham um gene de β-lactamase (ApR) para seleção procariótica e uma origem de pMB1 de replicação para propagação em células procarióticas. Todos os plasmídeos foram propagados em E. coli XL1-blue (Stratagene Cat. No. 200130).

[00216] Os construtos de expressão de cadeia pesada e leve foram, em seguida, cotransfectados, ou transientemente em células HEK293 por transfecção à base de fosfato de cálcio, ou estavelmente transfectados em células NS0 por eletroporação. O anticorpo secretado foi purificado a partir dos sobrenadantes de cultura de célula por cromatografia de Proteína A.

EXEMPLO 3 GERAÇÃO DE ANTICORPO HUMANIZADO

[00217] Os anticorpos humanizados foram gerados usando métodos descritos em EP1844074 (Antitope Ltd). Os modelos estruturais das regiões-V de camundongo foram produzidos usando Swiss PDB e analisados de modo a identificar aminoácidos importantes a partir das regiões-V de OS2966 que foram provavelmente para serem importantes para as propriedades de ligação de integrina β1 do anticorpo (‘resíduos de restrição’). Uma base de dados de sequências de região-V humanas foi usada para identificar segmentos de sequências de região-V humanas contendo cada um dos resíduos de restrição a serem usados no desenho do anticorpo humanizado. Tipicamente, dois ou mais segmentos de sequência de região-V alternativos foram usados para proporcionar cada resíduo de restrição, resultando em uma grande faixa de sequências possíveis de sequências de região-V de anti-integrina B1 humanizada. Estas sequências foram, em seguida, analisadas para a previsão de ligação de peptídeo de classe II MHC sem linha germinal por análise in silico, conforme descrito em Fothergill et al. (WO9859244, cessionário Eclagen Ltd), e também para epítopos de célula-T CD4+ usando bases de dados incluindo "The Immune Epítopo Database and Analysis Resource", disponível na web mundial em URL: immuneepitope.org/. As sequências de região-V com peptídeos de ligação de classe II MHC previstos, ou com acessos significantes contra bases de dados de epítopo de célula T, foram descartados. Isto resultou em um ajuste reduzido de Sequências de região-V. Combinações selecionadas de segmentos de sequência de região-V foram, em seguida, combinadas, para produzir sequências de aminoácido de região variável de cadeia pesada e leve humanizadas. Cinco sequências de cadeias pesadas e quatro sequências de cadeias leves (designadas VH1 a VH5, e VK1 a VK4, respectivamente) foram selecionadas (SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22) para síntese de gene. Em adição, um conjunto adicional de sequências de região-V de cadeia pesada e leve (designadas VH6 a VH15, e V5 a V13, respectivamente), foi designado (SEQ ID NOs: 29 a 38 e 44 a 52, respectivamente).

[00218] Em adição ao acima, os anticorpos humanizados foram designados usando os métodos gerais de Winter (US 6.548.640B2), conforme modificado em Winter, Carr, Harris (EP0629240B1), pelo que sequências foram designadas usando as sequências de CDR de OS2966 (SEQ ID NOs: 23 a 28) para substituir as CDRs em um conjunto de sequências de região-V de linha germinal humana com adição de sequências de região J humanas. Em adição, os resíduos de restrição conforme usados no anticorpo humanizado do parágrafo acima foram introduzidos nas sequências de estrutura de região-V de linha germinal. As sequências resultantes para as regiões-V de cadeia pesada e leve foram designadas VH16 a VH20, e V14 a V18, respectivamente, e são listadas como SEQ ID NOs: 39-43 e 53-57.

[00219] Em adição ao acima, os anticorpos de-imunizados foram designados usando os métodos gerais de Carr et al. (US7465572 B2), pelo que epítopos de célula T CD4+ dentro das sequências de região-V de OS2966 (SEQ ID NOs: 2 e 4) foram identificados, e mutações introduzidas de modo a remover potencialmente um ou mais destes epítopos.

[00220] Os DNAs que codificam regiões de variante OS2966 humanizadas foram sintetizados e subclonados nos vetores de expressão pANT17 e pANT13, conforme descrito no Exemplo 2. Todas as combinações de cadeias de VH e VK humanizadas (isto é, combinações de VH1 a VH5, e VK1 a VK4, (isto é, um total de 20 emparelhamentos) foram transientemente transfectadas em HEK293 e também transfectadas em células NS0, e o anticorpo foi purificado por cromatografia de proteína A a partir de sobrenadantes de cultura, conforme descrito no Exemplo 2.

EXEMPLO 4 ANÁLISE DE ANTICORPO HUMANIZADO

[00221] A ligação de variantes humanizadas de OS2966 derivadas de HEK e derivadas de NS0 para integrina β1 humana foi avaliada em um ELISA de competição contra o anticorpo quimérico do Exemplo 2. O anticorpo quimérico OS2966 foi biotinilado usando kit Biotin TagTM Micro Biotinylation kit (Sigma-Aldrich). Placas de 96 cavidades MaxiSorp (Nunc) foram revestidas com 0,5 μg/mL de integrina β1 humana (100 μL de volume final) a 4°C durante a noite. As placas foram lavadas com tampão de lavagem (0,05% de Tween 20 em Dulbecco’s-PBS), e bloqueadas com Dulbecco’s PBS-2% de BSA por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram, em seguida, lavadas 3 vezes com tampão de lavagem. O anticorpo humanizado de teste em várias concentrações foi pré-misturado com anticorpo quimérico biotinilado (0,02 μg/mL de concentração final) e, em seguida, adicionado à placa revestida com integrina β1 humana (100 μL de volume final). As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente, e lavadas 3 vezes com tampão de lavagem. 100 μL de 1 em diluição 500 de Estreptavidina HRP (Sigma-Aldrich) foi adicionado e incubado por 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem, e 100 μl de substrato de SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich, Cat# P9187) foi adicionado e incubado à temperatura ambiente no escuro por 4 minutos. A reação foi cessada por adição de 50 μL de HCl 3M. As placas foram lidas a 490 nm usando uma leitura de placa Dynex.

EXEMPLO 5 GERAÇÃO DE scFv’s e Fab’s

[00222] As variantes de integrina anti-humana de OS2966 humanizadas do Exemplo 3 foram convertidas em scFv’s e clonadas em vetores de demonstração de fago M13, conforme descrito em Benhar I. and Reiter Y., Current Protocols in Immunology, Unit 10.19B, Wiley Online Library, Pode 2002 (disponível na web mundial em URL: currentprotocols.com/protocol/im1019b) usando o vetor pCANTAB5E RPAS Expression Module (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK). Os genes humanizados de VH e VK foram amplificados usando iniciadores que proporcionam locais de restrição terminal SfiI e NotI, um ligante interno Gly4Ser e um etiqueta C terminal his6. Os construtos de scFv foram inseridos no vetor pCANTAB5E como fragmentos SfiI-NotI e transformados em E.coli HB2151, resultando em scFv exportado ao periplasma, e parcialmente ao meio de crescimento. Os scFv’s foram purificados do meio de crescimento por cromatografia de afinidade de níquel-quelato usando Cartuchos HIS-Select HF (Sigma-Aldrich). Os scFv’s purificados foram testados no ensaio de competição, conforme detalhado no Exemplo 4. As variantes de OS2966 humanizadas do Exemplo 3 foram também convertidas em Fab’s usando o método usado para scFv’s, exceto que genes VH e VK amplificados humanizados foram adicionalmente amplificados com genes de região constante CH1 e Cn para formar fragmentos de VH- CH1 e VK-C que foram adicionalmente amplificados com iniciadores para unir estes fragmentos com uma sequência líder pelB de 22 aminoácidos (Lei S.P., Lin H.C., Wang S.S., Callaway J., and Wilcox G., J Bacteriol. 169 (1987) p4379-4383) entre os fragmentos de gene de VH-CH1 a montante e de VK-CK a jusante, resultando em um gene de Fab dicistrônico. Os Fab’s de variantes de anticorpo humanizado foram gerados e purificados conforme acima para scFv’s, e testados no ensaio de competição de integrina β1 humana, conforme detalhado no Exemplo 4.

EXEMPLO 6 ANÁLISE DE RESPOSTAS DE CÉLULA T CD4+

[00223] A imunogenicidade potencial do anticorpo humanizado dos Exemplos 3 e 5 foi realizada em comparação a anti-integrina β1 humana humanizada K20 (Poul et al., Molecular Immunology 32 (1995) p102116). PBMCs (células mononucleares de sangue periférico) foram isoladas de "buffy coats" de doador de comunidade saudável (de sangue retirado dentro de 24 horas) obtidos a partir do UK National Blood Transfusion Service (Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK) e, de acordo com a aprovação garantida por Addenbrooke’s Hospital Local Research Ethics Committee. As PBMCs foram isoladas de densidade de centrifugação de "buffy coats" por Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, UK), e células T CD8+ T foram exauridas usando CD8+ RosetteSep™ (StemCell Technologies Inc, London, UK). Os doadores foram caracterizados por identificação de haplotipos de HLA-DR usando um kit de tipagem de tecido à base de HLA SSP-PCR (Biotest, Solihull, UK). As respostas de célula T a antígenos de controle incluindo a toxina de tétano de antígeno de retirada foram também determinadas (KLH Pierce, CramLingtom, UK, and peptides derived from Influenza A e Epstein Barr viruses). A PBMC foi, em seguida, congelada e armazenada em nitrogênio líquido até que requerida.

[00224] Para preparar células dendríticas derivadas de monócito (DC), 50 PBMCs doadoras diferentes foram selecionadas para proporcionar uma distribuição com frequências de alótipos de HLA-DR e HLA-DQ similares às frequências na população mundial total. As PBMCs foram reavivadas em meio de cultura AIM-V® e células CD14+ isoladas usando Microcontas Miltenyi CD14 e colunas LS (Miltenyi Biotech, Oxford, UK). Os monócitos foram resuspensos em AIM-V® suplementado com 1000U/mL IL-4 e 1000U/mL GM-CSF ("meio de cultura DC") a 4-6x106 PBMC/mL e, em seguida, distribuídos em placas de 24 cavidades (2 mL de volume de cultura final). As células foram alimentadas no dia 2 por meio volume DC de mudança de meio de cultura. Pelo dia 3, os monócitos se diferenciaram a DC semimaturo que foram pré-incubados com, ou 40 ug/mL de anticorpo de teste humanizado, ou anticorpo quimérico, 100 μg/mL de KLH, ou meio somente. DCs semimaturos DC foram incubados com antígeno por 24 horas após o qual excesso de anticorpo de teste foi removido por lavagem das células duas vezes e ressuspensão em meio de cultura de DC suplementado com 50 ng/mL de TNF-α (Peprotech, London, UK). Os DCs foram alimentados no dia 7 por um maio volume de mudança de meio de cultura de DC (suplementado com 50 ng/mL de TNFα) antes da coleta de DC maturo no dia 8. Os DCs maturos coletados foram contados, e a viabilidade avaliada usando exclusão de corante azul de tripano. Os DCs foram, em seguida, Y-irradiados (4000 rads) e resuspensos a 2x105 células por mL em meio AIM-V antes do uso no ELISpot e ensaios de proliferação. Adicionalmente, no dia 8, células T CD4+ T frescas foram também preparadas. Para purificar células T CD4+, as PBMCs foram reavivadas em meio de cultura AIM-V® e células CD4+ isoladas usando Microcontas Miltenyi CD4 e colunas LS (Miltenyi Biotech, Oxford, UK), e ressuspensas em meio AIM-V® em 2x106 células/mL.

[00225] No dia 8, ensaios de proliferação de célula T foram estabelecidos, pelo que 1x105 de células T CD4+ autólogas foram adicionados a 1x104 de DC carregado com anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico (razão de 10:1) em placas de 96 cavidades de fundo em U, com meio AIM-V® adicionado a um volume final de 200ul/cavidade). No dia 14, placas de ensaio foram pulsadas com 1uCi [3H] (Perkin Elmer, Beaconsfield, UK) por cavidade em 25 ul de AIMV por 6 horas antes da coleta em esteiras de filtro (Perkin Elmer) usando um coletor de célula TomTec Mach III (Hamden CT, USA). Todas as preparações de anticorpo foram testadas em culturas sextuplet. As contagens por minuto (cpm) para cada cavidade foram determinadas por contagem de cintilação Meltilex™ (Perkin Elmer) em um Contador de Cintilação 1450 Microbeta Wallac Trilux Liquid (Perkin Elmer) em contagem de fundo baixa, paralux. As contagens por minuto para cada amostra de anticorpo foram normalizadas ao meio para somente controle.

[00226] Para ensaios ELISpot, placas ELISpot (Millipore, Watford, UK) foram revestidas com 100ul/cavidade de anticorpo de captura IL-2 (R&D Systems, Abingdon, UK) em PBS. As placas foram, em seguida, lavadas duas vezes em PBS, incubadas durante a noite em tampão de bloco (1% de BSA (Sigma) em PBS), e lavadas em meio AIM V®. No dia 8, 1x105 células T CD4+ autólogas foram adicionados a 1x104 de DC carregado com antígeno (razão de 10:1) em placas de 96 cavidades ELISpot. Todas as preparações de anticorpo foram testadas em culturas sextuplet. Para cada PBMC doadora, um controle negativo (meio AIM V® sozinho), nenhum controle de células, e um controle positivo de PHA (10 ug/mL), foram também incluídos.

[00227] Após um período de incubação adicional de 7 dias, as placas ELISpot foram desenvolvidas por três lavagens sequenciais em dH2O e PBS antes da adição de 100 anticorpos de detecção biotinilatados ultrafiltrados (R&D Systems, Abingdon, UK) em PBS/1% de BSA. Em seguida à incubação a 37°C por 1,5 horas, as placas foram adicionalmente lavadas três vezes em PBS e 100 ul de estreptavidina- AP filtrada (R&D Systems) em PBS/1% de BSA foi adicionado por 1 hora (incubação à temperatura ambiente). A estreptavidina-AP foi descartada, e as placas foram lavadas quatro vezes em PBS. BCIP/NBT (R&D Systems) foi adicionado a cada cavidade e incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. O desenvolvimento de ponto foi cessado por lavagem das cavidades e os retornos das cavidades lavados três vezes com dH2O. As placas secadas foram escaneadas em um Analisador Immunoscan™ e pontos por cavidade (spw) foram determinados usando software Immunoscan™ Version 4.

[00228] Para ambos proliferação e ensaios de IL-2 ELISpot, os resultados foram expressos como um Índice de Estimulação (SI) definido como a razão de cpm (ensaio de proliferação) ou pontos (ensaio de ELISpot) para o anticorpo de teste contra um meio de somente controle usando um limite de SI igual a ou maior do que 2 (SI > 2,0) para respostas de célula T positivas.

EXEMPLO 7 MODELO DE TUMOR DE ANIMAL

[00229] Um modelo de tumor de animal pode ser usado para análise in vivo de anticorpos de anti-integrina β1 humanizados na inibição de crescimento de tumor. Por exemplo, um modelo ortótico de câncer de mama usando células MDA-MB-231 pode ser usado como um modelo de crescimento de tumor primário e metástase espontânea em camundongos abalados com integrina β1 humana, ou camundongos imune deficientes (por exemplo, nu/nu, deficiência imune combinada severa [SCID]).

[00230] Os camundongos abalados com integrina β1 (7-10 semanas de idade, machos e fêmeas, igualmente distribuídos através de grupos), podem ser injetados subcutaneamente na almofada de gordura mamária com células MDA-MB-231 em 0,1 mL de volume. O anticorpo de anti-integrina β1 da presente invenção, OS2966, ou um anticorpo de controle equiparado de isotipo, pode ser injetado em 1 mg/kg-20 mg/kg, tal como doses de 5 mg/kg ou 10 mg/kg (volume de dosagem de 10 mL/kg) semanalmente, começando no dia seguinte a administração da célula de tumor ("Dia 2"), ou quando o tumor é palpável, e o volume de tumor médio é aproximadamente 100 mm3. As medições do tumor podem ser tomadas bimensalmente durante o curso do experimento por medição de calibrador. Os animais podem ser seguidos para determinar os resultados.

EXEMPLO 8 ANÁLISE DE SEQUÊNCIA

[00231] Análise de sequência foi realizada nas cadeias pesadas e leves geradas nos Exemplos para determinar resíduos de aminoácidos VH e VL importantes fora das CDRs a partir da sequência de OS2966 que são preferivelmente incluídas nas sequências humanizadas. Tais resíduos são idênticos àqueles de OS2966, em adição àqueles de CDRs. Tais resíduos são identificados como resíduos "c" nas Figuras 15 e 16. Conforme mostrado, para os resíduos de cadeia de VH 48, 67, 69, 73, 76, 80, 89, 91 e 93 são, de preferência, idênticos aos resíduos correspondentes de OS2966 (SEQ ID NO:2). Também, para a cadeia de VL, os resíduos 36 e 71 são, de preferência, idênticos aos resíduos correspondentes de OS2966 (SEQ ID NO:4).

[00232] A utilização de códon correspondente às sequências de VH e VL é proporcionada na Figura 17, enquanto que a Figura 18 proporciona um resumo das sequências de aminoácido das cadeias de VH e VL.

EXEMPLO 9 MÉTODO DE AUMENTO DE SENSIBILIDADE DE RADIAÇÃO POR INIBIÇÃO DE INTEGRINA β1

[00233] O anticorpo humanizado da presente invenção pode ser utilizado para aumentar a sensibilidade de radiação por inibição de integrina β1, conforme revelado no Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20070237711, Park et al., Cancer Res 2008; 68:(11)4398, e Yao et al., Cancer Res 2007; 67:(2)659, todos dos quais são aqui incorporados em suas totalidades. Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados em um método de coadministração do anticorpo, ou composições contendo anticorpo aqui descritas, em combinação com radiação de ionização que causam apoptose aumentada em células de tumor, notavelmente em células de tumor de câncer de mama.

EXEMPLO 10 VALIDAÇÃO E ANÁLISE DE VARIANTES DE ANTICORPO HUMANO COMPOSTAS

[00234] Os anticorpos humanizados compostos foram gerados conforme discutido no Exemplo 3. A Tabela 2 proporciona uma lista dos vários anticorpos gerados mostrando que sequências de VH e Vk foram utilizadas. Tabela 2. Designações de variante de acordo com ID de região V.

[00235] A ligação de variantes de anticorpo humano compostas (da Tabela 2) foi avaliada em um ensaio de FACS de competição com o anticorpo quimérico de murina OS2966 (OS2966 de murina Fab fatiado a Fc humano). Em breve, uma série de diluição (três vezes) de anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado partindo de 25,0 μg/mL, foi pré- misturada com uma concentração constante de OS2966 de murina (0,1875 μg/mL) em tampão de FACS (1% de BSA em 1x PBS pH 7,4) antes da mistura com 3x105 células de Jurkat. Após incubação em gelo por 1 hora, as células foram lavadas, e a ligação de OS2966 de murina foi detectada com Fc de antimurina de cabra etiquetado com PE (Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 115-116-071). Após incubação em gelo por 45 min, as células foram lavadas, ressuspensas em 300 μL de tampão de FACS, e analisadas em um Beckton Dickinson FACScaliburTM. A intensidade de fluorescência de média geométrica foi plotada contra a concentração de anticorpo (Figuras 20-24). Estes dados foram usados para calcular valores de IC50 para cada anticorpo, e estes valores foram normalizados ao IC50 de anticorpo quimérico que foi incluído em cada ensaio de FACS (Tabela 3). Tabela 3. Afinidade relativa da variante humana. O IC50 relativo foi calculado por divisão do IC50 do anticorpo de teste por aquele do anticorpo quimérico ensaiado no mesmo modo.

[00236] Estas variantes (H1, H2, H5) demonstraram afinidades relativas levemente maiores, e quatro variantes (H3, H4, H10, H13) têm afinidades relativas significantemente mais baixas do que o OS2966 de murina.

[00237] A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com os anticorpos de variante humana foi avaliada em um ensaio de microplaca de adesão em ECM múltiplo, e em linhas de célula de câncer múltiplas de PANC-1 câncer pancreático humano (Figuras 25A e 25B), MDA-MB- 231 câncer de mama negativo triplo humano (Figura 25C), e AsPC-1 câncer pancreático humano (Figura 25D). Em breve, os ensaios de adesão de ECM foram realizados com 10 μg/mL de componentes de ECM ou BSA (controle). As células foram pré-incubadas com 10 μg/mL de anticorpos em meio de DMEM/F12 livre de soro por 30 min. A adesão foi testada por 30 min a 1 hora. As células não aderentes foram removidas de pratos, as células fixadas com 1% de paraformaldeído, e as placas manchadas com violeta em cristal por 30 min. Após enxaguamento extensivo, violeta em cristal foi solubilizado em Triton X100 por 1 hora, e as placas lidas para absorvência a A590.

[00238] Todas as 19 variantes humanas foram funcionalmente ativas na atenuação de adesão de célula a todo ECM com alguma variação significante dependendo da proteína de ECM e linha de célula. As afinidades relativas (Tabela 3) não demonstram correlação óbvia para função neste ensaio indiferente do tipo de ECM, ou linha de célula. Estes dados foram normalizados para controle negativo de IgG (BSA, albumina de soro bovino como controle negativo; IgG, controle de isotipol; OS2966, OS2966 de murina; TS2/16, anticorpo de ativação de integrina β1 de controle positivo; FN, fibronectina; LN, laminina; C1, colágeno tipo I; C4, colágeno tipo IV).

[00239] A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com os anticorpos de variante humana foi avaliada em um ensaio de migração de "scratch wound" de microplaca em fibronectina de componente de ECM com células de câncer de mama negativo triplo humano (MDA- MB-231). Brevemente, as placas foram revestidas com 10 μg/mL de fibronectina, e semeadas com células de tumor. Uma ponta de pipeta amarela foi usada para arranhar monocamadas de células confluentes e meio substituído incluindo 10 μg/mL dos anticorpos citados. As placas foram fixadas após 8 horas de incubação a 37C e obtidas imagens. Imagens de ampliação 10x de placas demonstraram atenuação de migração no arrranhão em OS2966 e variante humana composta (H1, H2, H3) tratadas nas cavidades (Figura 26A). A quantificação de área livre de célula para cada condição (realizada em triplicata e repetida) é mostrada na Figura 26B.

[00240] A migração de células de câncer de mama negativo triplo foi significantemente atenuada por tratamento com variantes humanas compostas de OS2966.

[00241] A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com os anticorpos variantes humanos foi avaliada em um modelo in vitro de angiogênese; o ensaio de formação de tubo com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). Brevemente, as placas foram revestidas com Matrigel ECM, e semeadas com células de HUVEC. As placas foram observadas por imagem após 8 horas de incubação a 37C, e quantificadas para formação de tubo vascular (formação de unidade fechada). Imagens em ampliação 10x das placas demonstraram atenuação de formação de tubo vascular em OS2966 e variante humana composta (H1, H2, H3) tratadas nas cavidades (Figura 27A). A quantificação de formação de unidade fechada para cada condição (realizada em pelo menos triplicata e repetida com células progenitoras endoteliais) é mostrada na Figura 27B.

[00242] As variantes humanas compostas bloqueiam completamente a angiogênese no ensaio de formação de tubo in vitro.

[00243] A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com os anticorpos variantes humanos foi avaliada em um modelo in vivo de câncer de mama negativo triplo humano com a linha de célula de MDA- MB-231. Brevemente, 106 células foram injetadas na 4a almofada de gordura mamária em camundongos de 5 a 6 semanas de idade fêmeas atímicos nus nu/nu. Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento após os tumores serem estabelecidos (volume subcutâneo médio = 80-100 mm3). Os anticorpos de controle e experimentais foram administrados a 5 mg/kg intraperitonealmente (IP) duas vezes semanalmente. A IgG humana em doses equivalentes serviram como o controle (Sigma). Tumores ortotópicos foram medidos com calibradores duas vezes semanalmente. Conforme mostrado na Figura 28A, variantes humanas H1-H3 atenuaram significantemente o crescimento de tumores de MDA-MB-231 in vivo comparados a controle de IgG. Uma tendência para eficácia superior para as variantes humanas compostas foi aparente comparada a OS2966 de murina, particularmente para H3. Análise farmacodinâmica de Western Blot demonstrou uma redução de atividades em trajetórias de sinalização de pró-crescimento crítico (Cinase relacionada Extracelular fosforilada, ERK, e Cinase de Adesão Focal fosforilada, FAK) em tumores tratados comparados para controle que podem ter contribuído para proliferação reduzida e elevação de apoptose (Figura 28B).

[00244] A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com os anticorpos variantes humanos foi avaliada em um modelo in vivo de metástase de pulmão espontânea com câncer de mama negativo triplo humano com a linha de célula de MDA-MB-231. Brevemente, 106 células foram injetadas na 4a almofada de gordura mamária em camundongos de 5 a 6 semanas de idade fêmeas atímicos nus nu/nu. Os camundongos foram randomizados nos grupos de tratamento após os tumores serem estabelecidos (volume subcutâneo médio = 80-100 mm3). Os anticorpos de controle e experimentais foram administrados a 5 mg/kg intraperitonealmente (IP) duas vezes semanalmente. A IgG humana a doses equivalentes serviu como o controle (Sigma). Após 7 semanas, os camundongos foram perfundidos, os pulmões coletados, e seccionados coronalmente para análise de H&E. Metástase de pulmão espontânea foi observada em 50% (3 de 6) dos camundongos dados anticorpo de controle de IgG. Metástases de pulmão espontâneas mão foram observadas em qualquer camundongo dado OS2966 ou variantes humanas compostas H1-H3 (0%, 0/28 camundongos). Os resultados são mostrados na Figura 29.

[00245] As variantes humanas compostas impedem completamente metástase de pulmão espontânea em um modelo ortotópico de câncer de mama negativo triplo.

[00246] A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com os anticorpos variantes humanos foi avaliada em um modelo in vivo de câncer pancreático resistente à gencitabina humana com a linha de célula PANC1-GEMR. Brevemente, 106 células foram injetadas subcutaneamente em camundongos de 5 a 6 semanas de idade machos nus atímicos nu/nu. Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento após os tumores serem estabelecidos (volume subcutâneo médio = 80-100 mm3). Os anticorpos de controle e experimentais foram administrados a 5 mg/kg intraperitonealmente (IP) duas vezes semanalmente, ou gencitabina a 50 mg/kg. IgG humana a doses equivalentes serviu como o controle (Sigma). Tumores subcutâneos foram medidos com calibradores duas vezes semanalmente. A Figura 30A mostra verificação in vivo de resistência à gencitabina na linha de PANC1-GEMR. A Figura 30B mostra que a variante humana composta H3 atenuou significantemente o crescimento de tumores de PANC1-GEMR in vivo comparado ao controle de IgG. A Figura 30C mostra análise farmacodinâmica de Western Blot de trajetórias de sinalização de pró-crescimento crítico (Cinase relacionada a Extracelular fosforilada, ERK, e Cinase de Adesão Focal fosforilada, FAK) em tumores tratados comparados a controle, que podem ter contribuído para proliferação reduzida e elevação de apoptose.

[00247] A inibição funcional da subunidade de integrina β1 com os anticorpos variantes humanos foi avaliada em um modelo in vivo de glioblastoma humano estabelecido com a linha de célula de U87MG. Brevemente, 107 células foram injetadas subcutaneamente em camundongos de 5 a 6 semanas de idade machos atímicos nus nu/nu. Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento após os tumores serem bem estabelecidos (volume subcutâneo médio = ~200-250 mm3). Os anticorpos de controle e experimentais foram administrados a 5 mg/kg intraperitonealmente (IP) duas vezes semanalmente. A IgG humana em doses equivalentes serviu como o controle (Sigma). Tumores subcutâneos foram medidos com calibradores duas vezes semanalmente. A Figura 31A demonstra que a variante humana composta H3 atenua significantemente o crescimento de tumores de glioblastoma estabelecido in vivo comparado a controle de IgG. A eficácia de H3 foi equivalente a OS2966 de murina. A análise farmacodinâmica de Western Blot demonstrou uma redução de atividades em trajetórias de sinalização de pró-crescimento crítico (Cinase relacionada a Extracelular fosforilada, ERK, e Cinase de Adesão Focal fosforilada, FAK) em tumores tratados com H3 comparados a controle, que podem ter contribuído para proliferação reduzida e elevação de apoptose, conforme mostrado na Figura 31B.

[00248] O ensaio de proliferação de célula T de curso de tempo EpiScreen™ foi usado para determinar o potencial para imunogenicidade clínica de anticorpo variante H3. Os anticorpos totalmente humanizados e quiméricos foram testados para sua capacidade de induzir respostas de célula T CD4+ conforme medidas por proliferação contra um painel de 12 doadores tipados com HLA. As respostas de proliferação de célula T de doador saudável ao anticorpo IS2966 quiméricos (murina/humano), anticorpo H3 humanizado, e um anticorpo humanizado de controle positivo, são mostradas na Figura 32A. As células T CD4+ foram incubadas com DC mature autólogo carregado com as amostras e avaliadas para proliferação após 7 dias de incubação. As respostas de proliferação com um SI > 2,00 (indicadas por linha pontilhada vermelha) que foram significantes (p < 0,05) usando duas amostras de teste student’s t não emparelhadas, foram consideradas positivas. A Figura 32B proporciona um resumo de respostas de proliferação de célula T doadora saudável ao coorte do doador. Positivo (SI > 2,00, significante p < 0,05). Respostas de célula T para proliferação ("P") são mostradas. Respostas de fronteira (significante p < 0,05 com SI > 1,90) são mostradas (*). As frequências de respostas positivas para o ensaio de proliferação são mostradas como uma percentagem no fundo das colunas. A33 (A33 humanizado) é o controle de bancada clínico mAb que mostra altos níveis de imunogenicidade na clínica, e rotineiramente induz 20-30% de respostas de célula T em ensaio de EpiScreen. Para cada doador, um controle de reprodutibilidade imunogênico (células incubadas com 100 μg/mL KLH), foi também incluído.

[00249] Uma variante humana composta H3 demonstrou imunogenicidade significantemente reduzida (0% de respostas) comparada àquela OS2966 murina/humana quimera (25% de respostas). É concluído que o anticorpo humano H3 exibe um perfil de imunogenicidade clinicamente aceitável a partir do ensaio de EpiScreen™ proporcionando confirmação de imunogenicidade reduzida como um resultado da tecnologia de Anticorpo Humano Composto de Antitope.

[00250] Embora a invenção tenha sido descrita com referência ao exemplo acima, será compreendido que modificações e variações são envolvidas dentro do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, a invenção é limitada somente pelas reivindicações que se seguem.

Claims (16)

1. Anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de que liga especificamente a integrina β1, compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a região VH e a região VL têm uma sequência de aminoácidos, respectivamente, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 2 e 4, SEQ ID NOs: 6 e 16, SEQ ID NOs: 6 e 18, SEQ ID NOs: 6 e 20, SEQ ID NOs: 8 e 16, SEQ ID NOs: 8 e 18, SEQ ID NOs: 8 e 20, SEQ ID NOs: 8 e 22, SEQ ID NOs: 10 e 16, SEQ ID NOs: 10 e 18, SEQ ID NOs: 10 e 20, SEQ ID NOs: 10 e 22, SEQ ID NOs: 12 e 16, SEQ ID NOs: 12 e 18, SEQ ID NOs: 12 e 20, SEQ ID NOs: 12 e 22, SEQ ID NOs: 14 e 16, SEQ ID NOs: 14 e 18, SEQ ID NOs: 14 e 20 e SEQ ID NOs: 14 e 22.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das regiões de VH e VL são de um anticorpo doador, como OS2966.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as CDRs da região de VH têm sequências de aminoácido como apresentadas em SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, ou em que as CDRs da região de VL têm sequências de aminoácido como apresentadas em SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:28.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compete com OS2966 para ligação específica a integrina β1.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que, quando testado in vitro para indução de respostas de célula T auxiliadora CD4+ em amostras de sangue com uma distribuição de alótipos HLA-DR a partir da população humana, produz menos do que 10% de respostas de célula T.

6. Anticorpo multiespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais anticorpos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Região de VH, caracterizada pelo fato de que apresenta uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NOs:29-43, SEQ ID NOs:91-99 e SEQ ID NO:100.

8. Região de VL, caracterizada pelo fato de que apresenta uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NOs:44-57, SEQ ID NOs:107-115 e SEQ ID NO:116.

9. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende sequências de ácido nucleico conforme estabelecidas nas SEQ ID NOs:1 e 3, SEQ ID NOs:5 e 15, SEQ ID NOs:5 e 17, SEQ ID NOs:5 e 19, SEQ ID NOs:7 e 15, SEQ ID NOs:7 e 17, SEQ ID NOs:7 e 19, SEQ ID NOs:7 e 21, SEQ ID NOs:9 e 15, SEQ ID NOs:9 e 17, SEQ ID NOs:9 e 20, SEQ ID NOs: 9 e 21, SEQ ID NOs:11 e 15, SEQ ID NOs:11 e 17, SEQ ID NOs:1 e 19, SEQ ID NOs:11 e 21, SEQ ID NOs:13 e 15, SEQ ID NOs:13 e 17, SEQ ID NOs:13 e 19 e SEQ ID NOs:13 e 21.

10. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 9.

11. Célula hospedeira procariótica isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 10.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 9, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ligado a uma fração detectável tal como uma fração fluorescente ou uma fração terapêutica, por exemplo uma fração citotóxica ou um agente quimioterapêutico.

14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, ou imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença, tal como um distúrbio proliferativo de célula ou uma doença inflamatória.

15. Método in vitro para detecção de uma doença de proliferação celular ou uma doença inflamatória, como definida na reivindicação 14, em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contatar o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, com uma amostra do indivíduo; b) detectar o nível de integrina β1 via ligação específica do anticorpo com integrina β1; e c) comparar o nível detectado de integrina β1 àquele de integrina β1 em uma amostra normal, em que um nível aumentado de integrina β1 na amostra do indivíduo conforme comparado à amostra normal é indicativo de uma doença.

16. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, uma molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 9, ou um imunoconjugado, como definido na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio de proliferação celular selecionado a partir de linfoma, leucemia, câncer de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer de colo do útero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, cérebro, hepático carcinoma, câncer de cabeça e pescoço, neurofibromatose tipo I ou II ou uma doença inflamatória selecionada a partir de prurido, inflamação da pele, psoríase, esclerose múltipla, artrite reumatóide, osteoartrite, lúpus eritematoso sistêmico, tireóide de Hashimoto, miastenia gravis, diabetes tipo I ou II, asma ,lesão pulmonar inflamatória, lesão hepática inflamatória, lesão glomerular inflamatória, dermatite atópica, dermatite de contato alérgica, dermatite de contato irritante, dermatite seborreica, síndrome de Sjogren, ceratoconjuntivite, uveíte, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, uma doença inflamatória das articulações, pele ou músculo, artrite inflamatória idiopática aguda ou crônica, miosite, uma doença desmielinizante, obstrutiva crônica doença pulmonar, doença pulmonar intersticial, nefrite intersticial e hepatite crônica ativa.

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