CN104988136A - 一种巨魾鱼微卫星标记开发的方法及其应用 - Google Patents
一种巨魾鱼微卫星标记开发的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种巨魾鱼微卫星标记开发的方法及其应用，剪取巨魾活鱼的肌肉或者肝脏等组织各5克混合，放于干冰寄测序公司或者-80℃冰箱保存；然后进行总RNA提取，用核算测定仪进行RNA纯度检测，以260/280比值来鉴定其质量；利用Takara M-MLV反转录试剂盒进行cDNA合成，送测序仪进行转录组测序后进行序列整理；再利用软件找出微卫星序列，在核心序列两侧设计引物并合成；利用温度梯度PCR进行引物退火温度的优化；利用4条巨魾提取的DNA进行PCR扩增后进行非变性聚丙烯酰胺胶电泳，利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的即为多态性微卫星引物。本方法花费时间短、费用低、精度高、覆盖范围广、效率高。
Description
技术领域
本发明属于动物微卫星标记技术领域。
背景技术
巨魾（Bagarius yarrelli Sykes）属于鲇形目，鮡科，魾属。中国分布在云南省的元江、澜沧江、怒江；近年来，随着环境的变迁、经济的发展、鱼类捕捞强度逐步加大，使得鱼类的种类、数目都急剧减少,导致种群内亲缘关系接近的个体交配的几率大大增加,遗传多样性明显下降，因此利用微卫星分子标记技术来对巨魾鱼的群体遗传结构、不同群体的遗传变异进行标记，以对此鱼类的种质资源进行保护，为以后的人工养殖及繁殖提供基础数据就显得日益迫切。但是目前巨魾鱼类的微卫星标记尚未见报道。
微卫星是指由1-6bp核苷酸为重复单元组成的短串连重复( Short tandem repeats)或简单重复序列( Simple Sequence Repeat,SSR)，又称为微卫星DNA。微卫星分子标记符合孟德尔遗传规律，是分析物种遗传多样性的重要方法，微卫星分子标记具有多态性丰富、分布广、重复性好、呈共显性遗传等特点，已成为第二代分子标记的代表。而开发出物种特有的微卫星标记是进行微卫星标记的前提条件。开发微卫星引物的方法有经典的构建与筛选基因组文库的方法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等四种，这些方法都存在不同的缺陷，比如经典的构建与筛选基因组文库的方法中存在程序复杂，如果测序片段大则测序困难，而小片段的又存在成功率低；微卫星富集法仍然需要构建文库，操作繁琐，成本较高；省略筛库法开发出的引物特异性低；数据库搜索法由于许多物种至今还没有公开的DNA序列，限制了这种方法的应用。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种花费时间短、费用较低、精度高、覆盖范围广从而效率较高的巨魾鱼微卫星标记开发的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
巨魾鱼微卫星标记开发的方法，方法步骤如下：
（1）剪取巨魾活鱼的肌肉或者肝脏等组织各5克混合，放于干冰寄测序公司或者-80℃冰箱保存；
（2）进行总RNA提取，步骤如下：
1) 取 0.1g混合组织在液氮中充分研磨，移入1mL Trizol中，混匀后室温下静置5min，使核蛋白复合物完全解离；
2) 加入0.2mL氯仿，剧烈摇动或用旋涡震荡器混匀，4℃下12000rpm离心15min；
3) 吸取上清液；
4) 在吸取的上清液中，每1mL Trizol加入500μl的异丙醇，充分混匀后，于室温放置10min；
5)在 4℃下12000rpm离心10min，倒掉上清液；
6) 收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗涤两次，重复上述步骤5）的离心过程；
7) 用一次性吸头吸尽残存的乙醇，将打开管盖的离心管置放于实验台上，使残余的乙醇挥发掉，不要让RNA干透；
8) 加入适量RNase-Free的超纯水，将RNA沉淀充分溶解；
（3）用核算测定仪进行RNA纯度检测，以260/280比值来鉴定其质量；
（4）利用Takara M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的合成，步骤如下：
1) 取测定浓度的RNA溶液，取含有1μgRNA的溶液，加入1μl的浓度为25μM的随机引物，加RNase-Free的水补充体积到6μl；
2) 混合均匀后，将混合液置于70℃加热10min；
3) 取出样品，放置在冰上2min，冷却；
4) 依次加入2μl的5×M-MLV buffer、0.5μl的浓度为10mM 的dNTP、0.25μl的浓度为40U/μl 的RNase 抑制剂、200U的M-MLV反转录酶，加水补齐到10μl，混匀；
5) 将混匀的液体置于30℃加热10min，42℃加热1h，70℃加热15min；
（5）送测序公司的测序仪进行转录组测序；
（6）序列整理，得到DNA序列表；
（7）利用软件找出微卫星序列，在核心序列两侧设计引物并合成；
（8）利用温度梯度PCR进行引物退火温度的优化：根据引物合成公司的引物合成时的温度±5℃进行退火温度的筛选，扩增出引物设计时的目的片段的大小；
（9）利用4条巨魾提取的DNA进行PCR扩增后进行非变性聚丙烯酰胺胶电泳，利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的为多态性微卫星引物；
本发明所述巨魾鱼微卫星标记开发的方法的应用，可利用筛选出来的多态性微卫星引物对待分析的鱼的DNA顺序进行PCR扩增、进行非变性聚丙烯酰胺胶电泳、凝胶成像分析仪进行条带分析、进行条带多态性评估，得到巨魾的遗传结构，对巨魾的遗传多样性进行评估。
本发明利用转录组测序方法，对巨魾鱼微卫星标记花费的时间通常只需3-5天，不仅花费时间短，且费用较低，能量高，精度高，结果稳定性好，覆盖范围广，效率高。
附图说明
图1为微卫星引物在巨魾鱼中的扩增电泳图。
具体实施方式
巨魾鱼微卫星标记开发的方法，方法步骤如下：
（1）剪取巨魾活鱼的肌肉或者肝脏等组织各5克混合，放于干冰寄测序公司或者-80℃冰箱保存；
（2）进行总RNA提取，具体步骤如下：
1) 取 0.1g步骤（1）的混合组织，在液氮中充分研磨，移入1mL Trizol中，混匀后室温下静置5min， 使核蛋白复合物完全解离。样品体积不超过所用Trizol体积的10%；
2) 加入0.2mL氯仿，剧烈摇动或用旋涡震荡器混匀，4℃下12000rpm离心15min；
3) 吸取上清液，重复吸取一次或多次；
4) 在吸取的上清液中，每1mL Trizol加入500μl的异丙醇，充分混匀后，于室温放置10min；
5)于 4℃下12000rpm离心10min，小心倒掉上清液；
6) 收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗涤两次，重复一次上述步骤5）的离心过程；
7) 用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇，将打开管盖的离心管放在实验台上几分钟，使残余的乙醇挥发掉，不要让RNA干透；
8) 加入适量RNase-Free的超纯水，将RNA沉淀充分溶解；
（3）用核算测定仪进行RNA纯度检测，以260/280比值来鉴定其质量；
（4）利用Takara M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的合成，步骤如下：
1) 取测定浓度的RNA溶液，取含有1μgRNA的溶液，加入1μl的浓度为25μM的随机引物，加RNase-Free的水补充体积到6μ；
2) 混合均匀后，将混合液置于70℃加热10min；
3) 取出样品，放置在冰上2min，冷却；
4) 依次加入2μl的5×M-MLV buffer，0.5μl的dNTP10mM 的dNTP、0.25μl的浓度为40U/μl 的RNase 抑制剂、，200U的M-MLV反转录酶，加水补齐到10μl，混匀；
5)将上述混匀的液体置于30℃加热10min，42℃加热1h，70℃加热15min。；
（5）送测序公司的测序仪进行转录组测序；
（6）进行DNA序列整理，序列表如下：
<110>红河学院
<120>获得的DNA序列表
<160>1
<210>1
<211>2089
<212>DNA
<213>巨魾（Bagarius yarrelli）
<220>misc_feature
<400>1
GCGGGTTTAGTTCTCAGGGTCCGTCGGTAGTTTTAAAGACGTTTAGTTAGGAAAAGTTTT 60
TATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTTCTGCAAGCATGGCTCAGGCTCGAGTCAC 120
TGATTACTTTGCACAGTCTAAGAGAGCGGGTGTTGAGCGGACTTTGCGATCCAAATCGCA 180
GAAATCGAGCGCTGAGGTCCGAGTGGTGTCCACGACCAGGCCTGAGAGGAGCAGCCGCTC 240
CACAAACAAACCGCTCCGGGCGGTGCGGGAGGACAGCGAGCGGCTCCGGGCGGTGCAGGA 300
GGAGTTCCTCAGGGTGATCGACGAGGCTGTATCCGCTCCTGATCATGCAGAAAGCGGGAC 360
AGAGACACGGGGAGTGGAAAAACCCGCTCCGCCAGAGAGTCCCCGAACCCCGAAGAGGAC 420
ATCGACTGAGGCGGAGTTTGATGTGTCCTCGGCTGTGGTTAGCTCCACCACGGAGCAGCA 480
CAGCACGGCTAAAAAACGGCTCCGGGTCGCAGCGACGAGGGACTCAAACACCGAGAAGAA 540
CACAGAGACCGGAGGGAAAAAGACTGCGAGGAAAAAACTGCTGCTGTCCAAACACGAGGA 600
CACCGAAAGGGCACCAGCTAGTACAGACATAAACCCTGTAGCCGTACATGGGTCCAAAAG 660
CTCACCTGCCAACCAACCGACCATCCCCAAGCACCAACCTGCCACCAACAAGAAAACGTT 720
CTCCAGAGAGGATGTGGCGTCGCTGAAGGCTCGGCTACAGAAGCTGAAAGGACAGGCTGA 780
AGTGGTGACCTCGCCCACCCCGGCACCCGTATCTGCTCTCGCTGAGCTCAAAGCCCGACT 840
GGACAGCGCCAGGGAGCTTGCAACTAAAGCGCAGCAGAGGAAAGAGGAGCGAGTGATCGA 900
GGAGGAGAAATGCTTTGAGGAGCAGACACAAGACCACAAAGTGACTGAGGGCGAGAAGCT 960
TCCTGCTTATCAGCGCTATCACACACTAGCTCAAGACGTTCCCCCCGGCCTCACCCTGCC 1020
CTTCAGATACAAGGTGTTAGCAGAAATGTTCCGCAGTATGGACACCATCGTCGGCATGTT 1080
ATTCAACCGCTCGGAAACCGTCACCTTCACCAAAGTCAAACAAGGAGTCCAGGACATGAT 1140
GCACAAGCGCTTCGAAGAGTCTCACATAGGGCAGATTAAGACGGTGTACCCGTCTGCCTA 1200
CACCTTAAGACAGGAGAAAAACATCCCAACCTTCAGCTCTACAGTGAAGAAATCCACTTA 1260
CCAGCTGACGGTGGAGCCGATCGTCGAAGAAGAAACGAACGGCACCCGTCCCATCCTGTC 1320
TGCCACTCGTCTGCTGGAGAGGAGGTGCCTTTTTCATCAGAACCTGGTTGAACTCGTGAA 1380
GGGACATCATAAGGTGTTCCTGGCATCATTAACCCCCCCATTAGTGGTCCCTGATGATAA 1440
ACTAACCCGCTGGCACCCCAAATTCAACGTCGATGAGGTGCCTAACATTCTGCCCAGTGA 1500
CTTGCCTCAGCCTCCACAGACGGAGAAACTCACTACAGCTCAGGAGGTGCTGGACAGAGC 1560
TCGATCCCTCATGACCCCTAAGATGGAGAAGGCTTTGGCTAACATGGCCCTTAAAACAGC 1620
AGAGGCAGCTTGTTCAAAAGAGAGCGAAACACCAGCAAAACCAACTGCCACACCCGCCCA 1680
GACACCTAGTGCCCTTAAAGGAGTGTCGCAGTCTCTTCTAGAGAGGATCCGGGCTAAAGA 1740
GGCTCAGAAGCTGCAAGCGGCCATGACGCGGAATCCTGAACAGGAGGAGCGTCTGGGCAT 1800
GATGACTCGTCTGCCAGAGATGGCCAGGATTCTGAGAAACGTCTTTGTGGCTGAGAAGAA 1860
GCCGGCCTTGATCATGGAGCTGGCCTGCAATCGCATGATCGCTAGCTATCGTTCTTCTCT 1920
CGGTGCAGGGGAAATGGAGAAACACCTGCGTCTGTTGGTGGAGTTGGCGCCGGAGTGGCT 1980
CACACTGCATCCCATCAGAAAGGATTTTTACCTCAAGCTGAACAAGAACTCAAACATCAA 2040
CTTGGTTTTGGAGAAACTGAATCAGAAGATAAAAGCGGAGGAGCGGCTC 2089
（7）利用软件（SSRHunter）找出微卫星序列，在核心序列两侧设计引物并合成（Primer Premier 5）；
（8）利用温度梯度PCR进行引物退火温度的优化：根据引物合成公司的引物合成时的温度的上下5度进行退火温度的筛选，能够扩增出引物设计时的目的片段的大小；
（9）利用4个体巨魾提取的DNA进行PCR扩增后进行非变性聚丙烯酰胺胶（PAGE）电泳，然后利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的为多态性微卫星引物。
利用筛选出来的多态性微卫星引物顺序对40条鱼的DNA进行PCR扩增→进行非变性聚丙烯酰胺胶电泳→凝胶成像分析仪进行条带分析→进行条带多态性评估→巨魾的遗传结构分析，对巨魾的遗传多样性进行评估。上述数据统计分析利用POPgene Version1.31(Yeh et al. 1999)软件计算分析多态性微卫星位点的等位基因数(Na)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、哈代-温伯格平衡(Hardy- Weinbergequilibrium，HWE)指数(D)及位点间的连锁不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)情况。
图1显示了获得的微卫星引物对巨魾鱼的非变性胶的多态性情况。
<110>红河学院
<120>获得的DNA序列表
<160>1
<210>1
<211>2089
<212>DNA
<213>巨魾（Bagarius yarrelli）
<220>misc_feature
<400>1
GCGGGTTTAGTTCTCAGGGTCCGTCGGTAGTTTTAAAGACGTTTAGTTAGGAAAAGTTTT 60
TATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTTCTGCAAGCATGGCTCAGGCTCGAGTCAC 120
TGATTACTTTGCACAGTCTAAGAGAGCGGGTGTTGAGCGGACTTTGCGATCCAAATCGCA 180
GAAATCGAGCGCTGAGGTCCGAGTGGTGTCCACGACCAGGCCTGAGAGGAGCAGCCGCTC 240
CACAAACAAACCGCTCCGGGCGGTGCGGGAGGACAGCGAGCGGCTCCGGGCGGTGCAGGA 300
GGAGTTCCTCAGGGTGATCGACGAGGCTGTATCCGCTCCTGATCATGCAGAAAGCGGGAC 360
AGAGACACGGGGAGTGGAAAAACCCGCTCCGCCAGAGAGTCCCCGAACCCCGAAGAGGAC 420
ATCGACTGAGGCGGAGTTTGATGTGTCCTCGGCTGTGGTTAGCTCCACCACGGAGCAGCA 480
CAGCACGGCTAAAAAACGGCTCCGGGTCGCAGCGACGAGGGACTCAAACACCGAGAAGAA 540
CACAGAGACCGGAGGGAAAAAGACTGCGAGGAAAAAACTGCTGCTGTCCAAACACGAGGA 600
CACCGAAAGGGCACCAGCTAGTACAGACATAAACCCTGTAGCCGTACATGGGTCCAAAAG 660
CTCACCTGCCAACCAACCGACCATCCCCAAGCACCAACCTGCCACCAACAAGAAAACGTT 720
CTCCAGAGAGGATGTGGCGTCGCTGAAGGCTCGGCTACAGAAGCTGAAAGGACAGGCTGA 780
AGTGGTGACCTCGCCCACCCCGGCACCCGTATCTGCTCTCGCTGAGCTCAAAGCCCGACT 840
GGACAGCGCCAGGGAGCTTGCAACTAAAGCGCAGCAGAGGAAAGAGGAGCGAGTGATCGA 900
GGAGGAGAAATGCTTTGAGGAGCAGACACAAGACCACAAAGTGACTGAGGGCGAGAAGCT 960
TCCTGCTTATCAGCGCTATCACACACTAGCTCAAGACGTTCCCCCCGGCCTCACCCTGCC 1020
CTTCAGATACAAGGTGTTAGCAGAAATGTTCCGCAGTATGGACACCATCGTCGGCATGTT 1080
ATTCAACCGCTCGGAAACCGTCACCTTCACCAAAGTCAAACAAGGAGTCCAGGACATGAT 1140
GCACAAGCGCTTCGAAGAGTCTCACATAGGGCAGATTAAGACGGTGTACCCGTCTGCCTA 1200
CACCTTAAGACAGGAGAAAAACATCCCAACCTTCAGCTCTACAGTGAAGAAATCCACTTA 1260
CCAGCTGACGGTGGAGCCGATCGTCGAAGAAGAAACGAACGGCACCCGTCCCATCCTGTC 1320
TGCCACTCGTCTGCTGGAGAGGAGGTGCCTTTTTCATCAGAACCTGGTTGAACTCGTGAA 1380
GGGACATCATAAGGTGTTCCTGGCATCATTAACCCCCCCATTAGTGGTCCCTGATGATAA 1440
ACTAACCCGCTGGCACCCCAAATTCAACGTCGATGAGGTGCCTAACATTCTGCCCAGTGA 1500
CTTGCCTCAGCCTCCACAGACGGAGAAACTCACTACAGCTCAGGAGGTGCTGGACAGAGC 1560
TCGATCCCTCATGACCCCTAAGATGGAGAAGGCTTTGGCTAACATGGCCCTTAAAACAGC 1620
AGAGGCAGCTTGTTCAAAAGAGAGCGAAACACCAGCAAAACCAACTGCCACACCCGCCCA 1680
GACACCTAGTGCCCTTAAAGGAGTGTCGCAGTCTCTTCTAGAGAGGATCCGGGCTAAAGA 1740
GGCTCAGAAGCTGCAAGCGGCCATGACGCGGAATCCTGAACAGGAGGAGCGTCTGGGCAT 1800
GATGACTCGTCTGCCAGAGATGGCCAGGATTCTGAGAAACGTCTTTGTGGCTGAGAAGAA 1860
GCCGGCCTTGATCATGGAGCTGGCCTGCAATCGCATGATCGCTAGCTATCGTTCTTCTCT 1920
CGGTGCAGGGGAAATGGAGAAACACCTGCGTCTGTTGGTGGAGTTGGCGCCGGAGTGGCT 1980
CACACTGCATCCCATCAGAAAGGATTTTTACCTCAAGCTGAACAAGAACTCAAACATCAA 2040
CTTGGTTTTGGAGAAACTGAATCAGAAGATAAAAGCGGAGGAGCGGCTC 2089
Claims (2)
1.一种巨魾鱼微卫星标记开发的方法，其特征在于，方法步骤如下：
（1）剪取巨魾活鱼的肌肉或者肝脏等组织各5克混合，放于干冰寄测序公司或者-80℃冰箱保存；
（2）进行总RNA提取，步骤如下：
1) 取 0.1g混合组织在液氮中充分研磨，移入1mL Trizol中，混匀后室温下静置5min，使核蛋白复合物完全解离；
2) 加入0.2mL氯仿，剧烈摇动或用旋涡震荡器混匀，4℃下12000rpm离心15min；
3) 吸取上清液；
4) 在吸取的上清液中，每1mL Trizol加入500μl的异丙醇，充分混匀后，于室温放置10min；
5)在 4℃下12000rpm离心10min，倒掉上清液；
6) 收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗涤两次，重复上述步骤5）的离心过程；
7) 用一次性吸头吸尽残存的乙醇，将打开管盖的离心管置放于实验台上，使残余的乙醇挥发掉，不要让RNA干透；
8) 加入适量RNase-Free的超纯水，将RNA沉淀充分溶解；
（3）用核算测定仪进行RNA纯度检测，以260/280比值来鉴定其质量；
（4）利用Takara M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的合成，步骤如下：
1) 取测定浓度的RNA溶液，取含有1μg RNA的溶液，加入1μl浓度为25μM的随机引物，加RNase-Free的水补充体积到6μ；
2) 混合均匀后，将混合液置于70℃加热10min；
3) 取出样品，放置在冰上2min，冷却；
4) 依次加入2μl的5×M-MLV buffer、0.5μl的浓度为10mM 的dNTP、0.25μl的浓度为40U/μl 的RNase 抑制剂、200U的M-MLV反转录酶，加水补齐到10μl，混匀；
5) 将混匀的液体置于30℃加热10min，42℃加热1h，70℃加热15min；
（5）送测序公司的测序仪进行转录组测序；
（6）序列整理，得到DNA序列表；
（7）利用软件找出微卫星序列，在核心序列两侧设计引物并合成；
（8）利用温度梯度PCR进行引物退火温度的优化：根据引物合成公司的引物合成时的温度±5℃进行退火温度的筛选，扩增出引物设计时的目的片段的大小；
（9）利用4条巨魾提取的DNA进行PCR扩增后进行非变性聚丙烯酰胺胶电泳，利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的为多态性微卫星引物。
2.如权利要求1所述一种巨魾鱼微卫星标记开发的方法的应用，其特征在于，利用筛选出来的多态性微卫星引物对待分析的鱼的DNA顺序进行PCR扩增、进行非变性聚丙烯酰胺胶电泳、凝胶成像分析仪进行条带分析、进行条带多态性评估，得到巨魾的遗传结构，对巨魾的遗传多样性进行评估。
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| CN (1) | CN104988136A (zh) |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151021 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |