CN104983758B - 一种毛诃子提取物的药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毛诃子提取物的药物用途,具体涉及毛诃子提取物和毛诃子多酚在制备治疗高尿酸血症药物中的应用。上述毛诃子提取物和毛诃子多酚具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性,可有效的降低高尿酸血症模型小鼠血液中的尿酸浓度,具有治疗高尿酸血症的作用,同时对与高尿酸血症相关的代谢性病症:痛风可起到较好的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种毛诃子提取物的药物用途,属于中药制剂领域。
背景技术
近年来,随着人们生活水平的提高,饮食结构发生变化,糖、脂肪、蛋白质的摄入量明显增加,高尿酸血症和痛风的发病率日益增高,己成为一种常见病。
一般认为血尿酸416μmol/L时为高尿酸血症,约5%-l2%高尿酸血症患者会发展成为痛风。临床特点是:痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、特征性慢性关节炎和关节畸形,常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和肾尿酸结石形成。痛风的急性发作是尿酸钠(monosodium urate crystal,MSU)在关节及关节周围组织以结晶形式沉积引起的急性炎症反应。痛风不仅可以侵犯骨和关节,而且还容易累及肾脏和心血管***。高尿酸血症及原发性痛风与肥胖症、高脂血症、高血压病、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病呈显著正相关。因此,高尿酸血症是危害人类健康的一种严重的代谢性疾病。
目前,对血中尿酸的控制是通过两种途径实现的:一是抑制尿酸的生成。尿酸是由次黄嘌呤和黄嘌呤经黄嘌呤氧化酶的作用而生成的,黄嘌呤氧化酶是次黄嘌呤转化为黄嘌呤和黄嘌呤转化为尿酸所必需的酶,治疗痛风的一条有效途径是抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)活性,从而抑制尿酸的形成。抑制尿酸生成的药物如别嘌呤醇,非布索坦。二是促进尿酸的***,促进尿酸***的药物如丙磺舒、苯溴马龙等。但上述药物毒副作用大,例如别嘌呤醇可引发***反应(发生率10-15%)、超敏综合症(27.5%斑丘疹患者死亡)、骨髓抑制等严重毒副作用;丙磺舒、苯溴马隆具有胃肠道反应、肾绞痛及激发痛风急性发作等副作用,在一定程度上限制了这些药物的临床应用。因此,寻找新型的高效低毒的抗痛风和高尿酸血症药物依然是目前药学研究的一个热点。
毛诃子,为使君子科植物毗黎勒(Terminalia bellirica(Gaertn.)Roxb.)的干燥成熟果实,为藏族***,清热解毒,收敛养血,调和诸药,用于各种热症,泻痢,黄水病,肝胆病,病后虚弱。在现代医学对毛诃子的实验研究中,张吉仲(藏药毛诃子,诃子和毛诃子对实验动物脏腑cAMP,cGMP含量的影响[J].云南中医中药杂志,2009,30(6):53-55.)采用放射免疫法,测定毛诃子对小鼠脏腑cAMP、cGMP含量的印象,结果发现,毛诃子对胃和膀胱中cAMP/cGMP值有显著差异,表明可能其通过调整cAMP/cGMP比例而起到防治疾病的作用。Anwarul Hassan Gilani(Gilani A H,Khan A,AliT,et al.Mechanisms underlying the antispasmodic and bronchodilatoryproperties of Terminalia bellerica fruit[J].Journal of ethnopharmacology,2008,116(3):528-538.)展开了毛诃子粗提取物的体外实验及体内实验,研究毛诃子在肠胃亢进及呼吸***疾病方面的药理学原理,其结果显示,毛诃子具有抗胆碱能和Ca2+拮抗剂的双重作用,从而解释了其在绞痛,腹泻和哮喘方面的民俗用法。
中国专利文献CN 1410107A公开了一种夏塔热片口服药,该药是由地锦草、诃子肉、毛诃子肉、司卡摩尼亚酯、芦荟、西青果药材组成,在临床应用多年,对治疗银屑病等皮肤病疗效良好。中国专利文献CN102441081A公开了一种治疗痛风病的药物,其为一种藏药,又称十四味痛风定,其中活性组分组成为宽筋藤、诃子、藏菖蒲、决明子、赛北紫堇、毛诃子、乳香、黄葵子、安息香、儿茶、岩精膏、余甘子、木香、红铜灰按一定重量配比制备而成,具有祛风,除湿,消炎止痛,干黄水的功能,用于关节炎,类风湿性关节炎,痛风,痹病引起的四肢关节肿大疼痛,变形,四肢僵硬,黄水积聚等。包含有毛诃子的组合物在国内应用较多,但是并未对毛诃子本身含有的成分以及作用做进一步的研究。
发明内容
为此,为了解决现有技术中毛诃子本身含有成分以及作用不清楚,提供一种毛诃子提取物的药物用途。
本发明提供了毛诃子提取物在制备治疗高尿酸血症药物中的应用。
本发明还提供了毛诃子提取物在制备治疗由于高尿酸血症而导致的急性痛风、慢性痛风、痛风关节炎、痛风发作、尿酸性肾石病和痛风性肾病药物中的应用。
上述应用中,所述毛诃子提取物由以下方法制备得到:将毛诃子在20-80℃下浸泡于溶剂中,过滤,得到毛诃子提取液,浓缩,得毛诃子提取物,所述溶剂为水、甲醇、乙醇中的一种或多种的混合液。
上述应用中,毛诃子提取物的制备方法还包括将毛诃子提取物进一步精制提纯,所述精制提纯为大孔吸附树脂层析。
上述方法中,所述大孔吸附树脂层析包括以下步骤:取大孔吸附树脂进行层析,依次用水、25v%-50v%的乙醇溶液洗脱,再用65v%-95v%的乙醇溶液洗脱,洗脱结束后,将水洗脱液浓缩至干,即得到精制的毛诃子提取物。
所述毛诃子提取物中毛诃子总多酚含量为10%-80%。
本发明还提供了毛诃子总多酚在制备治疗高尿酸血症药物中的应用。
本发明也提供了毛诃子总多酚在制备治疗由于高尿酸血症而导致的急性痛风、慢性痛风、痛风关节炎、痛风发作、尿酸性肾石病和痛风性肾病药物中的应用。
本发明还提供了一种用于治疗高尿酸血症的药物,所述药物以毛诃子总多酚为活性成分,向含有毛诃子总多酚的毛诃子提取物中加入常规辅料按照常规工艺制成临床上可接受的胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膏剂、合剂、混悬剂。
本发明还提供了上述药物在制备治疗高尿酸血症的药物中的用途。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明的制备的毛诃子提取物和毛诃子总多酚具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性,在高尿酸血症模型动物实验中体现出较好的治疗效果,有助于高尿酸血症以及高尿酸血症并发症的治疗和预防。
具体实施方式
下面将通过具体实例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
毛诃子采购自亳州药材市场
实施例1毛诃子提取物的制备
取2kg毛诃子,粉碎后,用16L的70v%乙醇室温浸泡7天后,滤出提取液,向滤渣中再加入12L的70v%乙醇,浸泡5天,过滤,合并两次提取液,得到毛诃子提取液,真空浓缩至干,得到679g毛诃子粗提取物(编号为TB-1),得率为33.9%。
实施例2毛诃子提取物的制备
取2000g毛诃子,粉碎后,用16L的水在80℃下提取50min,滤出提取液,向滤渣中再加入12L的水,在80℃下提取30min,过滤,合并两次提取液,得到毛诃子提取液,真空浓缩至干,得到830g毛诃子粗提取物(编号为TB-2),得率为41.5%。
实施例3毛诃子提取物的制备
取2000g毛诃子,粉碎后用16L的80v%甲醇在60℃下提取60min,滤出提取液,向滤渣中再加入12L的水,在60℃下提取40min,过滤,合并两次提取液,得到毛诃子提取液,真空浓缩至干,得到597g毛诃子粗提取物(编号为TB-3),得率为29.8%。
实施例4毛诃子提取物的精制提纯
取实施例1中毛诃子粗提取物(编号为TB-1)200g为提纯原料,用D101型大孔吸附树脂进行层析。提取物的质量与树脂的质量比为1:20。依次用水、50v%乙醇,95v%乙醇进行梯度洗脱,每个梯度洗脱5倍的柱体积,流速为2倍柱体积/小时。洗脱结束后,将水洗脱液、50v%乙醇洗脱液、95v%乙醇洗脱液浓缩至干,即得到精制的毛诃子提取物。
取实施例2中毛诃子粗提取物(编号为TB-2)200g为提纯原料,用Diaion-HP20型大孔吸附树脂进行层析。提取物的质量与树脂的质量比为1:20。依次用水、25v%乙醇,65v%乙醇进行梯度洗脱,每个梯度洗脱5倍的柱体积,流速为2倍柱体积/小时。洗脱结束后,将水洗脱液、25v%乙醇洗脱液、65v%乙醇洗脱液浓缩至干,即得到精制的毛诃子提取物。
本发明所述实施例中,D101型大孔吸附树脂购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司,Diaion-HP20型大孔吸附树脂购自日本三菱化学株式会社。D101大孔吸附树脂和DiaionHP-20是一种聚苯乙烯型树脂,同样类型其它厂家的树脂,比如AB-8,HPD-200,XAD-1600等树脂也会有类似的效果,并无差异。各精制提取物得率及编号如表1所示。
表1毛诃子精制提纯实验结果
实施例5含有毛诃子提取物的胶囊剂
本实施例的胶囊剂包括以下成分:
其制备方法包括以下步骤:
称取上述处方量的毛诃子提取物和各药用辅料,混合均匀,过60目筛三次,装入胶囊即得。
实施例6含有毛诃子提取物的片剂
本实施例的片剂包括以下成分:
其制备方法包括以下步骤:
称取上述处方量的精制毛诃子提取物、淀粉和L-HPC混合均匀,过60目筛三次,再向其中加入适量的10%淀粉浆制软材,再制粒,干燥,整粒后,加入微粉硅胶、硬脂酸镁、乳糖混合均匀,压片,包薄膜衣即得。
实施例7含有毛诃子提取物的丸剂
本实施例的丸剂包括以下成分:
实施例3中编号为TB-3的毛诃子提取物、葡萄糖液、乙醇。
其制备方法包括以下步骤:
称取上述毛诃子提取物、以适量水,葡萄糖液以及乙醇作为赋型剂,采用泛制法制作水丸,即得。
需要说明的是,实施例5-7中所用的常规辅料包括但不限于填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、矫味剂、助悬剂、防腐剂中的一种或几种的混合物。
具体而言,所述填充剂还可替换为预胶化淀粉、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖中的一种或多种的混合物;
所述崩解剂还可替换为淀粉、交联聚维酮、羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠中的一种或多种的混合物;
所述润滑剂还可替换为滑石粉、二氧化硅、十二烷基硫酸钠中的一种或多种的混合物;
所述助悬剂还可替换为聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素中的一种或多种的混合物;
所述防腐剂还可替换为尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸盐中的一种或多种的混合物;
所述粘合剂还可替换为聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素中的一种或多种的混合物;
所述矫味剂还可替换为甜味剂和/或香精;所述甜味剂为糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素中的一种或多种的混合物;
当然,所述常规辅料包括但不限于上述列举的范围,本领域技术人员可根据实际情况做适应性的选择及调整。
实施例8
为验证本发明的技术效果进行了以下实验:
毛诃子提取物的总多酚的测定
本实验例中,毛诃子提取物(TB-1、TB-2、TB-3、TB-1W、TB-15、TB-19、TB-2W、TB-23、TB-27)中的总多酚的测定参考国标GBT 8313-2008茶叶中茶多酚含量的检测方法,用福林酚试剂检测多酚含量。
具体包括以下步骤:
1、10v%的福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂的配制:将20ml福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂转移到200ml容量瓶中,用水定容并摇匀。
2、7.5w%的Na2CO3溶液的配制:称取37.50g的Na2CO3,加适量水溶解,转移至500ml容量瓶中,用水定容并摇匀。
3、没食子酸标准储备溶液(1000μg/ml)的配制:称取0.100g的没食子酸,于100ml容量瓶中溶解并定容至刻度,摇匀。
4、没食子酸工作液的配制:用移液管分别移取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml的没食子酸标准储备液,置于100ml容量瓶中,分别用水定容至刻度,摇匀,即得浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml的没食子酸工作液。
5、没食子酸标准曲线的制作:用移液管分别移取没食子酸工作液1.0ml于刻度管内,在每个试管内分别加入5.0ml福林酚(Folin-Ciocalteu),摇匀。反应3-8分钟内,加入4.0ml的Na2CO3溶液,加水定容至刻度,摇匀。室温下放置60分钟,用10mm的比色皿,在765nm波长条件下用分光光度计测定吸光度,根据没食子酸工作液浓度和相对应吸光度,制作标准曲线。
6、取毛诃子提取物(TB-1、TB-2、TB-3、TB-1W、TB-15、TB-19、TB-2W、TB-23、TB-27)分别配成0.2mg/ml的样品溶液。取样品溶液1mL,按照步骤5中的制作方法,测定其吸光度,每个样品做三个平行实验,取平均值,计算样品中的多酚含量。
表2毛诃子提取物的总多酚含量
由表2可以看出,毛诃子提取物经过两种不同富集工艺之后,总多酚含量均有非常大的提高,其中两种树脂洗脱工艺中,水洗脱部位的总多酚含量最高。
实施例9毛诃子提取物体外对黄嘌呤氧化酶的影响
本实施例验证毛诃子提取物(TB-1、TB-2、TB-3、TB-1W、TB-15、TB-19、TB-2W、TB-23、TB-27)体外对黄嘌呤氧化酶的影响。
(1)实验步骤
1、磷酸盐缓冲溶液的配制:称取19.48g的K2HPO4·3H2O和1.99g的KH2PO4溶于500mL蒸馏水中,配成浓度为0.2mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.5);
2、黄嘌呤底物溶液的配制:称取黄嘌呤15.2mg,溶解于250mL蒸馏水中,配成浓度为0.4mmol/L的黄嘌呤底物溶液;
3、黄嘌呤氧化酶溶液的配制:取黄嘌呤氧化酶5U,用上述磷酸盐缓冲溶液稀释至160mL,配成浓度为80U/L的黄嘌呤氧化酶溶液,4℃保存;
4、样品和阳性对照溶液的配制:精密称取样品组毛诃子提取物(TB-1、TB-2、TB-3、TB-1W、TB-15、TB-19、TB-2W、TB-23、TB-27)、别嘌呤醇(作为阳性对照),分别用二甲亚砜溶解、蒸馏水稀释,配成浓度为0.05mg/mL的溶液进行测试(其中二甲亚砜的最终浓度小于1%)。
5、抑制作用测试:
样品组测试:在2mL离心管中依次加入黄嘌呤底物溶液200μL、样品溶液100μL和黄嘌呤氧化酶溶液200μL,涡旋震荡5秒后置于25℃水浴锅中反应5分钟,反应完毕后加入1.5mL无水乙醇,涡旋震荡5秒终止反应。反应液经3500rpm离心5分钟,吸取200μL到1.5mL离心管中,用生化分析仪分别检测每个样品的UA值,每个样品平行操作三次取平均值。
空白对照组测试:在2mL离心管中依次加入黄嘌呤底物溶液200μL、磷酸盐缓冲溶液100μL和黄嘌呤氧化酶溶液200μL,同法检测空白对照组的UA值,平行操作三次取平均值。
阳性对照组测试:在2mL离心管中依次加入黄嘌呤底物溶液200μL、阳性对照溶液100μL和黄嘌呤氧化酶溶液200μL,同法检测阳性对照组的UA值,平行操作三次取平均值。
(2)测试结果
根据黄嘌呤氧化酶抑制率=[(空白对照组UA值-样品组UA值)/空白对照组UA值]*100,计算抑制率,结果如表3所示。
表3毛诃子提取物抑制黄嘌呤氧化酶的活性
从表3可以看出,毛诃子提取物(TB-1、TB-2、TB-3、TB-1W、TB-15、TB-19、TB-2W、TB-23、TB-27)对黄嘌呤氧化酶都有不同程度的抑制作用。其中总多酚含量高(TB-1W、TB-2W)的毛诃子提取物抑制作用强,验证了毛诃子提取物中的毛诃子多酚可能为抑制高尿酸血症的关键活性部位。
实施例10毛诃子提取物对高尿酸血症小鼠的影响实验
本实验为通过动物实验验证毛诃子提取物对高尿酸血症小鼠的影响。
(1)实验方法
取健康雄性KM小鼠130只,体重为15-18g,由上海灵畅生物科技有限公司提供;按每笼5只进行分笼处理后,在公司的屏障***内适应性饲养4天,从130只小鼠中选取体重集中的120只小鼠按体重随机平均分为12组,每组10只,分别为空白对照组,高尿酸血症模型组,阳性对照组,受试样品组,其中受试样品组共9组,分别为编号TB-1、TB-2、TB-3、TB-1W、TB-15、TB-19、TB-2W、TB-23、TB-27的毛诃子提取物。
高尿酸血症的造模:
适应期过后随即对小鼠进行灌胃给药,每天上午灌胃1次,其中受试样品组,样品用纯水进行混悬,按照30mg/kg进行灌胃;阳性对照组非布索坦用纯水进行混悬,按照1mg/kg进行灌胃;空白对照组和高尿酸血症模型组均用纯水灌胃进行对照,连续灌胃7天;
在第7天上午灌胃0.5小时后对小鼠进行腹腔注射造模,其中空白对照组腹腔注射0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液;高尿酸血症模型组、阳性对照组和受试样品组注射氧嗪酸钾(OA),用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液进行溶解,注射量均为300mg/kg体重;
腹腔注射1.5小时后摘除小鼠的眼球进行采血,采血容量不低于0.5mL,血样采集后于室温放置约1小时,待血液完全凝固后于3500rpm/4℃条件下离心10分钟,取血清在同等条件下复离5分钟,而后取0.2mL血清使用生化分析仪检测尿酸值(UA);
用Excel和SPSS对数据进行统计分析,计算平均数和标准差(SD),经单因素方差分析后比较各实验组的组间差异,与空白对照组相比,高尿酸血症模型组、阳性对照组和受试样品组小鼠的血清尿酸水平显著提高,有显著性差异,表明造模成功。
(2)实验结果
表4毛诃子提取物对高尿酸血症模型小鼠血清尿酸含量的影响
(###表示和空白对照组相比P<0.001;*:与模型组比,P<0.05;**表示和模型组相比P<0.01;***表示和模型组相比P<0.001)(t-test检验)
从表4看出,受试样品组与高尿酸血症模型组相比,毛诃子各粗提物具有一定的降尿酸效果,使用的三种不同溶剂提取物没有显著性差异。精制毛诃子提取物中,两种不同树脂的水洗脱部位都具有非常显著的降低尿酸的效果,其效果由于其他不同乙醇浓度洗脱部位。上述结果可以证明,毛诃子提取物具有降低尿酸的作用,而毛诃子总多酚富集的毛诃子提取物具有更为显著的降低尿酸的作用。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (2)
1.毛诃子提取物作为活性成分在制备治疗高尿酸血症药物中的应用,其特征在于,所述毛诃子提取物通过以下方法制备而成:取2kg毛诃子,粉碎后,用16L的70%(v/v)乙醇室温浸泡7天后,滤出提取液,向滤渣中再加入12L的70%(v/v)乙醇,浸泡5天,过滤,合并两次提取液,得到毛诃子提取液,真空浓缩至干,得到679g毛诃子粗提取物,得率为33.9%;取毛诃子粗提取物200g为提纯原料,用D101型大孔吸附树脂进行层析;提纯原料与树脂的质量比为1:20;依次用水、50%(v/v)乙醇,95%(v/v)乙醇进行梯度洗脱,每个梯度洗脱5倍的柱体积,流速为2倍柱体积/小时;洗脱结束后,将水洗脱液、50%(v/v)乙醇洗脱液、95%(v/v)乙醇洗脱液浓缩至干,即得到精制的毛诃子提取物。
2.毛诃子提取物作为活性成分在制备治疗高尿酸血症药物中的应用,其特征在于,所述毛诃子提取物通过以下方法制备而成:取2000g毛诃子,粉碎后,用16L的水在80℃下提取50min,滤出提取液,向滤渣中再加入12L的水,在80℃下提取30min,过滤,合并两次提取液,得到毛诃子提取液,真空浓缩至干,得到830g毛诃子粗提取物,得率为41.5%;取毛诃子粗提取物200g为提纯原料,用Diaion-HP20型大孔吸附树脂进行层析;提纯原料与树脂的质量比为1:20;依次用水、25%(v/v)乙醇,65%(v/v)乙醇进行梯度洗脱,每个梯度洗脱5倍的柱体积,流速为2倍柱体积/小时;洗脱结束后,将水洗脱液、25%(v/v)乙醇洗脱液、65%(v/v)乙醇洗脱液浓缩至干,即得到精制的毛诃子提取物。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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