CN104983591A

CN104983591A - 一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体及其制备方法

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Publication number: CN104983591A
Application number: CN201510401943.XA
Authority: CN
Inventors: 王静; 李�荣; 马双; 赵文静
Original assignee: Xi'an Aierfei Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Xi'an Aierfei Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2015-07-09
Filing date: 2015-07-09
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2035-07-09
Also published as: CN104983591B

Abstract

本发明公开了一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体，由以下组分组成：蛋黄卵磷脂、双十六烷基磷酸、甘露醇、蔗糖、β-胡萝卜素、胆固醇、吐温-80、V_E、V_C为、壳聚糖和透明质酸钠。本发明还公开了该脂质体的制备方法：制备β-胡萝卜素脂质体混悬液，将混悬液滴加到壳聚糖溶液中，离心处理得沉淀物，并用蒸馏水将沉淀溶解后滴加到透明质酸溶液中，得透明质酸-壳聚糖-脂质体混悬液，将混悬液进行冷冻干燥处理后即得脂质体粉末。本发明采用有效超声震荡处理，过膜整粒使透明质酸-壳聚糖-脂质体的粒径大小均匀，分散性好，不易堵塞皮肤的毛孔；层层包覆释药时间长，可以长时间防晒；利用冻干工艺使脂质体以粉末状存在，有利于长期保存，且存贮、使用方便。

Description

一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于化妆品生产技术领域，具体涉及一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体；本发明还涉及该双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法。

背景技术

脂质体是由脂质双分子层组成，其内部为水相的闭合囊泡结构，由于其独特的结构和性能，脂质体已被广泛应用与食品、医药以及化妆品领域。

β-胡萝卜素具有多个双键，在光、热、氧气及活泼性较强的自由基离子存在的条件下易氧化，从而有效地预防DNA和脂蛋白的氧化损伤，维持细胞功能，延缓机体衰老，是一个公认的天然抗氧化剂；将其添加到化妆品中，能赋予化妆品吸收紫外线和美白皮肤的双重功效；然而β-胡萝卜素在水、丙二醇、甘油、甲醇和乙醇等化妆品常用溶剂中不溶或难以溶解，大大地限制了其在化妆品领域的使用。利用可溶性微球将β-胡萝卜素包覆起来制成β-胡萝卜素脂质体，并将其添加到化妆品中，解决了β-胡萝卜素不溶或难溶的问题。但脂质体对酸、热等敏感，在贮藏期间易聚集溶合、絮凝，导致芯材泄漏，使用过程中释药太快，容易产生突释，不易控制等缺点。所以需要用大分子材料壳聚糖和透明质酸进行修饰，通过层层包覆技术可以改善脂质体对酸、热等敏感性，提高稳定性，控制释药速度，使β-胡萝卜素不易渗漏。

透明质酸HA作为天然保湿剂已被广泛用于化妆品的生产中，与传统保湿剂相比，具有更高的保湿效果，且无油腻感和阻塞皮肤毛孔等缺点。透明质酸钠是透明质酸(HA)的钠盐形式，是一种高分子量的直链多糖，广泛分布于动物和人体***细胞外基质中，它在溶液中的无规则卷曲状态和它的流体动力学特点赋予其重要的物理特性，即高度粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，是一种用途广泛的生物可吸收材料，因此将其包裹在在β-胡萝卜素脂质体的最外层，在化妆品中作为保湿因子发挥独特的作用。而且目前市面上销售的防晒霜和防晒露的最长防晒时间为4h，防晒时间太短，将β-胡萝卜素层层包裹起来可以控制其缓释速度，延长有效防晒时间至8h,而且通过层层包裹降低了防晒物质与皮肤的接触，减小了其对皮肤的刺激作用，能更好的保护皮肤。

因此，如何将β-胡萝卜素制成β-胡萝卜素脂质体，并对β-胡萝卜素脂质体进行层层包覆，是亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体，解决了β-胡萝卜素脂质体添加到化妆品中时，会引起释药太快、容易产生突释且不易控制以及化妆品稳定性差的问题。

本发明的另一目的在于提供该双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法，制备工艺简单，容易实现。

本发明所采用的技术方案是，一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体，按质量百分比由以下组分组成：蛋黄卵磷脂15％～30％，双十六烷基磷酸1％～3％，保护剂30％～60％，β-胡萝卜素晶体0.1％～1％，胆固醇5％～9％，吐温-8010％～20％，V_E0.5％～1％，V_C0.5％～1％，壳聚糖1％～3％，透明质酸钠1％～3％，以上组分质量百分比之和为100％。

本发明的特征还在于，

蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量大于90％，保护剂为蔗糖和甘露醇的混合物，其中，蔗糖与甘露醇的质量比为6:4；透明质酸的分子量为10-100万。

脂质体为冻干粉末，平均粒径为240.45±0.28nm，体外细胞释药时间为8～10h。

本发明所采用的另一技术方案是，一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法，具体步骤如下：

步骤1，分别称取蛋黄卵磷脂15％～30％，双十六烷基磷酸1％～3％，保护剂30％～60％，β-胡萝卜素晶体0.1％～1％，胆固醇为5％～9％，吐温-8010％～20％，V_E0.5％～1％，V_C0.5％～1％，壳聚糖1％～3％，透明质酸钠1％～3％，以上组分质量百分比之和为100％；

步骤2，取步骤1称量的蛋黄卵磷脂、β-胡萝卜素晶体、胆固醇、吐温-80，双十六烷基磷酸、V_E及V_C溶解于有机溶剂中，常温磁力搅拌到各药品完全溶解，将完全溶解后溶液倒入圆底烧瓶在温度为40℃、压力为0.008Mpa条件下在旋转蒸发器中旋转蒸发后，得脂质体薄膜；

步骤3，将步骤1称取的保护剂溶解于浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液中，搅拌至完全溶解；将含保护剂的Tris缓冲液加入到步骤2所得脂质体薄膜中进行洗膜，得粗脂质体混悬液，将所得混悬液在45℃～55℃水浴磁力搅拌40min～60min，然后冰水浴有效超声震荡处理15min～20min后，得β-胡萝卜素脂质体混悬液；

步骤4，将步骤1称取的低分子量壳聚糖溶解在浓度为4％的柠檬酸溶液中，静置8～16h，使其充分溶解后，得浓度为0.685mg/mL～2.055mg/mL的壳聚糖溶液，备用；

步骤5，取步骤3所得β-胡萝卜素脂质体以0.1mL/s的速度滴加到步骤4所得壳聚糖溶液中，在500rmp速度下搅拌40min～60min，使其混合均匀后，将混合物在冰浴中有效超声震荡10min～15min，放置在3～4℃环境中8～16h，然后将其在15000rpm的转速下离心处理30min，最后将离心处理后的沉淀物用蒸馏水溶解，得壳聚糖-包脂质体溶液；

步骤6，将步骤1称取的透明质酸钠溶解在双蒸水中，静置8～16h，使其充分溶解，得浓度为0.685mg/mL～2.055mg/mL的透明质酸溶液；

步骤7，将步骤5所得壳聚糖-包脂质体溶液以0.1mL/s的速度滴加到步骤6所得透明质酸溶液中，滴加完后继续搅拌40min～60min，冰浴有效超声震荡10min～15min，得透明质酸-壳聚糖-脂质体混悬液，然后依次过0.45μm微滤膜和0.22μm微滤膜进行整粒；

步骤8，将步骤7过滤得到的透明质酸-壳聚糖-脂质体混悬液在-60±1℃和10±1℃环境条件下反复冻溶两到三次，分装入西林瓶中在-60±1℃环境条件下预冻30h后，再在-52±2℃、真空度小于100mT的环境条件下冷冻干燥25h～30h，即得脂质体冻干粉。

本发明的特征还在于，

步骤1中，蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量大于90％，蛋黄卵磷脂与双十六烷基磷酸的用量比为10:1；胆固醇与双十六烷基磷酸的用量比为2.5:1；保护剂与蛋黄卵磷脂的用量比为2:1；保护剂为蔗糖和甘露醇的混合物，其中，蔗糖与甘露醇的质量比为6:4；透明质酸的分子量为10-100万。

步骤2中，有机溶剂为无水乙醇与氯仿的混合物，其中无水乙醇与氯仿的体积比为1:2。

步骤4中，壳聚糖为低分子量壳聚糖，其分子量为5万～19万。

步骤5中，β-胡萝卜素脂质体混悬液与壳聚糖溶液的体积比为1:1。

步骤7中，透明质酸溶液与壳聚糖-包脂质体混悬液的体积比为1:1。

本发明的有益效果是，利用有效超声震荡和过滤膜整粒处理，使透明质酸-壳聚糖-脂质体的粒径大小均匀，分散性好，不易堵塞皮肤的毛孔；层层包覆释药时间长，可以长时间防晒，而且包裹后降低了防晒成分与皮肤的接触浓度，减少了其对皮肤的刺激作用；采用冻干工艺使脂质体以粉末状存在，有利于长期保存，且存贮、使用方便。

附图说明

图1是本发明双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备工艺流程图；

图2是本发明实施例1所得脂质体的粒径分布图；

图3是本发明对比例所得脂质体的粒径分布图；

图4是本发明实施例1和对比例所得脂质体体细胞缓释图；

图5是利用本发明实施例1所得脂质体制备的防晒霜SPF值表征图；

图6是利用本发明实施例1所得脂质体制备的防晒霜的紫外透过率变化曲线图。

具体实施方式

下而结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1

步骤1，分别称取2.400g蛋黄卵磷脂、0.240g双十六烷基磷酸、0.047gβ-胡萝卜素晶体、0.600g胆固醇、1.471g吐温-80、0.075gV_E及0.075gV_C溶解于30mL无水乙醇与氯仿的混合物中，混合物中无水乙醇与氯仿的体积比为1:2，常温磁力搅拌到各药品完全溶解，将完全溶解后溶液倒入圆底烧瓶在温度为40℃、压力为0.008Mpa条件下在旋转蒸发器中旋转蒸发后，得脂质体薄膜；

步骤2，称取1.920g甘露醇和2.880g蔗糖溶解于150mL浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液中，搅拌至完全溶解，得含保护剂的Tris缓冲液；将含保护剂的Tris缓冲液加入到步骤1所得脂质体薄膜中洗膜，得粗脂质体混悬液，将所得混悬液在55℃水浴磁力搅拌55min，然后有效超声震荡处理15min(每次有效超声5min，间隔5min)后，得β-胡萝卜素脂质体混悬液；

步骤3，取0.146g低分子量壳聚糖将其溶解在146mL浓度为4％(w/v)的柠檬酸溶液中，静置12h，使其充分溶解后得浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液；取100mL步骤2制得的β-胡萝卜素脂质体混悬液以0.1mL/s的速度滴加到100mL上述壳聚糖溶液中，在500rmp速度下搅拌55min，使其混合均匀后，将混合物在冰浴中有效超声震荡15min(每次超声5min，间隔5min)，密封放置在4℃环境中16h，然后将其在15000rpm的转速下离心处理30min，最后将离心处理后的沉淀物用100mL蒸馏水溶解，得壳聚糖-包脂质体溶液；

步骤4，将0.146g透明质酸钠溶,解在146mL双蒸水中，静置8h，使其充分溶解，得浓度为1mg/mL的透明质酸溶液；取100mL步骤3制得的壳聚糖-包脂质体溶液以0.1mL/s的速度滴加到100mL透明质酸溶液中，滴加完后继续搅拌55min，冰浴有效超声震荡15min(每次超声5min，间隔5min)，得透明质酸-壳聚糖-脂质体混悬液，然后依次过0.45μm微滤膜和0.22μm微滤膜进行整粒；将过滤得到的透明质酸-壳聚糖-脂质体混悬液在-60±1℃和10±1℃环境条件下反复冻溶两次，分装入西林瓶中在-60±1℃环境条件下预冻30h后，再在-52±2℃、真空度小于100mT的环境条件下冷冻干燥25h，即得脂质体冻干粉。

实施例2

步骤1分别称取2.200g蛋黄卵磷脂、0.220g双十六烷基磷酸、0.100gβ-胡萝卜素晶体、0.550g胆固醇、1.730g吐温-80、0.100gV_E及0.100gV_c溶解于30mL无水乙醇与氯仿的混合物中，混合物中无水乙醇与氯仿的体积比为1:2，常温磁力搅拌到各药品完全溶解。将完全溶解后溶液倒入圆底烧瓶在温度为40℃、压力为0.008Mpa条件下在旋转蒸发器中旋转蒸发后，得脂质体薄膜；

步骤2，称取1.760g甘露醇和2.640g蔗糖溶解于150mL浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液中，搅拌至完全溶解，得含保护剂的Tris缓冲液；将含保护剂的Tris缓冲液加入到上步旋转蒸发制得的脂质体薄膜中洗膜，得粗脂质体混悬液，将所得混悬液在45℃水浴磁力搅拌60min，然后在冰水浴有效超声震荡处理15min(每次超声5min，间隔5min)后，得β-胡萝卜素脂质体混悬液；

步骤3，取0.300g低分子量壳聚糖将其溶解在146mL浓度为4％(w/v)的柠檬酸溶液中，静置8h，使其充分溶解后，得浓度为2.055mg/mL的壳聚糖溶液；取100mL步骤2制得的β-胡萝卜素脂质体混悬液以0.1mL/s的速度滴加到100mL壳聚糖溶液中，在500rmp速度下搅拌60min，使其混合均匀后，将混合物在冰浴中有效超声震荡15min(每次超声5min，间隔5min)，密封放置在4℃环境中16h，然后将其在15000rpm的转速下离心处理30min，最后将离心处理后的沉淀物用100mL蒸馏水溶解，得壳聚糖-包脂质体溶液；

步骤4，将0.300g透明质酸钠溶解在146mL双蒸水中，静置12h，使其充分溶解，得浓度为2.055mg/mL的透明质酸溶液；取100mL步骤3制得的壳聚糖-包脂质体溶液以0.1mL/s的速度滴加到100mL透明质酸溶液中，滴加完后继续搅拌60min，冰浴有效超声震荡10min(超声5min，间隔5min)，得透明质酸-壳聚糖-脂质体混悬液，然后依次过0.45μm微滤膜和0.22μm微滤膜进行整粒；将过滤得到的混悬液在-60±1℃和10±1℃环境条件下反复冻溶三次后，分装入西林瓶中在-60±1℃环境条件下预冻30h后，再在-52±2℃、真空度小于100mT的环境条件下冷冻干燥30h，即得脂质体冻干粉。

实施例3

步骤1分别称取2.600g蛋黄卵磷脂、0.260g双十六烷基磷酸、0.030gβ-胡萝卜素晶体、0.650g胆固醇、1.000g吐温-80、0.030gV_E及0.030gV_c溶解于30mL无水乙醇与氯仿的混合物中，混合物中无水乙醇与氯仿的体积比为1:2，常温磁力搅拌到各药品完全溶解。将完全溶解后溶液倒入圆底烧瓶在温度为40℃、压力为0.008Mpa条件下在旋转蒸发器中旋转蒸发后，得脂质体薄膜；

步骤2，称取2.080g甘露醇和3.120g蔗糖溶解于浓度为150mL浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液中，搅拌至完全溶解，得含保护剂的Tris缓冲液；将含保护剂的Tris缓冲液加入到上步旋转蒸发制得的脂质体薄膜中洗膜，得粗脂质体混悬液，将所得混悬液在50℃水浴磁力搅拌40min，然后有效超声震荡处理15min(每次超声5min，间隔5min)后，得β-胡萝卜素脂质体混悬液；

步骤3，取0.100g低分子量壳聚糖将其溶解在146mL浓度为4％(w/v)的柠檬酸溶液中，静置16h，使其充分溶解后，得浓度为0.685mg/mL的壳聚糖溶液；取100mL步骤2制得的β-胡萝卜素脂质体混悬液以0.1mL/s的速度滴加到100mL壳聚糖溶液中，在500rmp速度下搅拌1h，使其混合均匀后，将混合物在冰浴中有效超声震荡15min(每次超声5min，间隔5min)，放置在4℃环境中16h，然后将其在15000rpm的转速下离心处理30min，最后将离心处理后的沉淀物用蒸馏水溶解，得壳聚糖-包脂质体溶液；

步骤4，将0.100g透明质酸钠溶解在146mL双蒸水中，静置16h，使其充分溶解，得浓度为0.685mg/mL的透明质酸溶液；取100mL步骤3制得的壳聚糖-包脂质体溶液以0.1mL/s的速度滴加到100mL透明质酸溶液中，滴加完后继续搅拌60min，冰浴有效超声震荡10min(每次超声5min，间隔5min)，得透明质酸-壳聚糖-脂质体混悬液，然后依次过0.45μm微滤膜和0.22μm微滤膜进行整粒；将过滤得到的混悬液在-60±1℃和10±1℃环境条件下反复冻溶三次后，分装入西林瓶中在-60±1℃环境条件下预冻30h后，再在-52±2℃、真空度小于100mT的环境条件下冷冻干燥30h，即得纳米脂质体粉末。

对比例

步骤3，取0.146g低分子量壳聚糖将其溶解在146mL浓度为4％(w/v)的柠檬酸溶液中，静置12h，使其充分溶解后得浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液；取100mL步骤2制得的β-胡萝卜素脂质体混悬液以0.1mL/s的速度滴加到100mL上述壳聚糖溶液中，在500rmp速度下搅拌55min，使其混合均匀后，将混合物在冰浴中有效超声震荡15min(每次超声5min，间隔5min)，密封放置在4℃环境中16h，然后将其在15000rpm的转速下离心处理30min，最后将离心处理后的沉淀物用100mL蒸馏水溶解，得壳聚糖-包脂质体溶液。

图1为本发明双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备流程图，本发明双重修饰β-胡萝卜素脂质体制备过程中利用有效超声震荡，过膜整粒的作用，使透明质酸-壳聚糖-脂质体粒径大小均匀，分散性好，不易堵塞皮肤的毛孔。平均粒径为240.45±0.28nm，Zeta电位为-36.3±2.5mV；本发明实施例1所得脂质体的粒径分布图，如图2所示，所得脂质体的粒径范围为210～270nm；对比例是只用壳聚糖包覆的脂质体，其粒径分布图如图3所示；图4为本发明实施例1和对比例所得脂质体体外细胞缓释图，是在pH＝5.5的模拟皮肤pH的环境中进行释药性能测试，结果表明2h后经过壳聚糖和透明质酸包覆的脂质体释药率为48％，而只包覆壳聚糖的脂质体释放率为80％，由图可以看出多层包覆脂质体的稳定性要优于只用壳聚糖包覆的脂质体；因此，经过壳聚糖和透明质酸双层修饰的脂质体缓释时间长，具有长时间防晒功能。

本发明中用柠檬酸溶解壳聚糖，并制成浓度为0.685mg/mL～2.055mg/mL的壳聚糖溶液，是因为柠檬酸属于果酸的一种，其作用主要是加快角质更新，角质的更新有助于皮肤的中黑色素的剥落，毛孔的收细，黑头的溶解等。而普遍用醋酸溶解壳聚糖制备出的壳聚糖溶液有味道刺鼻，且对皮肤有很大刺激性。此外，本发明用柠檬酸溶解的壳聚糖修饰脂质体与普遍用醋酸溶解的壳聚糖修饰脂质体相比，对皮肤的伤害小。

本发明中选用的β-胡萝卜素具有防晒功效，双十六烷基磷酸加入为制得的脂质体的表面提供负电荷，与带正电荷的壳聚糖通过静电相互作用结合，使制得的脂质体稳定性更好。加入的V_C和V_E也具有很强的抗氧化作用，能达到更好的防晒效果，而且加入了保湿剂透明质酸，在防晒的同时还具有保湿作用，可以更好的保护皮肤。

本发明采用冷冻干燥工艺，以蔗糖和甘露醇为保护剂，可以使冻干粉维持原体积，不塌陷、皱缩，表面光洁，再分散性较好，粒子形态也保护得比较好。经过冷冻干燥工艺后制成冻干粉末有利于长期保存，制备防晒霜时，将冻干好的双重修饰β-胡萝卜素脂质体冻干粉用去离子水复溶，轻轻震荡至完全溶解，然后直接加入防晒霜中即可。其中，冻干粉在防晒霜中的添加量为1％～10％，运输和使用更方便。

功效测试：

将本发明实施例1所得的双重修饰β-胡萝卜素脂质体添加到防晒霜中，制成具有长时间防晒功效的防晒霜，并对其防晒效果进行测试。

1.有效防晒时间测试：选40位无皮肤敏感史的年龄在25-45岁的女性，干性、中性、油性皮肤志愿者数量基本相同，选取志愿者前臂内侧区域为受试部位，每个受试者的涂抹面积不得小于30cm²。

对受试者左前臂内侧皮肤选择一处照射区域,用日光紫外线模拟器UVB照射40秒,经20小时后观察,以皮肤出现红斑的最低照射剂量为该受试者正常皮肤的MED值,即为预先测定的MED值，然后测定志愿者涂抹本发明制备的添加有双重修饰β-胡萝卜素脂质的防晒霜的MED值，并用下式计算SPF值：

取40位志愿者的SPF值的平均值的整数部分即为该样品的SPF值，具体测定结果见图5，从图中可以看出本发明所制的防晒霜有效防晒时间可以持续8h，最佳防晒时间为6h。

2.紫外线透光率：将防晒霜样品精确称量100mg溶于50mL容量的瓶中，添加无水乙醇和无水***按1:1的比例混合液作为溶剂制成溶液。将制成的溶液倒至1cm×1cm×5cm的石英比色池中，在调试好的紫外可见光分光光度计中测量290～400nm的波长范围紫外线透光率。测试结果如图6所示，从图中可以看出，本发明制备的双重修饰β-胡萝卜素脂质体防晒霜的紫外光无论是在UVB还是UVA范围内的透光率都不超过20％，与上面的人体试验结果相吻合，说明其防晒效果更好。

Claims

1.一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体，其特征在于，按质量百分比由以下组分组成：蛋黄卵磷脂15％～30％，双十六烷基磷酸1％～3％，保护剂30％～60％，β-胡萝卜素晶体0.1％～1％，胆固醇5％～9％，吐温-8010％～20％，V_E0.5％～1％，V_C0.5％～1％，壳聚糖1％～3％，透明质酸钠1％～3％，以上组分质量百分比之和为100％。

2.根据权利要求1所述的一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体，其特征在于，蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量大于90％，保护剂为蔗糖和甘露醇的混合物，其中，蔗糖与甘露醇的质量比为6:4；透明质酸的分子量为10-100万。

3.根据权利要求1所述的一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体，其特征在于，脂质体为冻干粉末，平均粒径为240.45±0.28nm，体外细胞释药时间为8～10h。

4.一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1，分别称取蛋黄卵磷脂15％～30％，双十六烷基磷酸1％～3％，保护剂30％～60％，β-胡萝卜素晶体0.1％～1％，胆固醇5％～9％，吐温-8010％～20％，V_E0.5％～1％，V_C0.5％～1％，壳聚糖1％～3％，透明质酸钠1％～3％，以上组分质量百分比之和为100％；

步骤2，取步骤1称量的蛋黄卵磷脂、β-胡萝卜素晶体、胆固醇、双十六烷基磷酸、V_E及V_C溶解于有机溶剂中，常温磁力搅拌到各药品完全溶解，将完全溶解后溶液倒入圆底烧瓶在温度为40℃、压力为0.008Mpa条件下在旋转蒸发器中旋转蒸发后，得脂质体薄膜；

步骤3，将步骤1称取的保护剂溶解于浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液中，搅拌至完全溶解，得含保护剂的Tris缓冲液；将含保护剂的Tris缓冲液加入到步骤2所得脂质体薄膜中进行洗膜，得粗脂质体混悬液，将所得混悬液在45℃～55℃水浴磁力搅拌40min～60min，然后有效超声震荡处理15min～20min后，得β-胡萝卜素脂质体混悬液；

步骤4，将步骤1称取的壳聚糖溶解在浓度为4％的柠檬酸溶液中，静置8～16h，使其充分溶解后，得浓度为0.685mg/mL～2.055mg/mL的壳聚糖溶液，备用；

步骤5，取步骤3所得β-胡萝卜素脂质体混悬液以0.1mL/s的速度滴加到步骤4所得壳聚糖溶液中，在500rmp速度下搅拌40min～60min，使其混合均匀后，将混合物在冰浴中有效超声震荡10min～15min，放置在3～4℃环境中8～16h，然后将其在15000rpm的转速下离心处理30min，最后将离心处理后的沉淀物用蒸馏水溶解，得壳聚糖-包脂质体溶液；

步骤7，将步骤5所得壳聚糖-包脂质体溶液以0.1mL/s的速度滴加到步骤6所得透明质酸溶液中，滴加完后继续搅拌40min～60min，冰浴有效超声震荡10min～15min，得透明质酸-壳聚糖-脂质体混悬液，然后依次过0.45μm滤膜和0.22μm滤膜进行整粒；

5.根据权利要求4所述的一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法，其特征在于，步骤1中，蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量大于90％，蛋黄卵磷脂与双十六烷基磷酸的用量比为10:1；胆固醇与双十六烷基磷酸的用量比为2.5:1；保护剂与蛋黄卵磷脂的用量比为2:1；保护剂为蔗糖和甘露醇的混合物，其中，蔗糖与甘露醇的质量比为6:4；透明质酸的分子量为10-100万。

6.根据权利要求4所述的一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法，其特征在于，步骤2中，有机溶剂为无水乙醇与氯仿的混合物，其中无水乙醇与氯仿的体积比为1:2。

7.根据权利要求4所述的一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法，其特征在于，步骤4中，壳聚糖为低分子量壳聚糖，其分子量为5万～19万。

8.根据权利要求4所述的一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法，其特征在于，步骤5中，β-胡萝卜素脂质体混悬液与壳聚糖溶液的体积比为1:1。

9.根据权利要求4所述的一种双重修饰β-胡萝卜素脂质体的制备方法，其特征在于，步骤7中，透明质酸溶液与壳聚糖-包脂质体混悬液的体积比为1:1。