CN112956680A - 一种仿植物油体核-壳型脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿植物油体核‑壳型脂质体及其制备方法，本发明以荷载类胡萝卜素的天然磷脂为核心，以表面包覆的植物油体蛋白和非离子多糖为外壳，构成仿植物油体核‑壳型脂质体。本发明制备的仿植物油体核‑壳型脂质体基于植物油体蛋白独特的界面活性和非离子多糖良好的水分散性和增稠性、直链上的极性基团及其空间位阻作用，不仅能提高脂质体对环境因素的稳定性，还能够实现载荷物质的缓慢释放。本发明稳定脂质体所用的植物油体蛋白及非离子多糖均为食品来源，价格低廉，可安全、有效的应用于食品领域，提供的方法操作简单，始于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品加工领域，特别涉及一种仿植物油体核-壳型脂质体及其制备方法。
背景技术
脂质体是由磷脂分散在水中自聚集形成的具有双分子层结构的超微球状粒子。其构成磷脂的的亲水端形成囊泡的内外表面，而输水性的脂肪酸链尾端形成双分子层的疏水核心区域。作为一种优良的运输载体，脂质体具有良好的生物相容性，可同时包埋亲水性和疏水性芯材，提高芯材的分散性、稳定性和生物有效性，实现靶向释放和传输。但因奥兹熟化(Oswald ripening)和对环境因素(如pH、温度、氧、酶、离子强度)的敏感性，脂质体在贮藏和应用中易发生聚集、融合、絮凝、氧化，导致其粒径变化，结构完整性遭到破坏。作为口服制剂的脂质体在消化吸收过程中，极易受到pH和酶的作用，使得磷脂壁发生水解，膜通透性増强，芯材泄漏，极大影响脂质体的生物功能性质。因此，脂质体作为传输体系在医药、食品中的应用仅限于对特定功效成分或营养补充剂的模型研究。因此，针对性对脂质体进行可控修饰，制备出稳定的新型脂质体，拓宽脂质体在医药、食品等领域的应用范围，是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿植物油体核-壳型脂质体及其制备方法，以解决上述问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明的技术方案之一：提供一种仿植物油体核-壳型脂质体，荷载类胡萝卜素的天然磷脂为核心，表面包覆的植物油体蛋白和非离子多糖为外壳，构成仿植物油体核-壳型脂质体。
本发明的技术方案之二：提供上述仿植物油体核-壳型脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将天然磷脂、胆固醇、表面活性剂和类胡萝卜素溶于溶剂中，减压旋蒸至形成透明脂膜；
(2)将植物油体蛋白分散于磷酸盐缓冲液中，加入步骤(1)制得的透明脂膜，超声处理，制得植物油体蛋白稳定的脂质体；
(3)将步骤(2)制得的植物油体蛋白稳定的脂质体加入到溶有非离子多糖的磷酸盐缓冲液中，制得仿植物油体核-壳型脂质体。
仿植物油体核-壳型脂质体实际为油体蛋白和非离子多糖稳定的脂质体。
优选的，步骤(1)中所述天然磷脂为蛋黄卵磷脂；所述表面活性剂为吐温-80；所述类胡萝卜素为β-隐黄素；所述溶剂为无水乙醇；所述减压旋蒸的温度为40-50℃。
本发明所用的β-隐黄素因其具有8个异戊二烯单位首尾相连的特殊结构，可以很好地被包裹于脂质体中。
优选的，所述蛋黄卵磷脂、胆固醇、吐温-80和β-隐黄素的质量比为5:1:1:0.1。
优选的，步骤(2)中所述植物油体蛋白的制备步骤包括：将植物油体蛋白原料分散于含氯化钠和蔗糖的Tris-HCl缓冲液中，搅拌，离心，收集乳状液层，除杂后分散于有机溶剂中，超声，离心，沉淀干燥，制得植物油体蛋白。
更优选的，所述植物油体蛋白原料为全脂大豆粉、杏仁粉或玉米胚芽粕；所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的浓度为10mmol/L，氯化钠的浓度为0.5mol/L，蔗糖的浓度为0.2mol/L，pH值为7.5；所述离心的温度为4℃，转速为10000r/min，时间为30min。
更优选的，所述有机溶剂为正己烷；所述超声为冰浴超声；所述干燥采用氮气吹干。
更优选的，所述植物油体蛋白原料与含氯化钠和蔗糖的Tris-HCl缓冲液的质量与体积之比为5g:100ml；所述乳状液层与有机溶剂的体积比为1:10。
更优选的，所述除杂的方法为将乳状液层重新分散于Tris-HCl缓冲液中，搅拌，离心，重复两次。
优选的，步骤(2)中所述超声处理的方法为在300W的功率下，工作1s，暂停1s，持续15min。
优选的，步骤(2)和步骤(3)中所述磷酸盐缓冲液的溶度为10mmol/L，pH值为7.0；步骤(3)中所述非离子多糖为瓜儿豆胶。
本发明所选用的瓜儿豆胶是利用其作为非离子多糖，具有良好的水分散性和增稠性，在制备脂质体样品的pH值条件下也具有较好的溶解性，其直链上的极性基团，理论上可与植物油体蛋白贴合在脂质体磷脂双分子层表面的极性氨基酸残基形成氢键相互作用。
更优选的，油体蛋白与磷酸盐缓冲液的体积与质量之比为0.01g:100ml；瓜儿豆胶与磷酸盐缓冲液的体积与质量之比为0.1g:100ml；植物油体蛋白与瓜儿豆胶的质量比为1:10。
本发明的有益技术效果如下：
本发明基于植物油体蛋白的拓扑结构，借鉴仿生学中生物启发(bio-inspire)理念，将油体蛋白-单层磷脂复合膜结构移植于脂质体，进一步在其表面包覆非离子多糖，基于植物油体蛋白独特的界面活性和非离子多糖的空间位阻作用，制备植物油体蛋白和非离子多糖稳定的仿植物油体核-壳型脂质体。
本发明制备的仿植物油体核-壳型脂质体不仅能提高脂质体对环境因素的稳定性，还能够实现载荷物质的缓慢释放。
本发明稳定脂质体所用的植物油体蛋白及非离子多糖均为食品来源，价格低廉，可安全、有效的应用于食品领域，提供的方法操作简单，始于大规模推广应用。
附图说明
图1为实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体透射电镜图；其中图1(a)为实施例1制备的仿植物油体核-壳型脂质体透射电镜图；图1(b)为实施例2制备的仿植物油体核-壳型脂质体透射电镜图；图1(c)为实施例3制备的仿植物油体核-壳型脂质体透射电镜图。
图2为实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体和对比例1制备的未修饰脂质体于4℃避光贮藏条件下，β-隐黄素保留率随时间的变化图。
图3为实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体和对比例1制备的未修饰脂质体进行体外模拟消化实验的脂肪酸释放率。
图4为实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体和对比例1制备的未修饰脂质体进行体外模拟消化实验的β-隐黄素释放率。
具体实施方式
现结合附图详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)将全脂大豆粉按1:10(W/V)分散于0.5mol/L氯化钠和0.2mol/L蔗糖的Tris-HCl(10mmol/L，pH7.5)缓冲液中，经搅拌、离心(4℃，10000r/min，30min)收集乳状液层。重复2次收集乳状液层、分散及离心操作。将所得乳状液层按1:10(V/V)分散于正己烷中，冰浴超声，离心(4℃，10000r/min，10min)去除溶剂，收集沉淀氮气吹干，制得油体蛋白。
(2)将蛋黄卵磷脂，胆固醇、吐温-80和β-隐黄素(质量比为5:1:1:0.1)的混合物中加入无水乙醇使其分散均匀，40℃减压旋蒸至形成一层透明脂膜；
(3)将步骤(1)制得的油体蛋白以0.01％(W/V)的浓度分散于10mmol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液中，制得油体蛋白磷酸盐缓冲液；
(4)将步骤(2)制备的透明脂膜加入步骤(3)制备的油体蛋白磷酸盐缓冲液中，超声处理(300W，工作1s，暂停1s，共15min)后，经高压均质机制得油体蛋白稳定的脂质体溶液；
(5)将瓜儿豆胶以0.1％(W/V)的浓度溶于10mmol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液中，制得瓜儿豆胶磷酸盐缓冲液；
(6)将步骤(4)制备的油体蛋白稳定的脂质体溶液于搅拌转态下等体积滴加于步骤(5)制备的的瓜儿豆胶磷酸盐缓冲液中，制得仿植物油体核-壳型脂质体。
大豆油体蛋白的结构为碱性蛋白以“锚定贯穿”方式镶嵌于油体结构，该碱性蛋白的中间高度疏水区以两列反平行β折叠贯穿于磷脂单层伸入甘油三酯内部，形成发卡状(hairpin-like)构型，“发卡”顶部是由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的脯氨酸结(proline-knot)。油体蛋白两亲性氮端和碳端中带正电荷的氨基酸残基与带负电荷的磷脂或脂肪酸形成离子键，贴合油体表面，极性氨基酸残基暴露在外，使得油体表面具有亲水性。油体蛋白可快速扩散至脂水界面并紧密堆积，形成弹性吸附层进而稳定油体；其与磷脂能协同降低油水界面张力。
实施例2
(1)将杏仁粉按1:10(W/V)分散于0.5mol/L氯化钠和0.2mol/L蔗糖的Tris-HCl(10mmol/L，pH7.5)缓冲液中，经搅拌、离心(4℃，10000r/min，30min)收集乳状液层。重复2次收集乳状液层、分散及离心操作。将所得乳状液层按1:10(V/V)分散于正己烷中，冰浴超声，离心(4℃，10000r/min，10min)去除溶剂，收集沉淀氮气吹干，制得油体蛋白。
(2)将蛋黄卵磷脂，胆固醇、吐温-80和β-隐黄素(质量比为5:1:1:0.1)的混合物中加入无水乙醇使其分散均匀，40℃减压旋蒸至形成一层透明脂膜；
(3)将步骤(1)制得的油体蛋白以0.01％(W/V)的浓度分散于10mmol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液中，制得油体蛋白磷酸盐缓冲液；
(4)将步骤(2)制备的透明脂膜加入步骤(3)制备的油体蛋白磷酸盐缓冲液中，超声处理(300W，工作1s，暂停1s，共15min)后，经高压均质机制得油体蛋白稳定的脂质体溶液；
(5)将瓜儿豆胶以0.1％(W/V)的浓度溶于10mmol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液中，制得瓜儿豆胶磷酸盐缓冲液；
(6)将步骤(4)制备的油体蛋白稳定的脂质体溶液于搅拌转态下等体积滴加于步骤(5)制备的的瓜儿豆胶磷酸盐缓冲液中，制得仿植物油体核-壳型脂质体。
实施例3
(1)将玉米胚芽粕按1:10(W/V)分散于0.5mol/L氯化钠和0.2mol/L蔗糖的Tris-HCl(10mmol/L，pH7.5)缓冲液中，经搅拌、离心(4℃，10000r/min，30min)收集乳状液层。重复2次收集乳状液层、分散及离心操作。将所得乳状液层按1:10(V/V)分散于正己烷中，冰浴超声，离心(4℃，10000r/min，10min)去除溶剂，收集沉淀氮气吹干，制得油体蛋白。
(2)将蛋黄卵磷脂，胆固醇、吐温-80和β-隐黄素(质量比为5:1:1:0.1)的混合物中加入无水乙醇使其分散均匀，40℃减压旋蒸至形成一层透明脂膜；
(3)将步骤(1)制得的油体蛋白以0.01％(W/V)的浓度分散于10mmol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液中，制得油体蛋白磷酸盐缓冲液；
(4)将步骤(2)制备的透明脂膜加入步骤(3)制备的油体蛋白磷酸盐缓冲液中，超声处理(300W，工作1s，暂停1s，共15min)后，经高压均质机制得油体蛋白稳定的脂质体溶液；
(5)将瓜儿豆胶以0.1％(W/V)的浓度溶于10mmol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液中，制得瓜儿豆胶磷酸盐缓冲液；
(6)将步骤(4)制备的油体蛋白稳定的脂质体溶液于搅拌转态下等体积滴加于步骤(5)制备的的瓜儿豆胶磷酸盐缓冲液中，制得仿植物油体核-壳型脂质体。
对比例1
将蛋黄卵磷脂，胆固醇、吐温-80和β-隐黄素(质量比为5:1:1:0.1)的混合物中加入无水乙醇使其分散均匀，40℃减压旋蒸至形成一层透明脂膜，制得未修饰脂质体。
将实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体进行透射电子显微镜观察；实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体和对比例1制备的未修饰脂质体进行β-隐黄素包封率和保留率的测定和体外模拟消化实验。
(1)透射电子显微镜观察：将仿植物油体核-壳型脂质体采用磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH＝7.2)稀释10倍，滴加样品于铜网上，室温静置2min，用滤纸从铜网边缘吸去多余样品，并于室温下干燥。室温下干燥后进行透射电子显微镜观察。
结果见图1，图1(a)为实施例1制备的仿植物油体核-壳型脂质体透射电镜图；图1(b)为实施例2制备的仿植物油体核-壳型脂质体透射电镜图；图1(c)为实施例3制备的仿植物油体核-壳型脂质体透射电镜图。从图1中可以看出，大豆油体蛋白、杏仁油体蛋白及玉米胚芽油体蛋白和瓜尔豆胶共同稳定的β-隐黄素脂质体均为不规则球形颗粒，其中玉米胚芽油体蛋白和瓜尔豆胶共同稳定的β-隐黄素脂质体粒径最大。
(2)β-隐黄素包封率的测定：采用截留分子量为3000Da的超滤离心管，对实施例1-3中制备的仿植物油体核-壳型脂质体在4℃条件下离心30min(10000r/min)。通过紫外可见分光光度计法确定β-隐黄素标准曲线，并根据β-隐黄素标准曲线确定离心上清液中游离β-隐黄素浓度。脂质体中β-隐黄素的保留率采用实际包封β-隐黄素的量与制备过程中添加β-隐黄素量的比值表示。计算公式为：
β-隐黄素包封率％＝(W1-W2)/W1×100
其中W1是脂质体中添加的β-隐黄素量(mg)，W2是游离β-隐黄素的量(mg)，(W1-W2)为β-隐黄素包封量。
测得实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体和对比例1制备的未修饰脂质体β-隐黄素包封率分别为95.7％、90.8％、93.7％和87.2％。
(3)β-隐黄素保留率的测定：实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体和对比例1制备的未修饰脂质体于4℃避光贮藏条件下贮存90d。按β-隐黄素包封率测定的方法每隔15d测定其β-隐黄素包封量，β-隐黄素保留率(％)为不同贮藏时间后脂质体中β-隐黄素包封量与初始β-隐黄素包封量的比值。
测定结果见图2，从图2中可以看出四种β-隐黄素脂质体的保留率均随贮存时间的延长而降低。经90d贮藏后，未修饰脂质体约有50％左右的β-隐黄素保留，由植物油体蛋白和非离子多糖稳定的脂质体β-隐黄素保留率均能维持75％以上，说明植物油体蛋白和非离子多糖的引入有效抑制了β-隐黄素的泄漏。
(4)体外模拟消化实验：模拟胃消化液由2g/LNaCl，7mL/L HCl和3.2g/L猪胃蛋白酶构成，调节pH至1.2。将模拟胃消化液分别与实施例1-3制备的仿植物油体核-壳型脂质体和对比例1制备的未修饰脂质体以1：1质量比混合，pH调节至6.8，在37℃水浴(100rpm)中连续震荡进行模拟胃液消化2h。
模拟小肠消化液含2.5mL胰脂肪酶(4.8mg/mL)，4mL猪胆汁提取物(5mg/mL)和1mL氯化钙溶液(750mM)，调节pH至7.0。将模拟胃消化产物与模拟小肠消化液(比例为1：1w/w)混合，37°C下孵育2h，整个消化过程中用NaOH溶液维持溶液pH＝7.0。记录实验过程中消耗的NaOH溶液的体积以计算脂肪酸(FAA)释放率，计算公式如下：
式中VNaOH是中和释放的脂肪酸所需的NaOH体积(mL)，CNaOH为NaOH的摩尔浓度，M为脂质体的平均分子量(g/mol)，m为脂质体的质量(g)。
测定结果见图3，从图3中可以看出，模拟小肠消化结束后未修饰β-隐黄素脂质体的FFA释放率为53.5％，经大豆、杏仁和玉米胚芽三种植物油体蛋白和瓜儿豆胶稳定的β-隐黄素脂质体的FFA释放率分别为44.02％、42.08％和43.22％，均小于未修饰β-隐黄素脂质体的FFA释放率(53.5％)，说明植物油体蛋白和瓜儿豆胶可增强脂质体在模拟小肠消化环境中稳定性。这可能是由于油体蛋白和瓜儿豆胶在磷脂双分子层表面形成致密的结构，减少了脂酶的渗入；部分水解的植物油体蛋白片段和游离磷脂分子吸附于膜表面，抑制了脂酶活性。
在模拟胃肠液孵育期间，定时取一定体积的脂质体样品，按(2)中方法测定消化产物中游离的β-隐黄素的量。消化产物中游离β-隐黄素的量减去未消化体系中游离β-隐黄素的量，记为β-隐黄素释放量。β-隐黄素释放率计算公式如下：
β-隐黄素释放率(％)＝β-隐黄素释放量/β-隐黄素包封量×100
测定结果见图4，从图4中可以看出，在模拟胃液消化阶段，四种脂质体中的β-隐黄素缓慢释放。模拟胃液消化结束时，未修饰脂质体的β-隐黄素释放率为8.3％，显著高于其它三者的β-隐黄素释放率(1.9-3.5％)。进入模拟小肠消化后，四种样品β-隐黄素均呈现快速释放。整个模拟体外消化阶段，未修饰脂质体的β-隐黄素释放率均高于三种表面修饰的脂质体。经4h消化完成后，大豆、杏仁和玉米胚芽三种植物油体蛋白和瓜儿豆胶稳定的脂质体中β-隐黄素释放率分别为40.5％、43.8％和56.8％，而未修饰脂质体的β-隐黄素释放率(89.3％)。表明瓜儿豆胶的空间位阻和油体蛋白对磷脂双分子层的结构固化作用，减少了消化酶对所构建传输载体的破坏作用，从而延缓了β-隐黄素的释放。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种仿植物油体核-壳型脂质体，其特征在于，荷载类胡萝卜素的天然磷脂为核心，表面包覆的植物油体蛋白和非离子多糖为外壳，构成仿植物油体核-壳型脂质体。
2.一种权利要求1所述仿植物油体核-壳型脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将天然磷脂、胆固醇、表面活性剂和类胡萝卜素溶于溶剂中，减压旋蒸至形成透明脂膜；
(2)将植物油体蛋白分散于磷酸盐缓冲液中，加入步骤(1)制得的透明脂膜，超声处理，制得植物油体蛋白稳定的脂质体；
(3)将步骤(2)制得的植物油体蛋白稳定的脂质体加入到溶有非离子多糖的磷酸盐缓冲液中，制得仿植物油体核-壳型脂质体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述天然磷脂为蛋黄卵磷脂；所述表面活性剂为吐温-80；所述类胡萝卜素为β-隐黄素；所述溶剂为无水乙醇；所述减压旋蒸的温度为40-50℃。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述蛋黄卵磷脂、胆固醇、吐温-80和β-隐黄素的质量比为5:1:1:0.1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述植物油体蛋白的制备步骤包括：将植物油体蛋白原料分散于含氯化钠和蔗糖的Tris-HCl缓冲液中，搅拌，离心，收集乳状液层，除杂后分散于有机溶剂中，超声，离心，沉淀干燥，制得植物油体蛋白。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述植物油体蛋白原料为全脂大豆粉、杏仁粉或玉米胚芽粕；所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的浓度为10mmol/L，氯化钠的浓度为0.5mol/L，蔗糖的浓度为0.2mol/L，pH值为7.5；所述离心的温度为4℃，转速为10000r/min，时间为30min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述植物油体蛋白原料与含氯化钠和蔗糖的Tris-HCl缓冲液的质量与体积之比为5g:100ml；所述乳状液层与有机溶剂的体积比为1:10。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述超声处理的方法为在300W的功率下，工作1s，暂停1s，持续15min。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述磷酸盐缓冲液的溶度为10mmol/L，pH值为7.0；步骤(3)中所述非离子多糖为瓜儿豆胶。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，油体蛋白与磷酸盐缓冲液的体积与质量之比为0.01g:100ml；瓜儿豆胶与磷酸盐缓冲液的体积与质量之比为0.1g:100ml；油体蛋白与瓜儿豆胶的质量比为1:10。
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| Publication number | Publication date |
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| CN112956680B (zh) | 2022-07-15 |
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