CN104975060A - 一种假交替单胞菌重组氨肽酶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，涉及一种来自深海热液口的假交替单胞菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16098氨肽酶(aminopeptidase)的应用。重组氨肽酶来自深海热液口的假交替单胞菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16098氨肽酶的重组蛋白，其作为蛋白水解酶的应用。本发明获得的重组蛋白可用于将氨基酸从多肽链的N-末端解离，在蛋白消化等方面具有潜在应用价值。

Description

一种假交替单胞菌重组氨肽酶的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，涉及一种来自深海热液口的假交替单胞菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16098氨肽酶(aminopeptidase)的应用。

背景技术

氨肽酶隶属于金属蛋白酶M1家族，可水解蛋白质或多肽的N末端氨基酸,广泛分布于动、植物和微生物中,在各种生物过程中起重要作用。氨肽酶多为锌离子依赖型金属蛋白酶，根据氨肽酶催化水解多肽N末端氨基酸的偏好性，可分为丙氨酸氨肽酶、亮氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶和脯氨酸氨肽酶等，亮氨酸氨肽酶为其中最有代表性的一类。在人体中，白三烯A4水解酶(leukotriene A-4 hydrolase，LTA4H)为一类重要的亮氨酸氨肽酶，它由Peptidase_M1和Leuk-A4-hydro_C两个结构域组成，与人体多种恶性肿瘤的发生息息相关，可作为人类临床肝胆疾病的诊断指标。近年来，在大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus、水稻黄单胞杆菌Xanthomonas oryzae、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu等微生物中陆续报道了多种不同类型的氨肽酶，但在海洋微生物中氨肽酶功能相关研究较少，仅有科尔韦氏菌Colwellia psychrerythraea中的亮氨酸氨肽酶及高温球菌Thermococcus中的甲硫氨酸氨肽酶等。

假交替单胞菌P.telluritireducens 16098分离自深海热液口附近，其在高压、高盐、少光照、极温、高重金属等环境因素的自然选择下，必然会适应产生一系列结构新颖、作用机制特殊并具有潜在应用前景的功能蛋白，因此开展功能蛋白的发掘及应用基础具有十分重要的理论与实践意义。P.telluritireducens 16098氨肽酶基因编码区为1845bp，编码蛋白的成熟肽含593个氨基酸残基，由Peptidase_M1和Leuk-A4-hydro_C两个结构域组成，与深海嗜冷微生物C.psychrerythraea中的低温亮氨酸氨肽酶相似度为71.4％，与人LTA4H相似度为48.7％。本发明将对P.telluritireducens16098氨肽酶进行体外原核重组表达，对重组蛋白的酶学活性进行深入研究，研究结果对深海微生物新型蛋白酶的开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自深海热液口的假交替单胞菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16098氨肽酶(aminopeptidase)的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种假交替单胞菌重组氨肽酶的应用，重组氨肽酶来自深海热液口的假交替单胞菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16098氨肽酶的重组蛋白，其作为蛋白水解酶的应用。

所述重组蛋白的获得：

(1)所述P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白是在其成熟肽编码区的两端分别设计含有限制性酶切位点的引物(序列为5’-CATATGAACGCGATTGATCAAAACTCAT-3’和5’-CTCGAGTTATTTATCAAATAAAGCGTC-3’)；

(2)而后通过PCR扩增获得编码区基因，并将其克隆到pET-30a(+)表达载体中，随后转入宿主细胞大肠杆菌Transetta(DE3)中实现原核体外重组表达；

(3)P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白在非变性条件下利用镍琼脂糖凝胶柱进行纯化。

所述P.telluritireducens16098氨肽酶的重组蛋白在28℃、pH 7.2时，对L-亮氨酸7-氨基-4-甲基香豆素具有显著的氨肽酶活性，其Km值为44.56±5.09μmol L^-1。

所述P.telluritireducens 16098氨肽酶的重组蛋白的最适温度范围为28℃-40℃，在50℃以上热稳定性较低。

所述P.telluritireducens 16098氨肽酶的重组蛋白的最适pH范围为7.2-8.0，且在pH 9.0-12.2时可检测到活性。

所述P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白可耐受高盐浓度及部分金属离子，但低盐浓度及Cu²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺等金属离子可显著抑制重组蛋白活性，EDTA、蛋白酶抑制剂等亦对重组蛋白的活性具有一定的抑制作用。

本发明所具有的优点：

本发明所获得的P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白在28℃、pH 7.2时，对L-亮氨酸7-氨基-4-甲基香豆素具有显著的氨肽酶活性，其Km值为44.56±5.09μmol L^-1。重组蛋白最适温度为28℃-40℃，在50℃以上热稳定性较低；最适pH为7.2-8.0，且在pH 9.0-12.2时可检测到活性；重组蛋白可耐受高盐浓度及部分金属离子，但低盐浓度及Cu²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺等金属离子可显著抑制重组蛋白活性，EDTA、蛋白酶抑制剂等亦对重组蛋白的活性具有一定的抑制作用。可见本发明获得的重组蛋白可用于将氨基酸从蛋白或多肽的N末端解离，在蛋白降解方面具有潜在应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例提供的P.telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽编码区体外原核重组表达(A)和纯化(B)图。

图2为本发明实施例提供的重组P.telluritireducens16098氨肽酶的米氏方程曲线图。

图3为本发明实施例提供的温度对重组P.telluritireducens16098氨肽酶活性的影响图。

图4为本发明实施例提供的重组P.telluritireducens16098氨肽酶的热稳定性图。

图5为本发明实施例提供的pH对P.telluritireducens 16098氨肽酶活性的影响图。

具体实施方式

下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

本发明是通过PCR技术克隆获得了P.telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽的编码区序列，克隆到pET-30a(+)表达载体中，在大肠杆菌Transetta(DE3)中实现原核体外重组表达。经镍琼脂糖凝胶纯化获得的重组蛋白分子。

本发明利用体外重组表达技术获得了P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白，其在28℃、pH 7.2时，对底物L-亮氨酸7-氨基-4-甲基香豆素的Km值为44.56±5.09μmol L^-1；最适温度为28℃-40℃，最适pH为7.2-8.0，在pH 9.0-12.2时仍可检测到活性；可耐受高盐浓度及部分金属离子，低盐浓度、Cu²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺等金属离子以及EDTA、蛋白酶抑制剂等对重组蛋白活性具有显著抑制作用。本发明获得的重组蛋白可用于将氨基酸从多肽链的N-末端解离，在蛋白消化等方面具有潜在应用价值。

实验例1：P.telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽编码区体外原核重组表达和纯化

1、重组载体的构建

本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pET-30a(+)原核表达载体。通过PCR技术，采用5’末端分别添加了Nde I和Xho I限制性酶切位点的引物P1(5’-CATATGAA CGCGATTGATCAAAACTCAT-3’)和P2(5’-CTCGAGTTATTTATCAAATAAAGCGTC-3’)扩增来自深海热液口的假交替单胞菌P.telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽的编码区。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒，并使用Nde I和XhoI对质粒进行双酶切；回收目的片段，并经Nde I和Xho I酶切的表达载体pET-30a(+)连接，完成重组质粒的构建。

2、重组蛋白的表达

将构建好的重组质粒转化表达宿主菌大肠杆菌Transetta(DE3)中，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200mL的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至OD 600＝0.4～0.8。加入IPTG(终浓度1mmol L^-1)，继续培养4小时后于4℃5000rpm离心10分钟，收集菌体，于-80℃冻存备用。取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μl水和20μl的5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。

3、重组蛋白的纯化

本发明中重组蛋白在非变性条件下采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，即获得来自深海热液口的假交替单胞菌P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白。具体操作步骤如下：

(1)镍琼脂糖凝胶FF装柱(1.6×20cm)，柱床体积为10ml；

(2)用缓冲液I(50mmol L^-1Tris-HCl，0.5mol L^-1NaCl，pH 7.2)平衡2-5个床体积，流速为2ml min^-1；

(3)经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30分钟，12000rpm，4℃离心30分钟，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1ml min^-1；

(4)用缓冲液I再洗2-5个床体积，流速为2ml min^-1；

(5)用含有50mmol L^-1咪唑的缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2ml min^-1；

(6)依次用含有100mmol L^-1、200mmol L^-1和400mmol L^-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，流速为2ml min^-1；

(7)收集的蛋白在缓冲液II(20mmol L^-1Tris-HCl，400mmol L^-1NaCl，pH7.2)及去离子水中透析，之后用SDS-PAGE检测获得的蛋白分子量和纯度。纯化蛋白冻干，存于-80℃冰箱。

实验结果：SDS-PAGE结果表明，含有重组质粒的大肠杆菌在IPTG诱导后可产生分子量约70kDa的特异条带,大小与P.telluritireducens16098氨肽酶分子量相一致(图1A)。在非变性条件下经纯化得到单一条带，即为重组的P.telluritireducens 16098氨肽酶(图1B)。

实验例2：P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白的Km值测定在96孔板每孔中加入80μl缓冲液II，10μl重组蛋白(10μg ml^-1)和10μl不同浓度的底物L-亮氨酸7-氨基-4-甲基香豆素(L-leucine7-amido-4-methylcoumarin，MCA-L，Sigma)，立刻在激发光355nm、吸收光440nm下连续测定吸光度，计算酶反应速率(以每秒吸光度的增加量dA/dt来表示)，推算Km值。对照组以BSA(10μg ml^-1)代替重组氨肽酶，每组实验重复三次，计算平均值及标准差。

实验结果：28℃、pH 7.2时，P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白的米氏方程曲线如图2所示，推算Km为44.56±5.09μmol L^-1。

实验例3：P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白最适温度的检测

检测0℃、4℃、10℃、20℃、28℃、40℃、50℃和60℃下重组蛋白活性。在96孔板每孔中加入80μl缓冲液II、10μl重组蛋白(10μg ml^-1)和10μl MCA-L(2mmol L^-1)后，于上述温度下反应30分钟后，在激发光355nm、吸收光440nm下连续测定吸光度，以28℃时酶活为100％计算各温度下的相对活性。各组实验重复三次，计算平均值及标准差。

实验结果：pH 7.2时，P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白最适温度为28-40℃。40℃时相对活性为107.13±1.73％，比28℃时略高但与28℃时无显著差异。20℃时相对活性为58.45±0.90％，50℃时相对活性为22.92±1.31％(图3)。

实验例4：P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白热稳定性的检测

检测重组蛋白在30℃、40℃和50℃下的热稳定性。将10μl重组蛋白(10μg ml^-1)在上述温度下分别孵育0、5、15、45和90分钟。在96孔板中每孔加入80μl缓冲液II、10μl不同温度处理后的重组蛋白(10μg ml^-1)及10μl MCA-L(2mmol L^-1)，之后立刻在28℃、激发光355nm、吸收光440nm下连续测定吸光度，以初始酶活为100％计算各温度下孵育不同时间后重组蛋白的相对活性。各组实验重复三次，计算平均值及标准差。

实验结果：pH 7.2时，P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白在50℃下保温5分钟后残余酶活为17.00±2.03％，15分钟后残余酶活仅为0.34±0.26％。在30℃、40℃下保温90分钟后，残余酶活分别下降至86.78±3.29％和72.88±3.37％(图4)。

实验例5：P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白最适pH的检测

在28℃下检测pH 5.0、6.0、6.6、7.2、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0、11.8、12.2和12.5对重组蛋白活性的影响。在96孔板每孔中加入80μl上述不同pH缓冲液(pH 5.0-6.6为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH7.2-10.0为Tris-HCl缓冲液，pH 10.5-12.5为NaOH溶液)，10μl重组蛋白(10μg ml^-1)和10μl MCA-L(2mmol L^-1)，立刻于激发光355nm、吸收光440nm下连续测定吸光度，以pH 7.2时酶活力为100％计算各温度下的相对活性。各组实验重复三次，计算平均值及标准差。

实验结果：28℃时，P.telluritireducens 16098氨肽酶最适pH为7.2-8.0，pH 9.0-10.5时相对活性约为37.61-35.51％，pH 12.2时仍可检测到重组蛋白活性，相对活性约为7.76±2.54％(图5)。

实验例6：金属离子对重组P.telluritireducens 16098氨肽酶活性的影响检测

在28℃下，向96孔板每孔中加入80μl含有不同浓度金属离子的缓冲液II(20mmol L^-1Tris-HCl，400mmol L^-1NaCl，pH 7.2)和10μl重组蛋白(10μg ml^-1)，冰浴1小时后加入10μl MCA-L(2mmol L^-1)，立刻在激发光355nm、吸收光440nm下连续测定吸光度。实验选用含二价金属离子的盐酸盐，包括CuCl₂、ZnCl₂、CdCl₂、CaCl₂、CoCl₂、MnCl₂和MgCl₂，终浓度分别为0.1mmol L^-1、1mmol L^-1和10mmol L^-1。对照组不含上述金属离子，以对照组酶活力为100％计算各实验组相对活性。各组实验重复三次，计算平均值及标准差。

实验结果：28℃、pH 7.2时，所检测的二价金属离子对重组蛋白的活性均有一定抑制作用，抑制作用从强到弱分别为Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺和Mg²⁺(表1)。Cu²⁺的抑制作用最强，0.1mmol L^-1Cu²⁺处理后相对活性仅为0.03±0.02％。1mmol L^-1Cu²⁺、Zn²⁺或10mmol L^-1Cd²⁺可完全抑制蛋白活性。10mmol L^-1Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺和Mg²⁺处理后的残余活性分别为45.92±2.75％、37.05±0.91％、47.47±2.39％和45.09±2.76％。

表1 不同金属离子对重组P.telluritireducens 16098氨肽酶活性的影响

	浓度(mmol L-1)	相对活性(％)
			CuCl2	0.1	0.03±0.02
	1	0.00
				10	0.00
ZnCl2	0.1	12.86±1.61
				1	0.00
	10	0.00
			CdCl2	0.1	40.09±4.74
	1	7.41±2.1
				10	0.00
CaCl2	0.1	81.31±7.90
				1	59.94±2.15
	10	45.92±2.75
			CoCl2	0.1	85.95±0.65
	1	83.39±7.20
				10	37.05±0.91
MnCl2	0.1	90.47±6.48
				1	81.31±5.64
	10	47.47±2.39
			MgCl2	0.1	98.27±1.76
	1	66.34±6.07
				10	45.09±2.76

实验例7：NaCl浓度对重组P.telluritireducens 16098氨肽酶活性的影响检测

在28℃下，向96孔板每孔中加入80μl含有不同浓度NaCl的缓冲液II(20mmol L^-1Tris-HCl，0、100、200、400或800mmol L^-1NaCl，pH 7.2)、10μl重组蛋白(10μg ml^-1)和10μl MCA-L(2mmol L^-1)，立刻在激发光355nm、吸收光440nm下连续测定吸光度。各组实验重复三次，取平均值。以400mmol L^-1NaCl组酶活力为100％，计算各实验组相对活性。

实验结果：28℃、pH 7.2时，重组蛋白活性随NaCl浓度增加而增强，当反应体系中NaCl浓度分别为0、100、200、400或800mmol L^-1时，相对活性分别为26.40±0.86％、25.98±3.25％、57.56±3.76％、100.00±1.07％和119.64±6.80％。

实验例8：EDTA及蛋白酶抑制剂对重组P.telluritireducens 16098氨肽酶活性的影响检测

在28℃下，向96孔板每孔中加入80μl含有EDTA或蛋白酶抑制剂的缓冲液II(20mmol L^-1Tris-HCl，400mmol L^-1NaCl，pH 7.2)、10μl重组蛋白(10μg ml^-1)和10μl MCA-L(2mmol L^-1)，立刻在激发光355nm、吸收光440nm下连续测定吸光度。EDTA终浓度为1mmol L^-1或10mmol L^-1，蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，碧云天)或Protease Inhibitior Cocktail(上海生工)终浓度均为1mmol L^-1。对照组不含EDTA或蛋白酶抑制剂。各组实验重复三次，取平均值。以对照组酶活力为100％计算各实验组相对活性。

实验结果：28℃、pH 7.2时，EDTA及蛋白酶抑制剂可显著抑制重组蛋白活性。当反应体系中EDTA浓度为1mmol L^-1或10mmol L^-1时，相对活性分别为10.47±1.78％和6.77±1.44％。当反应体系中含有1mmol L^-1PMSF或Protease Inhibitior Cocktail时，相对活性分别为59.13±4.39％和8.39±0.12％。

Claims (2)

1.一种假交替单胞菌重组氨肽酶的应用，其特征在于：重组氨肽酶来自深海热液口的假交替单胞菌Pseudoalteromonas telluritireducens16098氨肽酶的重组蛋白，其作为蛋白水解酶的应用。

2.按权利要求1所述的假交替单胞菌重组氨肽酶的应用，其特征在于：

(1)所述P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白是在其成熟肽编码区的两端分别设计含有限制性酶切位点的引物(序列为5’-CATATGAACGCGATTGATCAAAACTCAT-3’和5’-CTCGAGTTATTTATCAAATAAAGCGTC-3’)；

(2)而后通过PCR扩增获得编码区基因，并将其克隆到pET-30a(+)表达载体中，随后转入宿主细胞大肠杆菌Transetta(DE3)中实现原核体外重组表达；

(3)P.telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白在非变性条件下利用镍琼脂糖凝胶柱进行纯化。