CN104974258B - 重组抗hgf/dll4双特异性抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种重组抗人HGF/DLL4双特异性抗体、其制备方法和应用。本发明的抗人HGF/DLL4双特异性抗体既能与HGF结合，还能与DLL4结合；进一步地，本发明公开的抗体具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。本发明的重组抗人HGF/DLL4双特异性抗体具有良好的抗肿瘤效果。

Description

重组抗HGF/DLL4双特异性抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种重组双特异性抗体、其制备方法和其在抗实体瘤上的作用。

背景技术

恶性肿瘤是人类疾病致死的一大原因，近年来由于环境恶化，生活压力大等原因，恶性肿瘤在我国的发病率更是年年攀升。恶性肿瘤的治疗手段目前仍主要为放疗、化疗和手术治疗，治疗效果并不理想。随着单克隆抗体技术的兴起，利用抗体进行生物靶向治疗由于其毒副作用小，有望特异性完全清除癌细胞等其他技术无可比拟的优点，展示了很大的发展空间。但是由于肿瘤异质性大，尤其不同种类的肿瘤其肿瘤表面抗原也大不相同，开发广谱的抗肿瘤抗体极具挑战。

实体瘤的恶化与转移依赖于新生血管的形成。控制血管新生在阻断肿瘤细胞转移的同时切断对已发生癌组织的血液供给，从而剥夺肿瘤生长依赖的氧气和营养，进而杀灭肿瘤细胞。目前市场上通过这一机制作用的抗体阿瓦斯汀（Bevacizumab,Avastin）取得了巨大成功，已连续多年成为“超级重磅炸弹”药品，2012年位列全球药物销售第八名。阿瓦斯汀通过抑制血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）而阻止新生血管的形成。因此，开发针对新靶点的抗肿瘤血管新生的抗体药物将能产生巨大的社会效益和经济效益。

原癌基因受体酪氨酸激酶c-MET被发现在很多癌组织中过量表达，其与配体肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）的结合可激活一系列的信号通路，从而促进肿瘤细胞的生长、增殖、入侵和凋亡抑制。研究表明，HGF-cMet信号通路通过诱导VEGF的上调并抑制血管生成抑制因子——凝血酶敏感蛋白1（thrombospondin1，TSP-1)的表达，极大地促进了肿瘤的血管新生[Zhang YW等，PNAS2003,100:12718-12723]。另外，HGF-cMet信号可上调Notch蛋白配体——Delta样配体4（Delta-like ligand4，DLL4）的表达，从而激活Notch-DLL4信号通路[Gao YF等，Chin Med J.2011,124:127-131]，而DLL4/Notch在脉管***发育的不同阶段均有表达，其对血管的发生发展有重要的调控作用。研究表明，在血管生成过程中，VEGF可通过诱导DLL4的表达来抑制血管上皮细胞的过度增生，阻断Notch-DLL4信号通路，可促进内皮萌芽、增加血管密度、产生大量无功能血管。在MV-522异种肿瘤移植模型中，对VEGF和DLL4的同时阻断可大大抑制肿瘤生长[Ridgway J等，Nature.2006,444:1083-1087]。

肿瘤干细胞（Cancer Stem Cell，CSC）是一种具有自我复制和分化成多种功能细胞能力的肿瘤细胞，在多种肿瘤类型中均证实了CSC的存在，CSC介导了肿瘤的起始形成，治疗抗性和转移后新型肿瘤的产生。有研究表明HGF-c-MET和Notch-DLL4信号均在肿瘤干细胞的干性维持中发挥重要作用[Levina V等，PLos One.2008,3:e3077;Gurney A等，Vascular Cell.2011,3:18],HGF通过诱导并激活Notch-DLL4信号通路而参与其中。特异阻断HGF-c-MET和Notch-DLL4信号通路将可以在抑制肿瘤血管新生的同时，亦能直接杀伤肿瘤干细胞或诱导肿瘤干细胞的凋亡和分化，从而彻底瓦解肿瘤组织。目前，AVEO公司针对HGF已开发了一种抗HGF抗体（Ficlatuzumab）用于治疗非小细胞肺癌，另外，针对Notch-DLL4信号通路也已有人开发了一种抗DLL4抗体（Enoticumab），但上述抗体均是单克隆抗，单一抗体只能抑制HGF-c-MET或Notch-DLL4单一信号通路。若将抗HGF抗体和抗DLL4抗体联合应用，在理论上可同时阻断HGF-c-MET和Notch-DLL4信号通路，进一步提高抗肿瘤治疗效果。但是，单抗联合应用存在调节障碍和造价太高的缺陷,限制了其临床应用。

因此，构建一个既能阻断HGF，又能阻断DLL4的双特性抗体，进而更有效的抑制肿瘤生长，一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个可以同时阻断HGF和DLL4两个靶点的双特异性抗体，即本发明所述的“重组抗HGF/DLL4双特异性抗体”，从而完成了本发明。

具体地，本发明公开了：

1.一种抗HGF/DLL4双特异性抗体，其特征在于，所述抗体既能与HGF结合，又能与DLL4结合。

2.上述1所述抗HGF/DLL4双特异性抗体，其特征在于，所述抗体氨基酸序列包含抗HGF单克隆抗体的可变区和抗DLL4单克隆抗体可变区序列。优选地，所述抗HGF/DLL4双特异性抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.上述1或2所述抗HGF/DLL4双特异性，其特征在于，所述双特异性抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.一种分离的核酸分子，其编码上述1-3任一所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体；优选地，所述核酸分子编码所述抗HGF/DLL4双特异性抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.一种表达载体，含有上述4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列；优选地，所述载体可以为pDR1、pcDNA3.1（+）、pDHFF或pCHO1.0载体，最优选为pCHO1.0载体。

6.一种宿主细胞，其含有上述5所述的载体。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选地，所述宿主细胞为COS、CHO、NS0细胞；最优选地，所述宿主细胞为CHO细胞。

7.一种制备上述1-3任一所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体的方法，所述方法包括步骤：

a)在表达条件下，培养上述6所述的宿主细胞，从而表达抗HGF/DLL4双特异性抗体；

b)分离或纯化所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体。

优选地，所述制备方法包括步骤：

a)构建抗HGF/DLL4双特异性抗体的轻链融合基因、重链融合基因；

b)将上述a)融合基因克隆到真核表达载体pCHO1.0,构建真核表达载体pCHO1.0（anti-HGF/DLL4）；

c）将上述b)构建的表达载体pCHO1.0（anti-HGF/DLL4）转染CHO细胞，筛选，进行亚克隆，将筛选得到的高表达克隆用于扩大培养，

d）分离或纯化c）所述抗HGF/DLL4双特异性抗体。

8.一种组合物，含有上述1-3任一所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体和药学上可接受的载体。

9.上述1-3任一所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体或上述8所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.上述9所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pDHFF及pCHO1.0（如附图2）之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养***可用于本发明，例如COS,CHO,NS0，sf9及sf21等均可适用于本发明。可用的宿主细胞也可以为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21(DE3),TG1之一。

本发明中公开的抗HGF/DLL4双特异性抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双特异性抗体，分离或纯化所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体。

利用上述方法，可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

本发明公开的上述HGF/DLL4双特异性抗体是通过以下方法得到的：抗HGF抗体Ficlatuzumab（IgG1,κ）的V_L序列与V_H序列分别通过不同接头短肽与抗DLL4抗体Enoticumab（IgG1,κ）的N端相连接。更具体地，本发明的申请人通过大量实验，首先分别表达了抗HGF抗体的V_H和V_L片段基因，及抗DLL4抗体的重链和轻链全长基因。在此基础上利用Overlap PCR将抗HGF抗体V_H片段通过连接短肽与抗DLL4抗体的重链连接，抗HGF抗体V_L片段通过另一连接短肽与抗DLL4抗体的轻链连接，进一步将上述融合后的轻链和重链基因克隆到真核表达载体pCHO1.0中，构建成真核表达载体pCHO1.0（anti-HGF/DLL4）。将此表达载体通过脂质体法转染CHO细胞，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用protein A亲和柱分离纯化抗HGF/DLL4双特异性抗体。

本发明的申请人对上述的抗HGF/DLL4双特异性抗体进行了体外、体内生物学实验。体外生物学实验结果表明此抗体能很好地与DLL4和HGF结合。本发明的申请人对上述的抗HGF/DLL4双特异性抗体进行亲和力检测、抑制HUVEC细胞增殖、蛋白药代动力学实验、体内抑瘤等实验，实验结果表明，本发明公开的抗HGF/DLL4双特异性抗体可以同时结合HGF和细胞膜表面DLL4，阻断两者的信号传导通路。一方面，它能够阻断肿瘤中功能性新生血管的形成、减少肿瘤的供血和供氧，限制肿瘤的生长。另一方面，它同时能阻抑肿瘤干细胞的干性维持，使细胞分化成终末分化细胞从而对杀伤敏感，产生更强的抗肿瘤治疗疗效。此外，本发明的抗HGF/DLL4双特异性抗体与Ficlatuzumab或Enoticumab相比，其半衰期明显延长，而且在相等剂量下，本发明的抗HGF/DLL4双特异性抗体具有比单独应用Ficlatuzumab或Enoticumab更好的抗肿瘤效果。

本发明公开上述抗HGF/DLL4双特异性抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的融合受体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述抗HGF/DLL4双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使抗HGF/DLL4双特异性抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂包括但不限于：糖类，可以是还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，可以是谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，可以是三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一；缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含HGF/DLL4双特异性抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明所指的肿瘤，包括但不限于：腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、***、***、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经***的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌***肿瘤、胃肠道胰腺内分泌***肿瘤，生殖***肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。优选肺癌。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或***的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止转移。

本发明中抗HGF/DLL4双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天。

本发明公开的抗HGF/DLL4双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物（1）作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素（MMC）；（2）影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX）和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5FU、FT－207、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤（6－MP）和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（HU）等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Ara-C）和健择（Gemz）等；（3）作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；（4）主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；（5）其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗***：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素－2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)；Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin)；5、其他包括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的抗HGF/DLL4双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

附图说明

图1抗HGF/DLL4双特异性抗体结构示意图

图2pCHO1.0结构示意图

图3抗HGF/DLL4双特异性抗体阻止HGF引起的HUVEC细胞增殖抑制作用

图4抗HGF/DLL4双特异性抗体和DLL4的亲和力试验结果图

图5抗HGF/DLL4双特异性抗体的ADCC效应试验结果图

图6抗HGF/DLL4双特异性抗体抑制肿瘤生长试验结果图

具体实施方式

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为是对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因***到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.（1989）Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2^nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press.

实施例1抗DLL4/HGF双特异性抗体的基因构建与表达

根据who.int公布的抗HGF单克隆抗体Ficlatuzumab（IgG1，κ）序列（参见WHO DrugInformation Vol.25,No.2,2011.p171），比对人IgG1的恒定区序列分析获得其VH和VL片段。同时，根据who.int公布的抗DLL4单克隆抗体Enoticumab（IgG1，κ）氨基酸序列（参见WHODrug Information Vol.27,No.1,2013.p55），经过密码子优化后全基因合成核苷酸序列。采用Overlapping PCR的方法将Ficlatuzumab的VH片段通过（ASTKGP）接头与Enoticumab重链的N端融合；将VL片段通过（TVAAP）接头与Enoticumab轻链的N端融合。接头片段分别来自于人IgG1 CH1或Cκ的N端序列。重链Overlapping PCR的引物为（有义引物1：CAGGTGCAGCTGGTGCAGCC；反义引物1：CTTTCCACCAGCTGCACCTGCGGGCCTTTGGTGCTCGCGCTGCTCACGGTCAGCAGGGTGCCC；有义引物2：CCCTGCTGACCGTGAGCAGCGCGAGCACCAAAGGCCCGCAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCG；反义引物2：GCCCGGGCTCAGGCTCAGGCTTT）。轻链Overlapping PCR的引物为（有义引物1：CAGGTGCAGCTGGTGCAGCCGGG；反义引物1：CTCTGGGTCAGCACAATTTCCGGCGCCGCCACGGTCAGTTTGGTGCCCTGGCCAAAGGTA；有义引物2：TTGGCCAGGGCACCAAACTGACCGTGGCGGCGCCGGAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGG；反义引物2：GCATTCGCCGCGGTTAAAGCTTT）。构建获得的抗DLL4/HGF双特异抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、重链氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示、重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链核苷酸如SEQ ID NO:3所示、轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。附图1展示了获得的抗DLL4/HGF双特异抗体结构示意图（其中，VH1为原Ficlatuzumab重链可变区序列，VH2为原Enoticumab的重链可变区序列，CH1-CH2-CH3为原Enoticumab的重链恒定区序列，VL1为原Ficlatuzumab轻链可变区序列，VL2为原Enoticumab的轻链可变区序列，CL为原Enoticumab的轻链恒定区序列）。将PCR产物克隆到pCHO1.0表达载体（购自Lifetechnologies公司），测序验证确认获得了正确的克隆载体标记为pCHO1.0（anti-HGF/DLL4）。同时，用同样的方法将Ficlatuzumab或Enoticumab基因克隆到pCHO1.0中，正确的克隆载体分别标记为pCHO1.0（anti-HGF）与pCHO1.0（anti-DLL4）。

将上述三种载体pCHO1.0（anti-HGF/DLL4）、pCHO1.0（anti-HGF）、pCHO1.0（anti-DLL4）分别瞬时转染至人胚胎肾细胞293细胞系，培养数天后，利用Protein A亲和层析柱（Pharmacia公司）从细胞培养上清中纯化抗体蛋白。蛋白的定量通过BCA(Bicinchoninicacid)方法进行。纯化得到的抗DLL4/HGF双特异抗体、Ficlatuzumab、Enoticumab样品用于以下的进一步分析与研究。

实验例2SDS-PAGE和Western-blot检测抗DLL4/HGF双特异抗体

纯化后的抗DLL4/HGF双特异抗体、Ficlatuzumab、Enoticumab分别在非还原（6%）和还原（12%）条件下用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其纯度和分子量大小，同时通过Western-blot进一步鉴定其性质和分子量。Western-blot方法如下：将电泳后的胶通过电转移的方法转移至PVDF膜上，封闭后加入HRP标记的羊抗人IgG（H+L），PBST洗两遍，最后DAB法显色。聚丙烯酰氨凝胶电泳和Western-blot的结果显示：在还原条件下，Ficlatuzumab、Enoticumab均呈现为分子量大小约55KDa和25KDa的重链和轻链，而抗DLL4/HGF双特异性抗体呈现为分子量大小约64KDa（重链）和36KDa（轻链）。在非还原条件下，所有抗体均呈现一条带，它们的大小分别为160KDa（Ficlatuzumab）、162KDa（Enoticumab）和200KDa（抗HGF/DLL4双特异性抗体）。同时，在非还原条件下，利用抗Fc抗体或者抗κ抗体（均购自：Sigma）并未检测到有异常分子碎片的存在（如单独重链，单独轻链，或者重链复合物等）。

实施例3抗DLL4/HGF双特异抗体与HGF结合能力的鉴定

抗DLL4/HGF双特异抗体与HGF的结合通过Biacore3000（购自GE公司）进行检测。将HGF（购自R&D公司）以不同浓度包被在Biacore3000的芯片上后，检测其亲和力，母抗体Ficlatuzumab做为对照。结果如表1所示，可见抗DLL4/HGF双特异性抗体对HGF的亲和力与母抗体Ficlatuzumab相似。

表1，抗DLL4/HGF双特异抗体对HGF的亲和力

抗DLL4/HGF双特异抗体对HGF的结合活性通过人脐静脉内皮细胞（HumanUmbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC）的增殖实验进行检测。生长状态良好的传代HUVEC（购自：ATCC公司）接种到96孔板中，2天后，50ng/ml的人HGF和不同浓度的抗DLL4/HGF双特异抗体(0.03nm-1000nm)加入到培养的细胞中，每个浓度梯度设置3个复孔。3天后，利用MTT方法检测细胞的增殖。实验结果如附图3所示，本发明的抗DLL4/HGF双特异抗体其抑制HGF介导的HUVEC增殖的能力与母抗体Ficlatuzumab相当。

实施例4抗DLL4/HGF双特异抗体与DLL4DLL4-HGF双靶标的结合力

抗DLL4/HGF双特异抗体与DLL4的亲和力亦通过Biacore3000检测，将不同浓度的DLL4（购自：R&D公司）包被在Biacore3000的芯片上后，检测其亲和力，母抗体Enoticumab做为对照。实验结果见表2，结果表明本发明的抗DLL4/HGF双特异抗体与DLL4的亲和力仍保持在较高水平，与母抗体Enoticumab相差很小。

表2，抗DLL4/HGF双特异抗体对人DLL4的亲和力

我们首先用透析标记法标记抗HGF/DLL4双特异性抗体：用0.025M pH9.5的碳酸盐缓冲液将预标记的抗HGF/DLL4双特异性抗体稀释成1％浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将荧光素Fluorescein isothiocyanate（FITC）（购自：Sigma）配成0.1mg/ml的溶液盛于小烧杯中，使抗HGF/DLL4双特异性抗体透析袋浸没于FITC溶液中，在4℃避光搅拌24小时，然后取出透析袋中标记液，用Sephadex G-50（购自GE公司）过柱，去除游离荧光素，收集荧光抗体备用。利用此标记抗体和转染了DLL4质粒的293细胞（购自：ATCC），流式细胞术检测抗HGF/DLL4双特异性抗体结合DLL4的能力。1×10⁶DLL4-293细胞与2μg/ml抗HGF/DLL4双特异性抗体于4℃孵育30分钟，PBS洗两遍后，用流式细胞术检测细胞的FITC荧光强度。同时，为了检测抗HGF/DLL4双特异性抗体与HGF的结合是否会阻碍抗HGF/DLL4双特异性抗体对DLL4的识别，我们另设一HGF过量实验组。在此组中，除了DLL4-293细胞系和抗HGF/DLL4双特异性抗体外，另外加入1mg/ml HGF（购自：R&D公司）。实验结果如附图4所示，实验结果表明，本发明的抗HGF/DLL4双特异性抗体可正常识别转染表达DLL4的293细胞，而且这种识别不会受HGF结合的干扰。

实施例5抗HGF/DLL4双特异性抗体的ADCC效应

抗HGF/DLL4双特异性抗体的抗体依赖的细胞介导的毒性作用（antibodydependent cell mediated cytotoxicity,ADCC）通过转染了人DLL4的大鼠胶质瘤细胞系进行测定。

大鼠胶质瘤细胞系C6（购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库）。我们在此细胞株中转染人全长DLL4。1×10⁴DLL4-C6细胞在96孔板中与不同浓度的抗HGF/DLL4双特异性抗体(0.0001μg/ml-0.4μg/ml)孵育10分钟，母抗体Enoticumab作为对照。同时，为观察在过量HGF存在时抗HGF/DLL4双特异性抗体是否仍能有效结合DLL4杀伤靶细胞，我们在培养体系中加入1mg/ml的HGF（购自：R&D公司）。效应细胞外周血单个核细胞通过Ficoll密度梯度离心分离自新鲜人外周血，并以3×10⁵/孔的浓度加入至实验孔。37度孵育4小时后通过乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)细胞毒性检测试剂盒（Promega公司产品）检测杀伤情况。实验结果如附图5所示，抗HGF/DLL4双特异性抗体保持了其母抗体Enoticumab的ADCC活性，在有过量HGF存在情况下，其细胞杀伤能力与Enoticumab无显著性差异。

实验例6抗HGF/DLL4双特异性抗体在CHO细胞中的表达

通过脂质体法将pCHO1.0（anti-HGF/DLL4）载体转染至CHO-S细胞系(Lifetechnologies公司产品)，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。利用人IgGELISA检测培养液上清中抗体浓度：5μg/ml的羊抗人IgG Fc抗体（Sigma)包被于ELISA板，4℃过夜，2%牛血清白蛋白37℃封闭2小时。加入培养液上清或标准品（人IgG1）37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗人IgG（PIERCE）进行结合反应，37℃孵育1小时,加入TMB显色液37℃反应10分钟，然后用2M H₂SO₄终止显色，测A₄₅₀值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用protein A亲和柱分离纯化抗HGF/DLL4双特异性抗体。

实施例7抗HGF/DLL4双特异性抗体肿瘤抑制能力

人肺癌细胞系MV-522（购自ATCC）。1×10⁶细胞接种于6-8周裸鼠的右侧皮下。当肿瘤长至≥250mm³时，开始给予本发明的抗HGF/DLL4双特异性抗体治疗，无关同型抗体IgG1（购自：Sigma）、Ficlatuzumab、Enoticumab、Ficlatuzumab+Enoticumab这4组作为对照。5组抗体均以10mg/kg，一周一次腹腔注射的方式进行给药。小鼠每周进行肿瘤体积的测量，肿瘤体积大小的计算方式为：V=0.5ab²（a为肿瘤实体最长直径，b为肿瘤实体最短直径）。实验结果如附图6所示，接受抗HGF/DLL4双特异性抗体的小鼠其肿瘤体积显著小于Ficlatuzumab或Enoticumab，其对肿瘤的抑制能力与联合应用Ficlatuzumab与Enoticumab相当。

另外，本发明的申请人还对其它肿瘤细胞（例如：BGC-823胃癌细胞株小鼠成瘤模型、MDA-MB-231乳腺癌细胞株小鼠成瘤模型、人胶质母细胞瘤细胞系U87-MG小鼠成瘤模型等等）进行类似实验，实验结果均表明，本发明的抗HGF/DLL4双特异性抗体可有效地抑制肿瘤的生长，具有良好的抗肿瘤效果。

Claims (8)

1.一种抗HGF/DLL4双特异性抗体，既能与HGF结合，又能与DLL4结合，其特征在于，所述抗HGF/DLL4双特异性抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.权利要求1所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体，其特征在于，所述抗HGF/DLL4双特异性抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。

3.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-2任一所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体，所述核酸分子编码所述抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种表达载体，含有权利要求3所述的核酸分子和与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列；所述载体为pDR1、pcDNA3.1(+)、pDHFF或pCHO 1.0载体。

5.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的载体，所述宿主细胞为COS、CHO、NS0细胞。

6.一种制备权利要求1-2任一所述的抗HGF/DLL4双特异性抗体的方法，所述方法包括步骤：

a)在表达条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达双特异性抗体；

b)分离并纯化所述的双特异性抗体。

7.一种组合物，含有权利要求1-2任一所述的抗体和药学上可接受的载体。

8.权利要求1-2任一所述的抗体或权利要求7所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途；所述用途还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。