CN106434499B - 一种放线菌菌株kn37及其应用 - Google Patents

一种放线菌菌株kn37及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体公开一种放线菌菌株KN37及其应用。通过显微观察和16S rDNA序列分析，将分离得到的放线菌菌株KN37鉴定为链霉菌属，其保藏编号为CGMCC No.13160。菌株KN37的发酵液对葡萄灰霉病菌、番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌、番茄叶霉病菌等多种植物病原菌具有较好的抑制作用，可制备用于防治农作物病害的微生物药剂。

Description

一种放线菌菌株KN37及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物及其应用，具体涉及一种隶属于链霉菌属的放线菌菌株KN37，以及其在抑制多种农作物病原菌的应用。
背景技术
新疆优越的自然条件使其在农产品生产方面具有先天的优势。种植业是新疆农业中的主要产业，占农业总产值的76％，是增加农业收入的主要来源。新疆种植作物主要包括粮食类、油料类、棉花类、蔬菜类、瓜果类和其他经济作物。然而，植物病害严重威胁着农作物的正常生产，几乎每种农作物都受到多种病原真菌的危害。据统计，全世界每年因植物病害造成的经济损失高达20000亿美元，其中仅蔬菜作物一项每年的经济损失就可达到2000亿美元。
我国每年因植物病害造成的损失也是难以计数的，尤其是新疆地区。如新疆棉花每年因病害损失皮棉约36万吨，市价约70亿元。植物病害造成新疆地区加工番茄的损失同样巨大，每年造成经济损失达30亿元之多。因此，植物病害的防治一直以来都是困扰农业生产的一大难题。
近些年，化学农药的大量使用导致农产品出口受限、抗药性、环境污染等问题的产生。因此，开发新型高效、广谱、低毒、环保的杀菌剂(微生物药剂)一直是当今农药研究的难点和热点。
发明内容
本发明提供一种放线菌菌株KN37，菌株KN37的发酵液可抑制多种农作物病原菌，可用于开发成新型高效、广谱、低毒、环保的微生物杀菌剂。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种放线菌菌株KN37，是发明人在新疆喀纳斯地区采集的土壤中分离得到的一种放线菌。该菌株(生物材料)的保藏信息为：
名称：Streptomyces sp.KN37，以下简称为KN37；
保藏编号：CGMCC No.13160；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏时间：2016年10月27日。
本发明通过16S rDNA序列方法对菌株KN37进行了分类鉴定。提取此菌的DNA，扩增16S rDNA的序列。从菌株KN37与链霉菌已有效发表种16S rDNA序列构建出的***发育树可以获知，菌株KN37归属于链霉菌属。
进一步地，本发明给出了菌株KN37的种子培养基及其培养条件。其培养条件为：在28℃、120rpm条件下，在培养基中摇床培养36h；所述培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化钠6g/L、pH值7.4。
同时，本发明还结合形态学特征对菌株KN37进行了分类鉴定。将菌株KN37接种在培养基上，呈现的形态学特征为：菌落绒毛状，菌落的颜色为白色，在培养基中基内菌丝无横隔、不断裂，气生菌丝生长旺盛，孢子柱形，表面光滑，不产生可溶性色素。
结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA的鉴定结果，本发明所述放线菌菌株KN37隶属于链霉菌属，因而本专利申请发明人将其命名为Streptomyces sp.KN37。
另一方面，本发明还给出了所述放线菌菌株KN37在生产广谱抗菌活性物质的用途。
所述广谱抗菌活性物质来源于菌株KN37经液体发酵培养后的发酵液，所述发酵培养条件为：在28℃、180rpm条件下摇床培养7d；培养基组成为：1％豆粉浸汁1L、葡萄糖10g、蛋白胨3g、氯化钠2g、碳酸钙2g，pH自然。
根据试验数据，所述菌株KN37的发酵液可抑制多种农作物病原菌。
优选地，所述菌株KN37的发酵液用于抑制葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)的生物活性。
鉴于放线菌菌株KN37发酵液的生物活性，所述菌株KN37的发酵液制备用于防治农作物病害的微生物药剂，即本发明所述杀菌剂。
与现有技术相比，本发明至少具有下述的有益效果或优点：
(1)本发明提供一种新的放线菌菌株KN37。该菌株可作为研制高效、广谱、低毒、环保的微生物杀菌剂的生物材料，菌株KN37的发酵液能够直接用于杀菌物质抑制多种农作物病原菌。尤其是，菌株KN37的发酵液对葡萄灰霉病菌、番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌、番茄叶霉病菌具有较好的抑制作用。
(2)本发明优化了菌株KN37种子培养基及其培养条件。其培养条件为：在28℃、120rpm条件下，在培养基中摇床培养36h；所述培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化钠6g/L、pH值7.4。
(3)本发明给出了菌株KN37具有杀菌活性的发酵液的制备条件。其发酵培养条件为：在28℃、180rpm条件下摇床培养7d；培养基组成为：1％豆粉浸汁1L、葡萄糖10g、蛋白胨3g、氯化钠2g、碳酸钙2g，pH自然。
附图说明
图1是本发明所述放线菌菌株KN37的菌落形态图。
图2是本发明所述放线菌菌株KN37与相关种16S rDNA序列的***发育树。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。
实施例1：菌株KN37的分离和鉴定
(1)放线菌菌株KN37是从新疆喀纳斯地区采集的土壤中分离得到一种放线菌。该菌株KN37的种子培养条件为：在28℃、120rpm条件下，在培养基中摇床培养36h；所述培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化钠6g/L、pH值7.4。
(2)采用16S rDNA基因测序法对放线菌菌株KN37进行分类鉴定。
16S rDNA序列测定委托上海生工生物工程股份有限公司进行。具体测序方法如下：用溶菌酶法从新鲜菌体中提取基因组DNA，采用通用引物(27F和1492R)进行16S rDNA扩增，PCR产物经检测后测序。
经测定，该菌株KN37的16S rDNA序列如下所示：
ACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACACGCTCAGGCATCTGAGTGTGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGA
从菌株KN37与链霉菌已有效发表种16S rDNA序列构建出的***发育树(图2)可以看出：菌株KN37与参比菌株的16S rDNA序列相似性介于98～99％之间，与Streptomyceskanamyceticus的***发育关系最为密切，其之间的序列相似性为99％，这与目前属的界定中16S rDNA序列相似性不低于95％的标准相符合。但该菌株在***进化树上不与任何已知菌种相聚，而是以较高的进化差异独立成枝，说明该菌株与所有参比模式菌株在进化上均存在较大差异。
(3)放线菌菌株KN37的形态鉴定
菌株KN37在大多数培养基上生长良好(见表1)，在高氏培养基上菌落绒毛状，白色(图1)，基内菌丝无横隔，不断裂，气生菌丝生长旺盛，孢子柱形，表面光滑。KN37菌株在各个培养基上均无可溶性色素产生。
表1，菌株KN37的培养特征
培养基 基内菌丝 气生菌丝 菌落生长情况
淀粉甘油培养基 白色 白色 +
PDA培养基 白色 白色 +++
ISP4培养基 白色 白色 +++
察氏培养基 白色 白色 +
ISP5培养基 白色 白色 +++
LB培养基 浅黄色 浅黄色 +++
牛肉膏蛋白胨培养基 白色 乳白色 ++
Bennett培养基 白色 白色 +++
高氏一号培养基 浅黄色 白色 +++
注：++为正常生长；+为生长状况较差；+++为生长旺盛。
菌株KN37的生理生化特性和碳源利用情况如下：菌株KN37明胶液化和硝酸盐还原反应均为阳性；菌株KN37可利用葡萄糖、D-核糖、蔗糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、鼠李糖、***糖和纤维素作为唯一碳源，但不能利用D-果糖和肌醇。
实施例2：菌株KN37的生物活性及其应用
(1)菌株KN37对病原菌的抑制活性
利用生长速率法测定菌株KN37发酵液对番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、番茄叶霉病菌、番茄晚疫病菌、番茄细菌性斑点病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、辣椒疫霉病菌、苹果炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、白菜黑斑病菌、玉米小斑病菌、烟草赤星病菌、稻瘟病菌、根腐病菌、立枯病菌等多种病原菌的抑制活性。结果参见表2所示，菌株KN37对大多病原菌均具有很好的抑制效果(表2)。
表2，菌株KN37发酵液对18种病原菌的抑制作用
病原菌 抑制率％ 病原菌 抑制率％
番茄灰霉病菌 90.26 棉花黄萎病菌 64.88
番茄早疫病菌 72.66 辣椒疫霉病菌 72.07
番茄叶霉病菌 74.02 苹果炭疽病菌 88.89
番茄晚疫病菌 85.98 黄瓜炭疽病菌 85.06
番茄细菌性斑点病菌 91.67 油菜菌核病菌 97.85
棉花枯萎病菌 50.62 小麦赤霉病菌 73.76
水稻纹枯病菌 35.79 白菜黑斑病菌 58.91
玉米小斑病菌 42.67 烟草赤星病菌 51.32
稻瘟病菌 69.42 根腐病菌 86.33
(2)菌株KN37发酵液对番茄灰霉病的防治效果
利用组织法测定KN37对番茄灰霉病的防治效果，结果参见表3显示，菌株KN37发酵液对番茄灰霉病具有很好的保护作用。
表3，菌株KN37发酵液对番茄灰霉病的保护和治疗效果
(3)菌株KN37发酵液对番茄病害的防治效果
KN37菌株发酵液施用于大棚内的番茄后，番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄晚疫病、番茄叶霉病、番茄细菌性病害的发生率和危害程度菌显著降低(表4)。
表4，菌株KN37发酵液对大棚番茄病害的防治效果
病害名称 防治效果％ 病害名称 防治效果％
灰霉病 62.72 早疫病 61.53
晚疫病 58.43 叶霉病 71.66
细菌性病害 55.25 根部病 70.84
根据本实施例结果表明，本发明所述的菌株KN37经过液体发酵培养，其发酵液中含有抑制常见农作物病原菌的物质，能够显著减轻病害的发生，有望开发成为一种新型的防治农作物病害的微生物药剂。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
序列表
<110>石河子大学
<120>一种放线菌菌株KN37及其应用
<160>1
<210>1
<211>
<212>RNA
<213>放线菌菌株KN37
<400>1
ACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACACGCTCAGGCATCTGAGTGTGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGA

Claims (9)

1.一种放线菌菌株(Streptomyces sp.)KN37，该菌株于2016年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13160。
2.根据权利要求1所述放线菌菌株KN37，其特征在于，所述菌株KN37归属于链霉菌属。
3.根据权利要求1所述放线菌菌株KN37，其特征在于，所述菌株的形态学特征描述为：菌落绒毛状，菌落的颜色为白色，在培养基中基内菌丝无横隔、无断裂，气生菌丝生长旺盛，孢子柱形，表面光滑，无可溶性色素产生。
4.根据权利要求1所述放线菌菌株KN37，其特征在于，所述菌株的种子培养条件为：在28℃、120rpm条件下，在培养基中摇床培养36h；所述培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化钠6g/L、pH值7.4。
5.权利要求1～4中任一项所述放线菌菌株KN37在生产广谱抗菌活性物质的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述广谱抗菌活性物质来源于菌株KN37经液体发酵培养后的发酵液，所述发酵培养条件为：在28℃、180rpm条件下摇床培养7d；培养基组成为：1％豆粉浸汁1L、葡萄糖10g、蛋白胨3g、氯化钠2g、碳酸钙2g，pH自然。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述菌株KN37的发酵液可抑制多种农作物病原菌。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述菌株KN37的发酵液用于抑制葡萄灰霉病菌、番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌、番茄叶霉病菌的生物活性。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述菌株KN37的发酵液制备用于防治农作物病害的微生物药剂。
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