CN104946625B - 一种基于乳液pcr的测序模板的制备方法 - Google Patents
一种基于乳液pcr的测序模板的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104946625B CN104946625B CN201510300255.4A CN201510300255A CN104946625B CN 104946625 B CN104946625 B CN 104946625B CN 201510300255 A CN201510300255 A CN 201510300255A CN 104946625 B CN104946625 B CN 104946625B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- emulsion
- preparation
- pcr
- sequencing template
- based pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于乳液PCR的测序模板的制备方法。包括文库的获得，乳液PCR，破乳和文库微球的富集回收。乳液PCR在扩增过程中，退火时间在4分钟以上，破乳选自二丁醇、异丙醇和正己烷。引发剂为偶氮二异丁腈和硫酸亚铁。助表面活性剂选自聚乙二醇和丙三醇。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于乳液PCR的测序模板的制备方法。
背景技术
PCR是一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法。乳液PCR技术利用油包水结构作为PCR反应的微反应器，进行PCR扩增，乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行PCR扩增，其关键技术是在PCR反应前，将包括PCR所有的反应成分的水溶液注入到高速旋转的油相表面，形成无数的小水滴。
利用乳液PCR的特点，在乳液制备或城中使每个微球反应液滴中只含有一个分子的测序文库和相应的扩增组分，一次来获得高效的单分子多拷贝测序模板微球，为下一步测序过程中获得更好的测序信号和数据提供了保障。基于油包水的乳液***提出一个扩增复杂DNA混合物的方案，目标分子被分割在微小的乳液液滴中并进行分别扩增，这种方法能够在低浓度目标DNA和大量的PCR循环条件下进行。现有技术中存在几点问题，首先是乳液体系不稳定，乳液体系若不稳定，不仅降低了乳液扩增成功的几率，同时增加了试验成本，浪费了时间。其次是乳液体系液滴中，单克隆的含量比例较低，增加单克隆比例不但能提高模板的制备效率，同时也能缩短时间，降低成本。最后是磁珠的富集效率较低。所以急需建立一种新的测序模板。
发明内容
本发明的一个目的是一种基于乳液PCR的测序模板的制备方法，包括以下步骤：
（1）DNA文库的获得；
（2）乳液PCR；
（3）破乳；
（4）DNA文库微球的富集回收。
所述乳液PCR在扩增过程中，退火时间在3.5分钟以上，优选为4分钟以上。
所述破乳采用二丁醇、异丙醇和正己烷中的一种或几种。
所述乳液PCR的反应体系中包括水相、油相、引发剂、表面活性剂与助表面活性剂。
所述水相与油相的体积比为4:9-4:7，优选为8:17。
所述油相为DC5225C、PGFE、DC193、DC556和矿物油中的1种或几种，优选为DC5225C、DC193和DC556。
所述引发剂为偶氮二异丁腈和硫酸亚铁。
所述表面活性剂为span80、TritonX-100、tween80 、tween60和tween20中的一种或几种，优选为span80、TritonX-100、tween80 和tween60；在微乳液制备时，span80、tween80、tween60和tween20溶于油相，TritonX-100溶于水相。
所述表面活性剂占体系的体积比为span80 2.5-5%，TritonX-100 0.4-1.0%，tween80 0.2-0.5%，tween60 0.3-0.5%、tween20 0.2-0.8%；优选为span80 2.5-3.5%，TritonX-100 0.7-0.9%，tween80 0.3-0.4%，tween60 0.4-0.5%和 tween20 0.4-0.7%。
所述助表面活性剂为聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一种或几种。
所述水相中包括emPCR助剂、扩增液、引物、DNA聚合酶、dNTP、PPiase（肽脯氨酰顺反异构酶）、MgCl2和水；所述emPCR助剂 包括betaine（甜菜碱）、D-(+)trehalose（右旋海藻糖）、L-carnitine（左旋肉碱）、NP-40（乙基苯基聚乙二醇)、DTT(二硫苏糖醇)、formamide（甲酰胺）和DMSO(二甲基亚砜)中的一种或几种，优选为betaine、D-(+)trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT、formamide和DMSO；占体系的比例为Betaine 0.4-1.0M，D-(+)trehalose 0.2-0.5M，L-carnitine 0.1-0.4M，NP-40 0.2-0.6%，DTT 1-2.5mM，formamide0.1-0.2%，DMSO 1-2.5%（其中的百分含量为体积比）。
本发明的制备方法操作简单，非常有利于大规模应用。有以下优点：使用的油相、水相表面活性剂以及助表面活性剂使配制的乳液体系非常稳定，乳液扩增的效率高，错配率低，提高了乳液扩增的成功率，降低了实验成本，节省了人力物力成本。乳液体系中，液滴的单克隆比例含量高，单克隆比例的增加显著了提高了乳液扩增的效率。同时，磁性微球的富集效率高。引发剂的选择进一步改善了乳液的乳化效果。
具体实施方式
实施例1
1.DNA文库的获得
（1）对基因组DNA进行片段化，连接接头，处理后得到单链DNA文库；
（2）将清洗后的微球分装至2ml EP管中；
（3）在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μL，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
2. 乳液PCR
（1）配制油相，混合DC5225C 550μL、DC193 500μL和DC556 1200μL。
（2）配制水相，加入
10x扩增液 100μL
10μM引物1 120μL
25μM引物2 40μL
DNA聚合酶 80μL
dNTP 120μL
PPiase 2μL
MgCl2(1M) 30μL
emPCR助剂 350μL
双蒸无菌水 余量
总计 1000μL
其中，emPCR助剂为Betaine 0.4M，D-(+)trehalose 0.5M，L-carnitine 0.1M，NP-40 0.2%，DTT 2.5mM，DMSO 1%。
（3）按占体系的体积比，将span80 2.5%，tween80 0.4%、tween20 0.7%和聚乙二醇0.4‰溶于油相，TritonX-100 0.4%溶于水相，混合。
（4）加入文库混合液、偶氮二异丁腈和硫酸亚铁，置于TissueLyser进行乳化。
（5）PCR扩增。
3.破乳
（1）采用二丁醇和正己烷破乳。
4. DNA文库微球的富集回收
（1）微球富集准备
a)微球悬液离心弃上清，加入0.15M NaOH振荡混匀，室温孵育3min。
b)离心弃上清，用500µl退火缓冲液离心清洗两次。
c)用30µl 退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75µl，振荡混匀。
d)退火：53℃孵育5min后迅速置于冰上2min。
e)用500µl磷酸盐缓冲液离心清洗两次，500µl磷酸盐缓冲液重悬。
（2）微球富集
a)取微球20µl, 磁力架吸附2min，弃上清。
b)用500µl磷酸盐缓冲液磁力架清洗两次，使用NaCl溶液清洗微球。
c) 使用20µl磷酸盐缓冲液重悬，振荡混匀后室温离心5min。
d)置于磁力架上2min，观察。
实施例2
1.DNA文库的获得
（1）使用Capture Bead Wash Buffer TW对磁性微球涡旋震荡，重复两次，5000rpm离心，除去上清；
（2）将清洗后的微球分装至2ml EP管中；
（3）在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μL，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
2. 乳液PCR
（1）配制油相，混合PGPE 450μL和DC556 1300μL。
（2）配制水相，加入
10x扩增液 100μL
10μM引物1 120μL
25μM引物2 40μL
DNA聚合酶 80μL
dNTP 120μL
PPiase 2μL
MgCl2(1M) 30μL
emPCR助剂 350μL
双蒸无菌水 余量
总计 1000μL
其中，emPCR助剂为Betaine 1.0M，D-(+)trehalose 0.2M，L-carnitine 0.4M，NP-40 0.6%，DTT 1mM，DMSO 2.5%。
（3）将span80 3.5%，tween80 0.3%、tween60 0.4%和丙三醇0.35‰溶于油相，TritonX-100 0.7%溶于水相，混合。
（4）加入文库混合液、偶氮二异丁腈和硫酸亚铁，置于TissueLyser进行乳化。
（5）PCR扩增。
3.破乳
（1）收集乳化液，使用正己烷破乳。
4. DNA文库微球的富集回收
（1）微球富集准备
a)微球悬液离心弃上清，加入0.1M NaOH振荡混匀，室温孵育3min。
b)离心弃上清，用500µl退火缓冲液离心清洗两次。
c)用30µl 退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75µl，振荡混匀。
d)退火：53℃孵育6min后迅速置于冰上2min。
e)用500µl磷酸盐缓冲液离心清洗两次，500µl磷酸盐缓冲液重悬。
（2）微球富集
a)取微球20µl, 磁力架吸附2min，弃上清。
b)用500µl磷酸盐缓冲液磁力架清洗两次，使用盐溶液清洗微球。
c) 使用20µl磷酸盐缓冲液重悬，振荡混匀后室温离心5min。
d)置于磁力架上2min，观察。
实施例3
1.DNA文库的获得
（1）对基因组DNA进行片段化，连接接头，处理后得到单链DNA文库；
（2）将清洗后的微球分装至2ml EP管中；
（3）在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μL，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
2. 乳液PCR
（1）配制油相，混合DC5225C 300μL、PGFE 200μL、DC193 800μL、DC556 300μL和矿物油400μL。
（2）配制水相，加入
10x扩增液 100μL
10μM引物1 120μL
25μM引物2 40μL
DNA聚合酶 80μL
dNTP 120μL
PPiase 2μL
MgCl2(1M) 30μL
emPCR助剂 350μL
双蒸无菌水 余量
总计 1000μL
其中，emPCR助剂为Betaine 0.45M，D-(+)trehalose 0.4M，L-carnitine 0.15M，NP-40 0.3%，DTT 2.3mM，formamide 0.1%，DMSO 2.3%。
（3）按占体系的体积比，将span80 5%，tween80 0.2%、tween60 0.5%、tween200.2%和山梨醇0.4‰溶于油相，TritonX-100 0.9%溶于水相，混合。
（4）加入文库混合液，置于TissueLyser进行乳化。
（5）PCR扩增，反应程序如下：
① 98℃， 6min ；
② 98℃， 30s ；
③ 50℃， 3.5min ；
④ 69℃， 35s ；
步骤②至④共 50 个循环 ；
⑤ 4℃保存。
3.破乳
（1）收集乳化液，采用二丁醇破乳。
4. DNA文库微球的富集回收
（1）微球富集准备
a)微球悬液离心弃上清，加入0.1M NaOH振荡混匀，室温孵育3min。
b)离心弃上清，用500µl退火缓冲液离心清洗两次。
c)用30µl 退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75µl，振荡混匀。
d)退火：54℃孵育5.5min后迅速置于冰上2min。
e)用500µl磷酸盐缓冲液离心清洗两次，500µl磷酸盐缓冲液重悬。
（2）微球富集
a)取微球20µl, 磁力架吸附2min，弃上清。
b)用500µl磷酸盐缓冲液磁力架清洗两次，使用KCl溶液清洗微球。
c) 使用20µl磷酸盐缓冲液重悬，振荡混匀后室温离心5min。
d)置于磁力架上2min，观察。
实施例4
1.DNA文库的获得
（1）使用Capture Bead Wash Buffer TW对微球涡旋震荡，重复三次，4000rpm离心，除去上清；
（2）将清洗后的微球分装至2ml EP管中；
（3）在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μL，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
2. 乳液PCR
（1）配制油相，混合DC5225C 925μL和DC193 1200μL。
（2）配制水相，加入
10x扩增液 100μL
10μM引物1 120μL
25μM引物2 40μL
DNA聚合酶 80μL
dNTP 120μL
PPiase 2μL
MgCl2(1M) 30μL
emPCR助剂 350μL
双蒸无菌水 余量
总计 1000μL
其中，emPCR助剂为Betaine 0.90M，L-carnitine 0.35M，NP-40 0.5% ，formamide0.2%。
（3）按占体系的体积比，将聚乙二醇、丙三醇、tween80 0.4%和tween20 0.8%溶于油相，TritonX-100 1.0%溶于水相，混合。
（4）加入文库混合液、偶氮二异丁腈和硫酸亚铁，置于TissueLyser进行乳化。
（5）PCR扩增，反应程序如下：
① 94℃， 6min ；
② 94℃， 30s ；
③ 50℃， 4min ；
④ 69℃， 35s ；
步骤②至④共 50 个循环 ；
⑤ 4℃保存。
3.破乳
（1）采用二丁醇和异丙醇破乳。
4. DNA文库微球的富集回收
（1）微球富集准备
a)微球悬液离心弃上清，加入0.15M NaOH振荡混匀，室温孵育3min。
b)离心弃上清，用500µl退火缓冲液离心清洗两次。
c)用30µl 退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75µl，振荡混匀。
d)退火：57℃孵育5min后迅速置于冰上2min。
e)用500µl磷酸盐缓冲液离心清洗两次，500µl磷酸盐缓冲液重悬。
（2）微球富集
a)取微球20µl, 磁力架吸附2min，弃上清。
b)用500µl磷酸盐缓冲液磁力架清洗两次，使用NaCl溶液清洗微球。
c) 使用20µl磷酸盐缓冲液重悬，振荡混匀后室温离心5min。
d)置于磁力架上2min，观察。
实施例5
1.DNA文库的获得
（1）对基因组DNA进行片段化，连接接头，处理后得到单链DNA文库；
（2）将清洗后的微球分装至2ml EP管中；
（3）在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μL，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
2. 乳液PCR
（1）配制油相，量取矿物油 2125μL。
（2）配制水相，加入
10x扩增液 100μL
10μM引物1 120μL
25μM引物2 40μL
DNA聚合酶 80μL
dNTP 120μL
PPiase 2μL
MgCl2(1M) 30μL
emPCR助剂 350μL
双蒸无菌水 余量
总计 1000μL
其中，emPCR助剂为Betaine 1M。
（3）按占体系的体积比，将span80 5%、tween60 0.3%、聚乙二醇0.3‰、山梨醇0.1‰和丙三醇0.2‰溶于油相，将油相和水相混合。
（4）加入文库混合液，置于TissueLyser进行乳化。
（5）PCR扩增，反应程序如下：
① 95℃， 4min ；
② 95℃， 30s ；
③ 54℃， 4min ；
④ 68℃， 30s ；
步骤②至④共 20 个循环 ；
⑤95℃， 30s ；
⑥54℃， 20s ；
⑦68℃， 60s ；
步骤⑤至⑦共 10个循环 ；
⑧10℃保存。
3.破乳
（1）采用二丁醇和正己烷破乳。
4. DNA文库微球的富集回收
（1）微球富集准备
a)微球悬液离心弃上清，加入0.15M NaOH振荡混匀，室温孵育3min。
b)离心弃上清，用500µl退火缓冲液离心清洗两次。
c)用30µl 退火缓冲液重悬微球，加入富集引物3.75µl，振荡混匀。
d)退火：56℃孵育5min后迅速置于冰上2min。
e)用500µl磷酸盐缓冲液离心清洗两次，500µl NaCl溶液重悬。
（2）微球富集
a)取微球20µl, 磁力架吸附2min，弃上清。
b)用500µl磷酸盐缓冲液磁力架清洗两次，使用Tris-HCl清洗微球。
c) 使用20µl磷酸盐缓冲液重悬，振荡混匀后室温离心5min。
d)置于磁力架上2min，观察。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (13)
1.一种基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）DNA文库的获得；
（2）乳液PCR；
（3）破乳；
（4）DNA文库微球的富集回收；
所述乳液PCR的反应体系中包括水相、油相、引发剂、表面活性剂与助表面活性剂；
所述油相为以下四种中的一种：（1）DC5225C、DC193和DC556；（2）PGPE和DC556；（3）DC5225C、PGFE、DC193、DC556和矿物油；（4）DC5225C和DC193。
2.如权利要求1所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述乳液PCR在扩增过程中，退火时间在3.5分钟以上。
3.如权利要求2所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述乳液PCR在扩增过程中，退火时间为4分钟以上。
4.如权利要求1所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述破乳采用二丁醇、异丙醇和正己烷中的一种或几种。
5.如权利要求1所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述水相与油相的体积比为4:9-4:7。
6.如权利要求5所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述水相与油相的体积比为8:17。
7.如权利要求1所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述油相为DC5225C、DC193和DC556。
8.如权利要求1所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述引发剂为偶氮二异丁腈和硫酸亚铁。
9.如权利要求1所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为span80、TritonX-100、tween80 、tween60和tween20中的一种或几种；在微乳液制备时，span80、tween80、tween60和tween20溶于油相，TritonX-100溶于水相。
10.如权利要求9所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为span80、TritonX-100、tween80 和tween60。
11.如权利要求1所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述助表面活性剂为聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一种或几种。
12.如权利要求1所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述水相中包括emPCR助剂、扩增液、引物、DNA聚合酶、dNTP、PPiase、MgCl2和水；所述emPCR助剂包括betaine、D-(+)trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT、formamide和DMSO中的一种或几种。
13.如权利要求12所述的基于乳液PCR的测序模板的制备方法，其特征在于，所述emPCR助剂为betaine、D-(+)trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT和formamide。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510300255.4A CN104946625B (zh) | 2015-06-04 | 2015-06-04 | 一种基于乳液pcr的测序模板的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510300255.4A CN104946625B (zh) | 2015-06-04 | 2015-06-04 | 一种基于乳液pcr的测序模板的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104946625A CN104946625A (zh) | 2015-09-30 |
| CN104946625B true CN104946625B (zh) | 2016-10-26 |
Family
ID=54161690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510300255.4A Active CN104946625B (zh) | 2015-06-04 | 2015-06-04 | 一种基于乳液pcr的测序模板的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104946625B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107216989A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-09-29 | 上海小海龟科技有限公司 | 一种测序样本制备***及方法 |
| CN110305941A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-10-08 | 苏州锐讯生物科技有限公司 | 一种基于微流控技术获取单样本遗传信息的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102719528A (zh) * | 2012-04-27 | 2012-10-10 | 上海派森诺生物科技有限公司 | 一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法 |
-
2015
- 2015-06-04 CN CN201510300255.4A patent/CN104946625B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102719528A (zh) * | 2012-04-27 | 2012-10-10 | 上海派森诺生物科技有限公司 | 一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104946625A (zh) | 2015-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104946625B (zh) | 一种基于乳液pcr的测序模板的制备方法 | |
| CN102031390A (zh) | 一种含砷、含碳低品位难处理金矿提金工艺 | |
| CN104107762A (zh) | 一种耐低温型胶磷矿反浮选捕收剂及其制备方法 | |
| CN104878197B (zh) | 一种超声波辅助常压低温浸出钾的方法 | |
| CN104131160A (zh) | 一种难浸金矿超声强化浸出的方法及超声强化浸金搅拌器 | |
| CN102453494A (zh) | 超声强化超临界萃取油泥的方法 | |
| CN108003854A (zh) | 一种潜山裂缝性油藏用封窜剂及其注入方法 | |
| CN109433162A (zh) | 一种纤维素/氧化石墨烯/磁性二氧化钛高效环保吸附气凝胶的制备方法 | |
| CN106145732A (zh) | 使用弱酸加速微生物矿化碱性废弃物制备建材制品的方法 | |
| CN104830841A (zh) | 一种测序模板的制备方法 | |
| CN108913906B (zh) | 等离子体活化固废提取硅、铝和多种稀贵稀土金属的方法 | |
| Antonina | Non-reagent methods for the activation of concrete mix raw components in the construction industry | |
| CN102091712A (zh) | 一种三元复合驱污水处理过程中所产污泥的综合利用方法 | |
| CN101363084B (zh) | 一种石煤钠化焙烧提钒工艺 | |
| CN103964477A (zh) | 一种通过多级碳化降低赤泥铝硅比的方法 | |
| CN102895956A (zh) | 高磁响应粉煤灰微团及其制备方法和应用 | |
| CN105271298A (zh) | 一种超声辅助煤矸石合成4a沸石的方法 | |
| CN106044801A (zh) | 一种硝盐生产硫酸氢钠工艺 | |
| CN105696998A (zh) | 一种页岩气储层压裂改造方法 | |
| CN104928374B (zh) | 一种用于焦磷酸测序中emPCR的方法 | |
| CN104130223A (zh) | 利用菊粉类生物质生产5-羟甲基糠醛或乙酰丙酸的方法 | |
| CN102941159A (zh) | 一种从混盐中反浮选提取硼砂的方法 | |
| CN103305693A (zh) | 一种预防钒铬萃取分离过程界面污物的方法 | |
| CN102701231A (zh) | 利用卤水改善凹凸棒黏土胶体性能的方法 | |
| CA1119794A (en) | Method and installation for flooding petroleum wells and oil-sands |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |