CN102719528A

CN102719528A - 一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法

Info

Publication number: CN102719528A
Application number: CN2012101302669A
Authority: CN
Inventors: 孟和; 孙子奎; 陈永灿
Original assignee: SHANGHAI PERSONAL BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI PERSONAL BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2012-10-10

Abstract

本发明公开了一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法，其是在配制emPCR扩增混合液的过程中，将超纯水、5×扩增液、扩增引物、emPCR扩增混合液和PPiase的体积做了调整；在进行扩增反应时将扩增条件由一步扩增改为两步扩增。采用本发明所述emPCR的方法能够有效降低非特异性扩增信号，减少冗余的数据，使有效数据的产量提高30％，同时提高了实验效率，节约了实验成本。

Description

一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种PCR技术。更具体的说，本发明涉及一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法。

背景技术

焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须进行荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并通过光学***生成一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比，然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。

焦磷酸测序中所使用的模板需要通过一种称为emPCR的方法制备得到。目前基于焦磷酸测序原理的454高通量测序中的emPCR方法属于常规技术，并且市场上也有开发相对成熟的商品可以直接应用。例如采用罗氏公司推出的试剂盒——RocheGS Titanium LV emPCR Kit(Lib-L)v2，按其说明书记载的步骤操作，即可制得测序所需的emPCR产物。利用RocheGSTitanium LV emPCR Kit(Lib-L)v2试剂盒制备测序所用的emPCR产物的步骤如下：

1)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备，其中emPCR扩增混合液包括下列各组分：

2)DNA文库捕获；

3)乳化；

4)扩增，扩增反应的程序如下所示：

①94℃，4min；

②94℃，30s；

③60℃，10min；

步骤②至③共50个循环；

④10℃保存；

5)磁珠回收；

6)DNA文库磁珠富集；

7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物。

现有的这种基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法对于所构建的文库中片段大小的要求比较苛刻，如果片段大小差别过大，就会导致emPCR扩增出的磁珠上序列信号强度差异很大，进而影响后续测序时信号的读取效率及准确性，产生较多的冗余数据，使有效数据降低30％以上，同时造成试剂和实验时间的浪费，增加实验成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服上述基于焦磷酸原理的454高通量测序中的技术缺陷，提供一种新的用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之一是：一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法，其包括如下步骤：

1)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备；

2)DNA文库捕获；

3)乳化；

4)扩增；

5)磁珠回收；

6)DNA文库磁珠富集；

7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物；

其中，步骤1)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：emPCRAdditive，30.6％～43.0％(v/v)；5×扩增液，18.4％～21.5％(v/v)；扩增引物，2.0％～7.5％(v/v)；emPCR酶混合液，2.6％～5.9％(v/v)；PPiase，0.1％～0.3％(v/v)。上述各组分均为RocheGS Titanium LV emPCR Kit(Lib-L)v2试剂盒自带产品。

较佳的，emPCR扩增混合液包括下列各组分：emPCR Additive，38.4％(v/v)；5×扩增液，20.3％(v/v)；扩增引物，4.8％(v/v)；emPCR酶混合液，5.3％(v/v)；PPiase，0.2％(v/v)；余量为水。

本发明中，所述的水是本领域常规的用于测序的水，优选超纯水。

本发明中，所述的emPCR扩增混合液的总体积是本领域基于焦磷酸原理的454高通量测序中所采用的常规总体积，一般为930μl～980μl，本发明最佳的是937μL。

本发明的一较佳实例为，步骤1)所述的emPCR扩增混合液的总体积为937μL，包括下列各组分：360μLemPCRAdditive；180～200μL5×扩增液；35～55μL扩增引物；50μLemPCR酶混合液；2μLPPiase；其余为水。各组分含量如下表所示：

本发明的一最佳实例为，步骤1)所述的emPCR扩增混合液的总体积为937μL，包括下列各组分：290μL超纯水；360μLemPCRAdditive；190μL5×扩增液；45μL扩增引物；50μLemPCR酶混合液；2μLPPiase。各组分含量如下表所示：

较佳地，在本发明中，步骤4)所述扩增的反应程序如下所示：

①90-95℃，3-6min；

②93-95℃，28-32s；

③57-59℃，4-5min；

④66-70℃，28-32s；

步骤②至④共45-55个循环；

⑤4-10℃保存。

更佳地，扩增反应程序步骤②至④中循环数为48-52，最优选50。

更佳地，扩增反应程序步骤②至④为②94-95℃，28-32s；③57-58℃，4-5min；④67-69℃，28-32s；最优选②94℃，30s；③58℃，4.5min；④68℃，30s。

本发明的一最佳实例中，步骤4)所述扩增的反应程序为：

①94℃，4min；

②94℃，30s；

③58℃，4.5min；

④68℃，30s；

步骤②至④共50个循环；

⑤10℃保存。

本发明所述的用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法中，其他的步骤都采用本领域常规方法和条件，可参阅罗氏公司试剂盒RocheGSTitanium LV emPCR Kit(Lib-L)v2中的工作手册——《Roche，emPCRAmp-Lib L SV Method Manual_XL+_May2011》上所记载的方法。

本发明的emPCR方法用于基于焦磷酸原理的454高通量测序，所述的454高通量测序可以是454高通量转录组测序，也可以是454高通量基因组测序或者其他454高通量测序，优选454高通量转录组测序。

本发明的积极进步效果在于：本发明在配制emPCR扩增混合液的过程中，将emPCR Additive、5×扩增液、扩增引物、emPCR酶混合液和超纯水的用量做了优化调整；在进行扩增反应时对扩增程序进行了优化改良，由一步扩增改为两步扩增。采用本发明所述的emPCR方法能够有效降低非特异性扩增信号，减少冗余的数据，使有效数据的产量提高30％，同时提高了实验效率，节约了实验成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

本实施例采用本发明所述方法制备基于焦磷酸原理的454高通量测序所需的emPCR产物，所用试剂如无特别说明，均采用Roche GS Titanium LVemPCR Kit(Lib-L)v2试剂盒中的自带试剂，包括以下步骤。

1、乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备；

1)将乳化油放于TissueLyser tube架(Qiagen公司生产)上。

2)25Hz的频率震荡2min。

3)移走震荡完成的乳化油。

4)以4ml超纯水稀释1ml 5×Mock Amplification Mix，涡旋震荡制成1×浓度的工作液。

5)将震荡完成的乳化油按600μL/离心管分装到1.7ml离心管中。

6)向每管乳化油中加入290μL稀释后的MockAmplification Mix。

7)上下颠倒3次混匀，固定于TissueLyser(Qiagen公司生产)。

8)5Hz的频率震荡5min。

9)取下Emulsion管。

10)配制emPCR扩增混合液：根据Emulsion反应量配制emPCR扩增混合液。按下述顺序添加各组分，配制937μL的扩增混合液。涡旋振荡扩增液5s，并储存于冰上。

2、DNA文库捕获

1)加入9ml的超纯水，将1ml的10×Capture Bead Wash Buffer TW稀释至1×的工作液。

2)涡旋震荡DNA Capture Beads。

3)向1.7ml的离心管中按每个Emulsion反应80μL加入DNA CaptureBeads。

4)离心10s后，旋转180°后再次离心10s，沉淀珠子。

5)小心移去上清，注意不要碰到珠子。

6)加入1ml的1×Capture Bead Wash Buffer TW，涡旋震荡重悬珠子进行清洗，此步骤重复两次，离心后吸去上清。

7)将清洗后的Capture Beads分配至单个Emulsion反应的量：

a.用40×Emulsion反应数的量的Capture Bead Wash Buffer TW重悬每份DNA Capture Beads。

b.测量DNA Capture Beads悬浮液的总体积，然后均匀分配至1.7ml离心管中。

c.按照2中4)的方法和步骤沉淀珠子，吸除上清。

8)解冻需要扩增的DNA文库：

控制稀释的文库体积在1～15μL之间，PCR仪上加热变性DNA文库，95℃，2min，4℃保存。

9)计算所需的DNA文库的体积，并加入到清洗后的DNA CaptureBeads中。

方程式：

10)涡旋震荡5s，充分混匀得文库捕获混合液。

11)加入215μL扩增混合液至文库捕获混合液中，涡旋震荡。

3.乳化

1)吸取捕获好的文库(2制备)加入到Emulsion管中。

2)上下颠倒管架3次混匀后，置于TissueLyser。

3)15Hz震动5min。

4.扩增

4.1分配乳化试剂

1)乳化后，将emPCR扩增混合液分配至96孔PCR板中，每孔100μL。每管emPCR扩增混合液可分配10个孔。密封PCR板。

2)清洗溅出的反应混合液。

4.2扩增反应，其反应程序为：

①94℃，4min；

②94℃，30s；

③58℃，4.5min；

④68℃，30s；

步骤②至④共50个循环；

⑤10℃保存。

5.磁珠回收

5.1收集乳化液和初步清洗

1)取出Enhancing Fluid XT和Annealing Butter XT，保持在室温下。

2)装配平端针头至一次性无菌10ml注射器末端，每个样品匹配一个注射器。

3)将各样品的乳化液吸到合适数量的注射器中。

4)各孔中加入100μL异丙醇，上下吸取混匀。

5)从孔中吸取异丙醇溶液。

6)二次吸取孔中剩余溶液。

7)颠倒注射器并吸入3ml空气。

8)除掉平端针头。

9)将蓝色过滤器装至注射器末端。

10)将Kimwipe无尘擦拭纸(Fisher Scientific公司产品，编号06-666A)放至涡旋平台，注射器末端置于涡旋振荡器震荡5s。

11)通过过滤器将注射器内容物排出。

5.2磁珠清洗与回收

1)颠倒注射器，吸入3ml空气。

2)吸入3-5ml异丙醇。

3)过滤器向下指向Kimwipe，最大速漩涡注射器5s。

4)通过过滤器将注射器内容物排出。

5)重复1)到4)步2次。

6)颠倒注射器，吸入3ml空气。

7)吸入3ml Enhancing Fluid XT，不要吸入空气。

8)过滤器向下指向Kimwipe，最大速漩涡注射器5s。

9)通过过滤器将注射器内容物排出。

10)重复6)到9)步2次。

11)颠倒注射器，吸入3ml空气。

12)吸入Enhancing Fluid XT至0.5ml刻度处，不要吸入空气。

13)过滤器向下指向Kimwipe，最大速漩涡注射器5s。

14)迅速地颠倒注射器，吸入额外3ml空气。

15)去掉(不要丢掉)过滤器，将珠子悬浮液打到一个新的1.5ml EP管中。

16)离心1.5ml EP管10s，旋转180°，再离心5s。吸除上清。

17)颠倒注射器，吸入3ml空气。

18)将过滤器装回注射器，吸入Enhancing Fluid XT至0.5ml刻度处，不要吸入空气。

19)过滤器向下指向Kimwipe，最大速漩涡5s。

20)迅速地颠倒注射器，吸入额外的3ml空气。

21)去掉过滤器，将珠子悬浮液打到同一1.5ml EP管中。

22)丢弃注射器和过滤器。

6.DNA文库磁珠富集

6.1富集前准备

1)打开干式加热器(Labnet公司生产)，设置为65℃。

2)混合125μL10N NaOH(Amresco公司生产)和9.875ml超纯水，配制成Melt Solution。

3)离心旋转180°再离心EP管，吸除上清。

4)每管中加入1ml Melt Solution，漩涡。室温孵育2min。离心旋转180°再离心，吸除上清。

5)重复4)步一次。

6)每管中加入1ml Annealing Buffer XT，漩涡。离心旋转180°再离心，吸除上清。

7)重复6)步一次。

8)每管中加入30μL Annealing Buffer XT，12μL的Enrichment Primer，漩涡。

9)放置于65℃干式加热器上5min，之后迅速放至冰上2min。

10)每管加入500μL Enhancing Fluid XT，漩涡。离心旋转180°再离心，吸除上清。

11)重复步骤10)一次。

12)每管中加入800μL Enhancing Fluid XT，漩涡。

6.2准备富集珠子

1)涡旋震荡棕色的“Enrichment Beads”管1min，使其充分重悬。

2)将管子置于磁力架(Invitrogen公司生产)上，富集磁珠。

3)吸除上清，小心不要吸到磁珠。取下。

4)加入500μL Enhancing Fluid XT，涡旋震荡。

5)置于磁力架上，吸附Enrichment Beads。

6)吸除上清，小心不要吸到磁珠。

7)重复4-6步。

8)吸除上清后，将其从磁力架上取下。

9)按每emulsion oil管20μL加入Enhancing Fluid XT，涡旋震荡。

6.3富集携带DNA片段的磁珠

1)向每管清洗过的Capture Beads管中加入清洗过的EnrichmentBeads 40μL。

2)室温下在混合器上旋转5min。

3)将各管放至磁力架上，等待3-5min，使磁珠吸附到磁力架上。

4)颠倒磁力架几次。

5)用1000μL吸头小心地吸除上清，不要干扰到磁珠。

6)按以下方法用Enhancing Fluid XT清洗磁珠，直到上清中无可见珠子：

A.每管中加入1ml Enhancing Fluid XT；

B.将各管从磁力架上取下，漩涡；

C.将各管放回磁力架上，使磁珠吸附到管壁，颠倒磁力架；

D.用1000μL吸头小心地吸除每管中的上清；

E.重复6-10次直到上清中无可见珠子。

6.4收集富集好的连有DNA片段磁珠

1)将各管从磁力架上取下，加入700μL的Melt Solution重悬磁珠。

2)漩涡5s，将各管放回磁力架直至Enrichment Beads吸附到管壁。

3)将各管中的上清转移到1.5ml EP管中。

4)离心旋转180°再离心，吸除上清。

5)向各原管中再加入一次700μL Melt Solution。

6)漩涡5s，将各管放回磁力架上，直至Enrichment Beads吸附到管壁。

7)转移上清至同一个1.5ml EP管中。

8)丢弃原管。

9)离心旋转180°再离心，吸除上清。

10)向各管中加入500μLAnnealing Buffer XT，漩涡5s。

11)离心旋转180°再离心，去除上清。

12)重复10)到11)步2次。

13)各管中加入60μL的Annealing Buffer XT，漩涡重悬浮珠子。

7.测序引物退火

1)加入12μL的测序引物，涡旋振荡混匀。

2)干式加热器中，65℃加热5min，后迅速放于冰上2min。

3)每管中加入500μL Annealing Buffer XT，涡旋振荡5s，离心旋转180°再离心，去除上清。

4)用500μL Annealing Buffer重复步骤3)两次。

5)各管中加入1ml Annealing Buffer，涡旋震荡。

6)计数珠子，计算富集的百分率：

通过上述各步骤即得测序所用的emPCR产物。

实施例2

本实施例的所有方法和步骤同实施例1，其不同之处包括以下两点：

一、步骤1中第1)步所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：

二、步骤4.2的扩增反应中，其反应程序为：

①90℃，3min；

②95℃，28s；

③57℃，5min；

④66℃，32s；

步骤②至④共45个循环；

⑤4℃保存。

实施例3

一、步骤1中第1)步所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：

二、步骤4.2的扩增反应中，其反应程序为：

①94℃，4min；

②93℃，32s；

③59℃，4min；

④70℃，28s；

步骤②至④共55个循环；

⑤10℃保存。

实施例4

一、步骤1中第1)步所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：

二、步骤4.2的扩增反应中，其反应程序为：

①94℃，4min；

②94℃，30s；

③58℃，5min；

④68℃，30s；

步骤②至④共50个循环；

⑤10℃保存。

实施例5

一、步骤1中第1)步所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：

二、步骤4.2扩增反应中，其反应程序为：

①95℃，6min；

②94℃，30s；

③57℃，5min；

④68℃，31s；

步骤②至④共50个循环；

⑤10℃保存。

效果实施例1

现在结合效果实施例对本发明作进一步的说明。

本效果实施例分别比较了通过罗氏公司试剂盒RocheGS Titanium LVemPCR Kit(Lib-L)v2中的工作手册——《Roche，emPCR Amp-Lib L SVMethod Manual_XL+_May2011》上所记载的方法即现有技术制备的emPCR产物和通过实施例1所述方法制备的emPCR产物用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中的效果，结果如下表所示：

从上述表格可以看出，采用本发明所述方法制备的emPCR产物在用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中，其通过过滤序列的比例与现有技术相比有了很大程度的提高，平均读长和总数据量也大幅度提高。因此，在基于焦磷酸原理的454高通量测序的科研和生产实践中，采用本发明所述方法可以有效降低非特异性扩增信号，减少冗余的数据，使有效数据的产量提高30％，从而提高了实验效率，节约了实验成本。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法，其包括步骤：

1)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备；

2)DNA文库捕获；

3)乳化；

4)扩增；

5)磁珠回收；

6)DNA文库磁珠富集；

7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物；

其特征在于，步骤1)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：emPCRAdditive，30.6％～43.0％(v/v)；5×扩增液，18.4％～21.5％(v/v)；扩增引物，2.0％～7.5％(v/v)；emPCR酶混合液，2.6％～5.9％(v/v)；PPiase，0.1％～0.3％(v/v)；余量为水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：emPCR Additive，38.4％(v/v)；5×扩增液，20.3％(v/v)；扩增引物，4.8％(v/v)；emPCR酶混合液，5.3％(v/v)；PPiase，0.2％(v/v)；余量为水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为930μL～980μL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为937μL，包括下列各组分：360μL emPCRAdditive；180～200μL 5×扩增液；35～55μL扩增引物；50μL emPCR酶混合液；2μL PPiase；余量为水。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为937μL，包括下列各组分：290μL超纯水；360μL emPCRAdditive；190μL5×扩增液；45μL扩增引物；50μLemPCR酶混合液；2μL PPiase。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述扩增的反应程序为：

①90-95℃，3-6min；

②93-95℃，28-32s；

③57-59℃，4-5min；

④66-70℃，28-32s；

步骤②至④共45-55个循环；

⑤4-10℃保存。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序中步骤②至④为：

②94-95℃，28-32s；

③57-58℃，4-5min；

④67-69℃，28-32s。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序中步骤①为94℃，4min；步骤⑤为10℃保存。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为：

①94℃，4min；

②94℃，30s；

③58℃，4.5min；

④68℃，30s；

步骤②至④共50个循环；

⑤10℃保存。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高通量测序为基于焦磷酸原理的454高通量转录组测序。