JP2019509025A - シュードモナス・エルギノーサの菌株およびそのプロテアーゼ産生への応用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌株ＳＷＪＳＳ３およびそのプロテアーゼ産生への応用を開示している。菌株ＳＷＪＳＳ３は、２０１５年６月１０日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託先は中国北京朝陽区北辰西路１号院の中国科学院微生物学研究所である。番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０９７３である。当該株は、プロテアーゼの産生には以下の工程が含まれる。発酵培地を発酵タンクに添加し、液体容量８〜１２％、初期ｐＨ７．０〜７．５、菌株接種量０．８〜１．２％、タンク内初期温度２０〜４０℃、振盪条件下で３０〜８０時間発酵させ、タンク内で大量のプロテアーゼを生成し、分離と抽出によりプロテアーゼを得る。本発明のＳＷＪＳＳ３株は、強力なプロテアーゼ産生能を有し、得られたプロテアーゼは酵素活性が高く耐塩性が高く、提供した発酵方法は簡単な条件で安定した遺伝的性質を有し、工業的産生に適している。
【選択図】図１
【選択図】図１
Description
本発明は工業微生物の分野に関し、特に、深海泥由来のシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の菌株およびそのプロテアーゼ産生への応用に関する。
海洋は生命の発祥地であり、地球の表面積の７０％を占め、地球の生物資源の８０％を所有している。海洋は、一般に、高塩、高圧、貧栄養、低温などの特性を有する。これらの極端な環境に適応するために、長期の進化プロセスにおいて海洋微生物によって形成されるいくつかの微生物産物および活性物質が、陸生微生物とは異なる。
微生物プロテアーゼは、加水分解されるタンパク質ペプチド結合によって特徴づけられる加水分解酵素であり、人類の産生および生命において重要な役割を果たす。遺伝子工学と発酵技術の急速な発展と広範な応用により、微生物発酵技術による酵素の産生は、市販の酵素調製物を製造するための主な方法となっている。極限環境下で生存する海洋微生物によって産生されるプロテアーゼは、一般に耐塩性、ｐＨおよび広い温度範囲の特性を有する。耐塩性微生物や耐塩性プロテアーゼは、塩分の多い環境下でも増殖し、高い活性を保持することができるため、下水処理や醤油発酵などの分野で研究者らに賞賛されている。
シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、緑膿菌）は、長い間重要な工業微生物であり、ラムノリピドの製造、ミクロキスティス・エルギノーサの溶解、石油の分解およびフェノール汚染物質などの研究分野でしばしば使用される。しかし、現在使用されている緑膿菌は主に陸地由来であり、深海泥由来で高酵素活性および耐塩性の安定なプロテアーゼを産生する菌株はほとんど報告されていない。
本発明の第一の目的は、深海泥由来のシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＳＷＪＳＳ３菌株を提供することであり、この菌株は高い酵素活性および高い耐塩性特性のプロテアーゼを産生することができる。
本発明のもう一つの目的は、上記菌株のプロテアーゼ産生への応用を提供することである。
本発明の目的は、以下の技術的解決法によって達成される。
シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌株ＳＷＪＳＳ３は、２０１５年６月１０日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託先は中華人民共和国北京朝陽区北辰西路１号院の中国科学院微生物学研究所である。番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０９７３である。
上記菌株の形態学的、生理学的および生化学的同定は、以下の特徴を有する。
注：表１および表２において、「＋」は菌株の９０％以上が陽性であることを意味し、「−」は菌株の９０％以上が陰性であることを意味する。
抽出およびシーケンシングにより、ＳＷＪＳＳ３菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡは１３８７ｂｐの長さであり、その配列は配列番号１であった。
得られた１６Ｓ ｒＤＮＡ配列をＧｅｎｂａｎｋにインポートし、ｂｌａｓｔプログラムを使用してそれをデータベース中の遺伝子配列と比較した。その結果は、シュードモナス・エルギノーサ１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に対する相同性が１００％であることを示した。
１６Ｓ ｒＤＮＡの配列アラインメントを菌株の形態的および生理学的および生化学的特徴と組み合わせて、その菌株がシュードモナス・エルギノーサの菌株であり、ＳＷＪＳＳ３と命名することを決定した。
菌株ＳＷＪＳＳ３は、プロテアーゼを産生する液体発酵に使用することができ、発酵方法は以下の工程を含む。
発酵培地を発酵タンクに添加し、液体容量８〜１２％、初期ｐＨ７．０〜７．５、菌株接種量０．８〜１．２％、タンク内初期温度２０〜４０℃、振盪条件下で３０〜８０時間発酵させ、タンク内で大量のプロテアーゼを生成し、分離と抽出によりプロテアーゼを得る。
本発明は、従来技術に対して以下の利点および効果を有する。
１．本発明のＳＷＪＳＳ３株は、強力なプロテアーゼ産生能を有し、得られたプロテアーゼは酵素活性が高く耐塩性が高い。
２．本発明により提供されたＳＷＪＳＳ３の発酵方法は、簡単な条件で安定した遺伝的性質を有し、工業的産生に適している。
１．本発明のＳＷＪＳＳ３株は、強力なプロテアーゼ産生能を有し、得られたプロテアーゼは酵素活性が高く耐塩性が高い。
２．本発明により提供されたＳＷＪＳＳ３の発酵方法は、簡単な条件で安定した遺伝的性質を有し、工業的産生に適している。
以下は実施例および図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の実施態様はこれらに限定されるものではない。
実施例で使用した培地は、以下のように調製した。
１．濃縮培地（ｇ／Ｌ 人工海水）：（１）ペプトン５．０、（２）酵母エキス粉末１．０、（３）リン酸鉄０．１、（４）塩化ナトリウム１００、（５）ｐＨ７．２〜７．６。
２．種子培地（ｇ／Ｌ 人工海水）：（１）ペプトン５．０、（２）酵母エキス粉末１．０、（３）リン酸鉄０．１、（４）ｐＨ７．２〜７．６。
３．選別培地（カゼインプレート）（ｇ／Ｌ 人工海水）：（１）カゼイン１０、（２）牛肉浸漬粉末３．０、（３）リン酸二水素カリウム２．０、（４）寒天粉末１５、（５）ｐＨ７．２〜７．６。
４．発酵培地：（１）グルコース４、（２）グリセロール８、（３）酵母エキス粉末１５（４）Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２、（５）ＴＷＥＥＮ−８０ ０．５、（６）海塩１０、（７）脱イオン水１Ｌ、（８）ｐＨ約７．５。
５．試験管斜面培地：（１）牛肉ペースト４、（２）ペプトン６、（３）酵母エキス粉末２、（４）海塩５、（５）寒天粉末１５、（６）脱イオン水１Ｌ、（７）ｐＨ７．２〜７．６。
１．濃縮培地（ｇ／Ｌ 人工海水）：（１）ペプトン５．０、（２）酵母エキス粉末１．０、（３）リン酸鉄０．１、（４）塩化ナトリウム１００、（５）ｐＨ７．２〜７．６。
２．種子培地（ｇ／Ｌ 人工海水）：（１）ペプトン５．０、（２）酵母エキス粉末１．０、（３）リン酸鉄０．１、（４）ｐＨ７．２〜７．６。
３．選別培地（カゼインプレート）（ｇ／Ｌ 人工海水）：（１）カゼイン１０、（２）牛肉浸漬粉末３．０、（３）リン酸二水素カリウム２．０、（４）寒天粉末１５、（５）ｐＨ７．２〜７．６。
４．発酵培地：（１）グルコース４、（２）グリセロール８、（３）酵母エキス粉末１５（４）Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２、（５）ＴＷＥＥＮ−８０ ０．５、（６）海塩１０、（７）脱イオン水１Ｌ、（８）ｐＨ約７．５。
５．試験管斜面培地：（１）牛肉ペースト４、（２）ペプトン６、（３）酵母エキス粉末２、（４）海塩５、（５）寒天粉末１５、（６）脱イオン水１Ｌ、（７）ｐＨ７．２〜７．６。
（実施例１）
ＳＷＪＳＳ３菌株の単離、スクリーニングおよび同定は以下の工程を含む。
濃縮：ガラスビーズ入りの５０ｍＬ滅菌遠心管に海泥１ｇを添加し、０．９％滅菌生理食塩水１０ｍＬを加え、振盪器で３０分間振盪し完全に分散させた。１ｍＬの上清を濃縮培地に入れ、３７℃、１８０回転／分で２４時間培養した。
一次スクリーニング：２回濃縮後の培養液１ｍＬをとり、０．９％滅菌生理食塩水で１０−１、１０−２、１０−３の濃度に徐々に希釈し、それぞれを１００μＬずつ取り、凝固したカゼインプレートに均一に塗布し、３７℃のインキュベーター内で２４時間倒置培養した。明白な加水分解輪を有する単一のコロニーを拾い、繰り返し３回画線培養し、試験管斜面培地に接種し、４℃の冷蔵庫に保存した。
再スクリーニング：試験管の傾斜面上で培養した上記純粋培養物を３回活性化し、種子培地に接種し、３７℃、１８０回転／分の恒温振盪インキュベーターで１２時間培養し、１％接種量で発酵培地に接種した。この培地において、同じ条件で４８時間培養し、遠心分離後、上清を採取して粗酵素液を得た。粗酵素液を適切に希釈した後に酵素活性を測定した。
ＳＷＪＳＳ３菌株の単離、スクリーニングおよび同定は以下の工程を含む。
濃縮：ガラスビーズ入りの５０ｍＬ滅菌遠心管に海泥１ｇを添加し、０．９％滅菌生理食塩水１０ｍＬを加え、振盪器で３０分間振盪し完全に分散させた。１ｍＬの上清を濃縮培地に入れ、３７℃、１８０回転／分で２４時間培養した。
一次スクリーニング：２回濃縮後の培養液１ｍＬをとり、０．９％滅菌生理食塩水で１０−１、１０−２、１０−３の濃度に徐々に希釈し、それぞれを１００μＬずつ取り、凝固したカゼインプレートに均一に塗布し、３７℃のインキュベーター内で２４時間倒置培養した。明白な加水分解輪を有する単一のコロニーを拾い、繰り返し３回画線培養し、試験管斜面培地に接種し、４℃の冷蔵庫に保存した。
再スクリーニング：試験管の傾斜面上で培養した上記純粋培養物を３回活性化し、種子培地に接種し、３７℃、１８０回転／分の恒温振盪インキュベーターで１２時間培養し、１％接種量で発酵培地に接種した。この培地において、同じ条件で４８時間培養し、遠心分離後、上清を採取して粗酵素液を得た。粗酵素液を適切に希釈した後に酵素活性を測定した。
粗酵素液の塩溶液安定性試験：
酵素活性を有する粗酵素液を一定量とり、５倍に希釈してＮａＣｌと混合させ、塩濃度を１５％とし、同じ処理でＮａＣｌを含まない粗酵素液を対照とし、４℃の冷蔵庫内で残存酵素活性を時間差測定し、相対値を算出した。
相対的酵素活性％＝ＮａＣｌを混合した残留酵素活性／ＮａＣｌを混合しない粗酵素活性
結果を表３に示す。
酵素活性を有する粗酵素液を一定量とり、５倍に希釈してＮａＣｌと混合させ、塩濃度を１５％とし、同じ処理でＮａＣｌを含まない粗酵素液を対照とし、４℃の冷蔵庫内で残存酵素活性を時間差測定し、相対値を算出した。
相対的酵素活性％＝ＮａＣｌを混合した残留酵素活性／ＮａＣｌを混合しない粗酵素活性
結果を表３に示す。
カゼイン加水分解によるスクリーニングと発酵液の酵素活性測定により、２０Ｕ／ｍＬ以上の酵素活性を有する１０株の発酵液を５倍に希釈して最終濃度１５％のＮａＣｌ溶液を調製し、混合後４℃の冷蔵庫に保存し、３時間後に残留酵素活性を測定した。ＮａＣｌ無添加の菌株発酵液の酵素活性を対照とし、相対酵素活性値（％）を算出した。結果を表３に示す。表から、Ａ３株の相対的な活力が４０．７０％と最も高いことがわかったので、Ａ３株を、次の実験の研究対象として決定し、ＳＷＪＳＳ３と番号付けした。
ＳＷＪＳＳ３株の同定：
活性化された株をＬＢ培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで１２時間培養した後、新鮮な細菌溶液１．５ｍＬを４℃で採取し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細菌を２ｍＬの遠心チューブに入れ、ＤＮＡ抽出キットを用いてＤＮＡを抽出した。電気泳動後、ユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲにより１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を増幅した。
活性化された株をＬＢ培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで１２時間培養した後、新鮮な細菌溶液１．５ｍＬを４℃で採取し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細菌を２ｍＬの遠心チューブに入れ、ＤＮＡ抽出キットを用いてＤＮＡを抽出した。電気泳動後、ユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲにより１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を増幅した。
プライマー配列は：
フォワードプライマー：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号２）
リバースプライマー：５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）
フォワードプライマー：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号２）
リバースプライマー：５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号３）
増幅全反応系（５０μＬ）は、鋳型遺伝子ＤＮＡ １．２５μＬ、上流および下流プライマー（２０μｍｏｌ／Ｌ） 各２．５μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ５．０μＬ、４つのデオキシヌクレオチド混合物ｄＮＴＰ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ） ４．０μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ４．０μＬ、二重蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ） ３０．２５μＬを含む。
ＰＣＲ反応手順は、２ステップ法を使用し、第１段階の予備変性を９４℃・２分、変性を９８℃・１０秒、アニーリングを５５℃・１分、伸長を６８℃・３０秒（２５サイクル）（但し、最後の伸長の時間は１０分に延長）で行った。
ＰＣＲ産物の精製後に得られた１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子断片は１３８７ｂｐの長さであり、配列は配列番号１であり、これはデータベース中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの異なる株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と１００％の配列類似性を有する。
菌株形態（表１）および生理学的および生化学的特性（表２）と組み合わせて、ＳＷＪＳＳ３株は新しいシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）として同定された。
（実施例２）
ＳＷＪＳＳ３菌株がプロテアーゼ産生への応用は、以下の工程を含む。
（１）発酵温度の最適化は、上記発酵培地を用い、インキュベーター温度がそれぞれ２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、初期ｐＨ値が７．５、液量が１０％、接種量が１％という条件で、４８時間培養した後、遠心分離により酵素活性を測定することで行った。結果を図１に示す。図から、２０℃〜４０℃の温度で一定の酵素産生量を有するが、２５℃で最高の酵素産生量を有することが分かる。
（２）発酵時間の最適化は、３０℃、ｐＨ７．５、液量１０％、１８０ｒｐｍという条件で発酵を行い、０時間から８０時間まで６時間ごとにサンプルを連続的に採取し、バイオマスとプロテアーゼ活性の発酵時間にともなう変化の傾向を測定した。結果を図２に示す。図から、菌株の成長が２０時間後に安定相に入ったことが分かる。培養１２時間後、菌株は大量の酵素を産生し始め、酵素収率は３０時間後に安定相になり、３６時間で最大に達し、その後、安定化した。
ＳＷＪＳＳ３菌株がプロテアーゼ産生への応用は、以下の工程を含む。
（１）発酵温度の最適化は、上記発酵培地を用い、インキュベーター温度がそれぞれ２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、初期ｐＨ値が７．５、液量が１０％、接種量が１％という条件で、４８時間培養した後、遠心分離により酵素活性を測定することで行った。結果を図１に示す。図から、２０℃〜４０℃の温度で一定の酵素産生量を有するが、２５℃で最高の酵素産生量を有することが分かる。
（２）発酵時間の最適化は、３０℃、ｐＨ７．５、液量１０％、１８０ｒｐｍという条件で発酵を行い、０時間から８０時間まで６時間ごとにサンプルを連続的に採取し、バイオマスとプロテアーゼ活性の発酵時間にともなう変化の傾向を測定した。結果を図２に示す。図から、菌株の成長が２０時間後に安定相に入ったことが分かる。培養１２時間後、菌株は大量の酵素を産生し始め、酵素収率は３０時間後に安定相になり、３６時間で最大に達し、その後、安定化した。
（実施例３）
ＳＷＪＳＳ３株の遺伝的安定性に関する研究
ＳＷＪＳＳ３株を継代して５回継代し、そのプロテアーゼ活性を遺伝的安定性の指標として測定した。
結果を表４に示す。継代を５回行い、プロテアーゼ活性は約７５０Ｕ／ｍｌに維持され、遺伝的安定性が良好であることが示された。
ＳＷＪＳＳ３株の遺伝的安定性に関する研究
ＳＷＪＳＳ３株を継代して５回継代し、そのプロテアーゼ活性を遺伝的安定性の指標として測定した。
結果を表４に示す。継代を５回行い、プロテアーゼ活性は約７５０Ｕ／ｍｌに維持され、遺伝的安定性が良好であることが示された。
上述した実施形態は本発明の好適な実施形態であるが、本発明の実施形態は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われる他の変更、修正、置換、組み合わせ、および簡略化は、すべて同等の置換手段であり、本発明の保護範囲に含まれる。
［付記］
［付記１］
２０１５年６月１０日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託先は中華人民共和国北京朝陽区北辰西路１号院の中国科学院微生物学研究所であり、番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０９７３であることを特徴とするシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌株ＳＷＪＳＳ３。
［付記１］
２０１５年６月１０日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託先は中華人民共和国北京朝陽区北辰西路１号院の中国科学院微生物学研究所であり、番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０９７３であることを特徴とするシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌株ＳＷＪＳＳ３。
［付記２］
プロテアーゼ産生への応用を特徴とする付記１に記載の菌株ＳＷＪＳＳ３。
プロテアーゼ産生への応用を特徴とする付記１に記載の菌株ＳＷＪＳＳ３。
［付記３］
発酵培地を発酵タンクに添加し、液体容量８〜１２％、初期ｐＨ７．０〜７．５、菌株接種量０．８〜１．２％、タンク内初期温度２０〜４０℃、振盪条件下で３０〜８０時間発酵させ、タンク内で大量のプロテアーゼを生成し、分離と抽出によりプロテアーゼを得る、ことを特徴とする付記２に記載の菌株ＳＷＪＳＳ３のプロテアーゼ産生への応用。
発酵培地を発酵タンクに添加し、液体容量８〜１２％、初期ｐＨ７．０〜７．５、菌株接種量０．８〜１．２％、タンク内初期温度２０〜４０℃、振盪条件下で３０〜８０時間発酵させ、タンク内で大量のプロテアーゼを生成し、分離と抽出によりプロテアーゼを得る、ことを特徴とする付記２に記載の菌株ＳＷＪＳＳ３のプロテアーゼ産生への応用。
Claims (3)
- ２０１５年６月１０日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託先は中華人民共和国北京朝陽区北辰西路１号院の中国科学院微生物学研究所であり、番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０９７３であることを特徴とするシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌株ＳＷＪＳＳ３。
- プロテアーゼ産生への応用を特徴とする請求項１に記載の菌株ＳＷＪＳＳ３。
- 発酵培地を発酵タンクに添加し、液体容量８〜１２％、初期ｐＨ７．０〜７．５、菌株接種量０．８〜１．２％、タンク内初期温度２０〜４０℃、振盪条件下で３０〜８０時間発酵させ、タンク内で大量のプロテアーゼを生成し、分離と抽出によりプロテアーゼを得る、ことを特徴とする請求項２に記載の菌株ＳＷＪＳＳ３のプロテアーゼ産生への応用。
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