CN104946555B - 一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域,具体为一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用。本发明发现一株微杆菌可以降解赤霉烯酮,命名为Microbacteriumsp. FY1538。该微杆菌属于微杆菌属(Microbacterium sp.),分离自青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243 E100.32.285)。Microbacteriumsp. FY1538在LB培养基中培养,添加终浓度10ul/ml的甲醇,培养基pH 7.4,培养温度30 ℃,摇瓶震荡培养48 h,转速220rpm,发酵上清液具有完全降解赤霉烯酮的能力。本发明提供的微杆菌可应用于玉米等发霉农作物的脱毒。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种微杆菌及其完全降解赤霉烯酮的应用。
背景技术
赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),又称为F-2毒素,是一种具有类***生物活性的霉菌毒素,主要是由镰刀属(Fusariumsp.)真菌的某些种,如禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)等通过聚酮类合成代谢途径生成。能导致人或动物的生殖***紊乱,临床表现为***过多症,还有潜在致癌性与肝肾损伤能力。镰刀菌生态适应性强,既营寄生又营腐生生活,分布广泛。赤霉烯酮物化性质稳定,不溶于水,难于清除。农作物生长、收获和储存、加工等多个环节中,都极易被镰刀菌侵害而污染赤霉烯酮。
近些年全球各地越来越多地在谷物(如玉米等)中检测出赤霉烯酮,严重威胁着食用者的健康安全和养殖业的饲料安全。
微杆菌属(Microbacterium sp.)是一种在土壤中广泛分布的常见革兰氏阳性菌,不生孢,不抗酸。不运动或以1~3根鞭毛运动。好氧,弱厌氧。在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖 琼脂上菌落不透明,有光泽,黄色。化能异养菌,以呼吸代谢为主,也可能弱发酵产酸。营养要求复杂。最适生长温度30℃。已报道微杆菌属菌株可以降解黄原胶、壳聚糖、氯乙酰及多种含苯环化合物,目前尚无关于降解赤霉烯酮的微杆菌属菌株的报道。
本发明从青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243 E100.32.285)中筛选到一株具有赤霉烯酮降解能力的微杆菌属菌株,命名为Microbacterium sp.FY1538,菌株保藏号为:CGMCC NO. 10614,其发酵上清液可以完全降解赤霉烯酮。该菌可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可以降解赤霉烯酮的微杆菌属的菌株Microbacterium sp.FY1538,以及其应用。
本发明提供的微杆菌属的菌株,是从青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243E100.32.285)中分离获得,该菌种保藏号为CGMCC NO. 10614,保藏日期为2015年3月11号,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。对该菌株的16S rDNA(SEQ ID NO 1),表明该菌株来源于细菌中的微杆菌属,命名为Microbacterium sp.FY1538。其16S rDNA序列与Microbacterium paraoxydans、Microbacterium oxydans菌种相似度均为97%。该菌株在LB平板上生长的菌落为圆形,培养36h后直径大约1.5mm,不透明,有光泽,黄色(见图1),革兰氏染色及显微镜观察,该菌株为革兰氏阳性菌(见图2)。
本发明还提供利用Microbacterium sp.FY1538菌株培养液上清完全降解赤霉烯酮的方法。具体步骤为:将所述菌株培养在 LB液体培养基中(LB培养基的组成为胰蛋白胨10g/L,酵母提取物 5g/L,氯化钠10g/L,pH 7.4,水溶液);添加终浓度5-15μl/ml的甲醇(优选终浓度10-12μl/ml);培养温度为25-35℃,震荡或者搅拌培养,转速为100-800rpm,培养时间为24-72小时(优选培养时间为48-60小时);对Microbacterium sp.FY1538的培养液,通过离心或者过滤的方法去除菌体,获得培养液上清溶液;将该培养液上清在30-50℃条件下,与赤霉烯酮经过20-24小时的反应。用TLC方法分析反应体系中赤霉烯酮的残留,用HPLC的方法分析赤霉烯酮的降解,表明赤霉烯酮已完全降解(图3,图4)。
本发明提供的菌株Microbacterium sp.FY1538可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
附图说明
图1. Microbacterium sp. FY1538菌落形态图。该菌株在LB平板上菌落为圆形较小,不透明,有光泽,黄色。该菌落形态的特征与微杆菌属细菌形态特征相符合。
图2. Microbacterium sp. FY1538细胞经过革兰氏染色后在显微镜下的形态。与革兰氏阳性菌特征吻合。
图3. TLC方法分析赤霉烯酮的降解。Microbacterium sp. FY1538在含有甲醇的LB培养基中的培养48小时后,取发酵液上清与赤霉烯酮在30℃条件下反应24小时后,用乙酸乙酯萃取,收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解,用TLC方法分析反应体系中赤霉烯酮的残留。TLC的展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1。泳道1:Microbacterium sp. FY1538菌株在含甲醇的LB中培养2天后的培养液上清;泳道2:赤霉烯酮标准样;泳道3:Microbacterium sp. FY1538在加甲醇的LB中培养2天后的培养液上清与赤霉烯酮反应24小时。
图4:HPLC的方法分析赤霉烯酮的降解。Microbacterium sp. FY1538培养液上清与赤霉烯酮在30℃条件下反应0小时、1小时,3小时、6小时和20小时后,用HPLC(AgilentEclipse Plus C18)分析反应体系中赤霉烯酮的残留。HPLC流动相为甲醇和水,甲醇5%-100%梯度洗脱30min,紫外检测波长240nm。蓝色:0小时;红色:催化反应1小时;绿色:催化反应3小时;粉色:催化反应6小时;黄色:催化反应20小时。
具体实施方式
所用实验材料和相关操作方法如下,未详述处可以参考冷泉实验室的《分子克隆》(J.Sambrook, et al., 第二版,1996):
1.培养基
LB 培养基:胰蛋白胨 10g/L,酵母提取物 5g/L,氯化钠10g/L,其余为水,pH 7.4。
2. 实验试剂:甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、环戊酮,各种无机盐类购于国药集团化学试剂(沪试),分析纯;赤霉烯酮购于Sigma公司(货号z2125);引物合成和DNA测序由上海杰李生物技术有限公司完成。TLC展开剂用石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1配制而成,现用现配。
3. TLC的分析方法:用Microbacterium sp. FY1538降解赤霉烯酮的方法:将Microbacterium sp. FY1538接种于50 mL LB培养基中,添加终浓度10μl/ml的甲醇,30℃,震荡培养48 h;取发酵液12000rpm离心,其上清,每500μl加入25μg赤霉烯酮,在30℃水浴反应24h后,用适量乙酸乙酯萃取反应液,收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解析出物,用TLC方法(MERCK公司TLC硅胶板60F254,展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1)检验赤霉烯酮残留。
4. HPLC的分析方法:将Microbacterium sp. FY1538接种于50 mL LB培养基中,添加终浓度10μl/ml的甲醇,30 ℃,震荡培养48 h;发酵液12000rpm离心,上清液每500μl加入25μg赤霉烯酮,在30℃水浴反应不同时间,用HPLC进行分析。HPLC层析柱为AgilentEclipse Plus C18,流动相为甲醇和水,甲醇5%-100%梯度洗脱30min,紫外检测波长240nm。
实施例1:赤霉烯酮降解菌株的筛选分离与鉴定
土壤样品采自青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243 E100.32.285)。取2 g土样,加入10 mL 0.15M氯化钠水溶液,振荡30 min,使样品充分打散后,室温静置1min,立刻取1mL上清,涂布于LB平板上,30℃培养至单克隆生长,挑取不同形态单菌落,接种于液体LB培养基中(添加甲醇溶解的终浓度25μg/ml的赤霉烯酮),30℃培养2天,离心取上清,用适量乙酸乙酯萃取,收集乙酸乙酯蒸干并用少量甲醇溶解析出物,用TLC方法(展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1)检验培养液中赤霉烯酮的残留。由此将可以降解赤霉烯酮的菌群在LB平板上反复划线纯化单克隆,最终筛选到一株可以独立降解赤霉烯酮的单一菌株(图1)。革兰氏染色后,证明该菌株是革兰氏阳性菌(图2)。
对该菌株抽提基因组DNA,PCR扩增16S rDNA。扩增用引物序列为16S rDNA通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO 2))和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT(SEQ IDNO 3))。得到该菌株16S rDNA序列(SEQ ID NO 1),在genbank数据库(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行比对分析,结果表明该赤霉烯酮降解菌株属于微杆菌属,命名为Microbacterium sp.FY1538,保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC NO. 10614。
实施例2:Microbacterium sp.FY1538的发酵培养
Microbacterium sp.FY1538菌株发酵上清用来降解赤霉烯酮,需要用甲醇诱导。对菌株进行分离纯化后,挑取单菌落接种于50 mL LB培养基中,添加终浓度10μl/ml的甲醇,30 ℃,震荡培养48 h后,发酵液12000rpm离心,获得发酵上清液。
实施例3:Microbacterium sp.FY1538发酵上清液降解赤霉烯酮的能力分析
取发酵上清液500μl,加入25ug赤霉烯酮,在30℃水浴反应24小时,用1000μl乙酸乙酯萃取反应液,收集乙酸乙酯相,蒸干并用少量甲醇溶解析出物,用TLC方法(MERCK公司TLC硅胶板60F254,展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1)检验赤霉烯酮残留。如图3所示,Microbacterium sp.FY1538发酵上清液与赤霉烯酮催化反应24小时后,TLC方法检测不到反应体系中的赤霉烯酮。
进一步用HPLC分析Microbacterium sp.FY1538发酵上清液在不同反应时间内降解赤霉烯酮的能力。HPLC层析柱为Agilent Eclipse Plus C18,流动相为甲醇和水,甲醇5%-100%梯度洗脱30min,紫外检测波长240nm。如图4所示,反应时间1小时,3小时,6小时,反应液中的赤霉烯酮逐渐下降,反应20小时后,HPLC已经检测不到反应体系中的赤霉烯酮,说明Microbacterium sp.FY1538发酵上清液具有完全完全降解赤霉烯酮的能力。
本发明提供的菌株Microbacterium sp.FY1538可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
<110> 复旦大学
<120> 一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用
<130> 001
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1116
<212> DNA
<213>
<400> 1
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ggcctgagag ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300
cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg cagcaacgcc gcgtgaggga 360
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Claims (4)
1.一株微杆菌属菌株,能够完全降解赤霉烯酮,命名为Microbacterium sp. FY1538,菌种保藏号为CGMCC NO. 10614。
2.如权利要求1所述的微杆菌属菌株完全降解赤霉烯酮的应用。
3.如权利要求1所述的微杆菌属菌株完全降解赤霉烯酮的应用,其特征在于具体步骤为:将所述菌株培养在 LB液体培养基中,添加终浓度5-15μl/ml的甲醇;培养温度为25-35℃,震荡或者搅拌培养,转速为100-800rpm,培养时间为24-72小时;对Microbacterium sp.FY1538的培养液,通过离心或者过滤的方法去除菌体,获得培养液上清溶液;取培养液上清溶液500μl,赤霉烯酮25ug,将该培养液上清在30-50℃条件下,与赤霉烯酮经过20-24小时的反应。
4.如权利要求1所述的微杆菌属菌株在发霉谷物脱毒中的应用。
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玉米赤霉烯酮生物降解研究进展;史競 等;《中国粮油学报》;20130630;第23卷(第6期);全文 * |
饲料中玉米赤霉烯酮的生物降解;计成;《动物营养学报》;20141231;第26卷(第10期);全文 * |
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