CN104946555B - 一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体为一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用。本发明发现一株微杆菌可以降解赤霉烯酮，命名为Microbacteriumsp. FY1538。该微杆菌属于微杆菌属（Microbacterium sp.），分离自青藏高原青海湖边的草皮（N36.34.243 E100.32.285）。Microbacteriumsp. FY1538在LB培养基中培养，添加终浓度10ul/ml的甲醇，培养基pH 7.4，培养温度30 ℃，摇瓶震荡培养48 h，转速220rpm，发酵上清液具有完全降解赤霉烯酮的能力。本发明提供的微杆菌可应用于玉米等发霉农作物的脱毒。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微杆菌及其完全降解赤霉烯酮的应用。
背景技术
赤霉烯酮（zearalenone，ZEN），又称为F-2毒素，是一种具有类***生物活性的霉菌毒素，主要是由镰刀属（Fusariumsp.）真菌的某些种，如禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）等通过聚酮类合成代谢途径生成。能导致人或动物的生殖***紊乱，临床表现为***过多症，还有潜在致癌性与肝肾损伤能力。镰刀菌生态适应性强，既营寄生又营腐生生活，分布广泛。赤霉烯酮物化性质稳定，不溶于水，难于清除。农作物生长、收获和储存、加工等多个环节中，都极易被镰刀菌侵害而污染赤霉烯酮。
近些年全球各地越来越多地在谷物（如玉米等）中检测出赤霉烯酮，严重威胁着食用者的健康安全和养殖业的饲料安全。
微杆菌属（Microbacterium sp.）是一种在土壤中广泛分布的常见革兰氏阳性菌，不生孢，不抗酸。不运动或以1～3根鞭毛运动。好氧，弱厌氧。在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖 琼脂上菌落不透明，有光泽，黄色。化能异养菌，以呼吸代谢为主，也可能弱发酵产酸。营养要求复杂。最适生长温度30℃。已报道微杆菌属菌株可以降解黄原胶、壳聚糖、氯乙酰及多种含苯环化合物，目前尚无关于降解赤霉烯酮的微杆菌属菌株的报道。
本发明从青藏高原青海湖边的草皮（N36.34.243 E100.32.285）中筛选到一株具有赤霉烯酮降解能力的微杆菌属菌株，命名为Microbacterium sp.FY1538，菌株保藏号为：CGMCC NO. 10614，其发酵上清液可以完全降解赤霉烯酮。该菌可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可以降解赤霉烯酮的微杆菌属的菌株Microbacterium sp.FY1538，以及其应用。
本发明提供的微杆菌属的菌株，是从青藏高原青海湖边的草皮（N36.34.243E100.32.285）中分离获得，该菌种保藏号为CGMCC NO. 10614，保藏日期为2015年3月11号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。对该菌株的16S rDNA（SEQ ID NO 1），表明该菌株来源于细菌中的微杆菌属，命名为Microbacterium sp.FY1538。其16S rDNA序列与Microbacterium paraoxydans、Microbacterium oxydans菌种相似度均为97%。该菌株在LB平板上生长的菌落为圆形，培养36h后直径大约1.5mm，不透明，有光泽，黄色（见图1），革兰氏染色及显微镜观察，该菌株为革兰氏阳性菌（见图2）。
本发明还提供利用Microbacterium sp.FY1538菌株培养液上清完全降解赤霉烯酮的方法。具体步骤为：将所述菌株培养在 LB液体培养基中（LB培养基的组成为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.4，水溶液）；添加终浓度5-15μl/ml的甲醇（优选终浓度10-12μl/ml）；培养温度为25-35℃，震荡或者搅拌培养，转速为100-800rpm，培养时间为24-72小时（优选培养时间为48-60小时）；对Microbacterium sp.FY1538的培养液，通过离心或者过滤的方法去除菌体，获得培养液上清溶液；将该培养液上清在30-50℃条件下，与赤霉烯酮经过20-24小时的反应。用TLC方法分析反应体系中赤霉烯酮的残留，用HPLC的方法分析赤霉烯酮的降解，表明赤霉烯酮已完全降解（图3，图4）。
本发明提供的菌株Microbacterium sp.FY1538可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
附图说明
图1. Microbacterium sp. FY1538菌落形态图。该菌株在LB平板上菌落为圆形较小，不透明，有光泽，黄色。该菌落形态的特征与微杆菌属细菌形态特征相符合。
图2. Microbacterium sp. FY1538细胞经过革兰氏染色后在显微镜下的形态。与革兰氏阳性菌特征吻合。
图3. TLC方法分析赤霉烯酮的降解。Microbacterium sp. FY1538在含有甲醇的LB培养基中的培养48小时后，取发酵液上清与赤霉烯酮在30℃条件下反应24小时后，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解，用TLC方法分析反应体系中赤霉烯酮的残留。TLC的展开剂为石油醚：丙酮：乙酸乙酯=5：4：1。泳道1：Microbacterium sp. FY1538菌株在含甲醇的LB中培养2天后的培养液上清；泳道2：赤霉烯酮标准样；泳道3：Microbacterium sp. FY1538在加甲醇的LB中培养2天后的培养液上清与赤霉烯酮反应24小时。
图4：HPLC的方法分析赤霉烯酮的降解。Microbacterium sp. FY1538培养液上清与赤霉烯酮在30℃条件下反应0小时、1小时，3小时、6小时和20小时后，用HPLC（AgilentEclipse Plus C18）分析反应体系中赤霉烯酮的残留。HPLC流动相为甲醇和水，甲醇5%-100%梯度洗脱30min，紫外检测波长240nm。蓝色：0小时；红色：催化反应1小时；绿色：催化反应3小时；粉色：催化反应6小时；黄色：催化反应20小时。
具体实施方式
所用实验材料和相关操作方法如下，未详述处可以参考冷泉实验室的《分子克隆》（J.Sambrook, et al., 第二版，1996）：
1.培养基
LB 培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠10g/L，其余为水，pH 7.4。
2. 实验试剂：甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、环戊酮，各种无机盐类购于国药集团化学试剂（沪试），分析纯；赤霉烯酮购于Sigma公司（货号z2125）；引物合成和DNA测序由上海杰李生物技术有限公司完成。TLC展开剂用石油醚：丙酮：乙酸乙酯=5：4：1配制而成，现用现配。
3. TLC的分析方法：用Microbacterium sp. FY1538降解赤霉烯酮的方法：将Microbacterium sp. FY1538接种于50 mL LB培养基中，添加终浓度10μl/ml的甲醇，30℃，震荡培养48 h；取发酵液12000rpm离心，其上清，每500μl加入25μg赤霉烯酮，在30℃水浴反应24h后，用适量乙酸乙酯萃取反应液，收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解析出物，用TLC方法（MERCK公司TLC硅胶板60F254，展开剂为石油醚：丙酮：乙酸乙酯=5：4：1）检验赤霉烯酮残留。
4. HPLC的分析方法：将Microbacterium sp. FY1538接种于50 mL LB培养基中，添加终浓度10μl/ml的甲醇，30 ℃，震荡培养48 h；发酵液12000rpm离心，上清液每500μl加入25μg赤霉烯酮，在30℃水浴反应不同时间，用HPLC进行分析。HPLC层析柱为AgilentEclipse Plus C18，流动相为甲醇和水，甲醇5%-100%梯度洗脱30min，紫外检测波长240nm。
实施例1：赤霉烯酮降解菌株的筛选分离与鉴定
土壤样品采自青藏高原青海湖边的草皮（N36.34.243 E100.32.285）。取2 g土样，加入10 mL 0.15M氯化钠水溶液，振荡30 min，使样品充分打散后，室温静置1min，立刻取1mL上清，涂布于LB平板上，30℃培养至单克隆生长，挑取不同形态单菌落，接种于液体LB培养基中（添加甲醇溶解的终浓度25μg/ml的赤霉烯酮），30℃培养2天，离心取上清，用适量乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯蒸干并用少量甲醇溶解析出物，用TLC方法（展开剂为石油醚：丙酮：乙酸乙酯=5：4：1）检验培养液中赤霉烯酮的残留。由此将可以降解赤霉烯酮的菌群在LB平板上反复划线纯化单克隆，最终筛选到一株可以独立降解赤霉烯酮的单一菌株（图1）。革兰氏染色后，证明该菌株是革兰氏阳性菌（图2）。
对该菌株抽提基因组DNA，PCR扩增16S rDNA。扩增用引物序列为16S rDNA通用引物27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG（SEQ ID NO 2））和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT（SEQ IDNO 3））。得到该菌株16S rDNA序列（SEQ ID NO 1），在genbank数据库（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行比对分析，结果表明该赤霉烯酮降解菌株属于微杆菌属，命名为Microbacterium sp.FY1538，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 10614。
实施例2：Microbacterium sp.FY1538的发酵培养
Microbacterium sp.FY1538菌株发酵上清用来降解赤霉烯酮，需要用甲醇诱导。对菌株进行分离纯化后，挑取单菌落接种于50 mL LB培养基中，添加终浓度10μl/ml的甲醇，30 ℃，震荡培养48 h后，发酵液12000rpm离心，获得发酵上清液。
实施例3：Microbacterium sp.FY1538发酵上清液降解赤霉烯酮的能力分析
取发酵上清液500μl，加入25ug赤霉烯酮，在30℃水浴反应24小时，用1000μl乙酸乙酯萃取反应液，收集乙酸乙酯相，蒸干并用少量甲醇溶解析出物，用TLC方法（MERCK公司TLC硅胶板60F254，展开剂为石油醚：丙酮：乙酸乙酯=5：4：1）检验赤霉烯酮残留。如图3所示，Microbacterium sp.FY1538发酵上清液与赤霉烯酮催化反应24小时后，TLC方法检测不到反应体系中的赤霉烯酮。
进一步用HPLC分析Microbacterium sp.FY1538发酵上清液在不同反应时间内降解赤霉烯酮的能力。HPLC层析柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为甲醇和水，甲醇5%-100%梯度洗脱30min，紫外检测波长240nm。如图4所示，反应时间1小时，3小时，6小时，反应液中的赤霉烯酮逐渐下降，反应20小时后，HPLC已经检测不到反应体系中的赤霉烯酮，说明Microbacterium sp.FY1538发酵上清液具有完全完全降解赤霉烯酮的能力。
本发明提供的菌株Microbacterium sp.FY1538可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
<110> 复旦大学
<120> 一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用
<130> 001
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1116
<212> DNA
<213>
<400> 1
ttccttgcaa gtcgaacggt ggacacggag cttgctctgt gggatcagtg gcgaacgggt 60
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Claims (4)
1.一株微杆菌属菌株，能够完全降解赤霉烯酮，命名为Microbacterium sp. FY1538，菌种保藏号为CGMCC NO. 10614。
2.如权利要求1所述的微杆菌属菌株完全降解赤霉烯酮的应用。
3.如权利要求1所述的微杆菌属菌株完全降解赤霉烯酮的应用，其特征在于具体步骤为：将所述菌株培养在 LB液体培养基中，添加终浓度5-15μl/ml的甲醇；培养温度为25-35℃，震荡或者搅拌培养，转速为100-800rpm，培养时间为24-72小时；对Microbacterium sp.FY1538的培养液，通过离心或者过滤的方法去除菌体，获得培养液上清溶液；取培养液上清溶液500μl，赤霉烯酮25ug，将该培养液上清在30-50℃条件下，与赤霉烯酮经过20-24小时的反应。
4.如权利要求1所述的微杆菌属菌株在发霉谷物脱毒中的应用。
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