JP7363134B2 - 免疫グロブリン結合性タンパク質 - Google Patents
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Description
[1]
ブドウ球菌属細菌由来Protein Aの免疫グロブリン結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドを二つ以上と、当該ポリペプチド間を連結させるためのリンカーとを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質であって、
前記リンカーが、以下の(1)から(3)のいずれかである、前記タンパク質:
(1)配列番号31に記載のアミノ酸配列の繰返し単位1以上からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチド;
(2)配列番号31に記載のアミノ酸の繰り返し単位1以上からなるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有する配列を含むオリゴヌクレオチド;
(3)配列番号31に記載のアミノ酸配列の繰り返し単位1以上からなるアミノ酸配列において、1もしくは数か所での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および/または付加を含むアミノ酸配列を含むオリゴヌクレオチド。
[2]
前記リンカーが、以下の(4)から(6)のいずれかである、[1]に記載のタンパク質:
(4)配列番号31に記載のアミノ酸配列の繰返し単位二以上からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチド;
(5)配列番号31に記載のアミノ酸配列の繰返し単位二以上からなるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むオリゴペプチド;
(6)配列番号31に記載のアミノ酸配列の繰返し単位二以上からなるアミノ酸配列において1もしくは数か所での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および/または付加を含むアミノ酸配列を含むオリゴヌクレオチド。
[3]
ブドウ球菌属細菌由来Protein Aの免疫グロブリン結合ドメインが、以下の(a)から(d)のいずれかである、[1]または[2]に記載のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列の部分配列を少なくとも含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号1に記載のアミノ酸配列またはその部分配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、1もしくは数箇所での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および/または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
(d)配列番号1に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。
[4]
[1]から[3]のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[5]
[4]に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[6]
[4]に記載のポリヌクレオチド、または[5]に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。
[7]
宿主が大腸菌である、[6]に記載の遺伝子組換え宿主。
[8]
[6]または[7]に記載の遺伝子組換え宿主を培養し[1]から[3]のいずれかに記載のタンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。
[9]
不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した[1]から[3]のいずれかに記載のタンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
[10]
[9]に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。
(I)前記ドメインの全アミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよく、
(II)免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、前記ドメインの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
さらに免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、
(III)前記(I)または(II)に記載のポリペプチドにおいて、1もしくは数箇所での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および/または付加を含むポリペプチドであってもよいし、
(IV)前記(I)または(II)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい(以降、(III)および(IV)に記載のポリペプチドをまとめて「改変体」とも表記する)。
前述した五つのドメインのうち、少なくともいずれか一つのドメインの全アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体であってもよいし、
前述した五つのドメインのうち、少なくともいずれか一つのドメインの部分アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体であってもよい。
つまり免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、前述した五つのドメインのうち、いずれか一つのドメイン(例えば、ドメインC)の全長もしくは部分アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体でもよいし、
隣接した複数のドメインの全長(例えば、ドメインB/ZとドメインC)もしくは部分アミノ酸配列(例えば、ドメインB/ZのC末端側からドメインCのN末端側までのアミノ酸残基)、またはその改変体であってもよいし、
前述した五つのドメインのうち任意の複数のドメインの全長(例えば、ドメインAとドメインC)もしくは部分アミノ酸配列(例えば、ドメインAの部分アミノ酸配列とドメインCの部分アミノ酸配列)、またはその改変体であってもよい。
(i)配列番号1に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、2番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、49番目のリジンに相当するアミノ酸残基のメチオニンへの置換、21番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、58番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸、バリン、グリシンまたはアスパラギン酸への置換、3番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンまたはスレオニンへの置換、11番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のリジンまたはチロシンへの置換、15番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、および40番目のバリンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換のうち、少なくともいずれか一つのアミノ酸残基の置換を有するポリペプチド
(ii)配列番号1に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記(i)に記載のアミノ酸置換を少なくとも一つ有し、さらに前記アミノ酸置換の位置以外の1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド
(iii)配列番号1に記載のアミノ酸配列において前記少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有し、前記少なくとも1つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド
(iv)前記(i)から(iii)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに、配列番号1の29番目のグリシンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号1の4番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号1の7番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号1の6番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、および配列番号1の42番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換のうち、少なくともいずれか一つのアミノ酸残基の置換を有するポリペプチド
なお本明細書において「1もしくは数個(数箇所)」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、1から30個、1から20個、1から10個、1から9個、1から8個、1から7個、1から6個、1から5個、1から4個、1から3個、1から2個、1個のいずれかを意味する。前述したアミノ酸残基の置換以外の、アミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および/または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換が挙げられる(タンパク質の構造と機能,メディカル・サイエンス・インターナショナル社,9,2005)。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutantまたはvariant)によって生じるものも含まれる。
(1)免疫グロブリン結合性タンパク質発現ベクターの作製
(1-1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる、天然型ブドウ球菌(Staphylococcus)属細菌由来Protein A(以下、SpA)のドメインC(GenBank No.AAA26676の270番目から327番目までのアミノ酸残基)に対し、アミノ酸置換を導入することで、免疫グロブリン結合活性を有したまま化学的安定性が向上したSpAの免疫グロブリン結合ドメインである、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるリンカーを介して四つ結合したポリペプチドを設計した(配列番号4)。なお配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる天然型SpAドメインCに対し、Lys4Arg(この表記は配列番号1の4番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換されていることを表す、以下同じ)、Lys7Glu、Asn11Lys、Asn21Tyr、Gly29AlaおよびLys58Gluのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。また配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるリンカーは、配列番号31に記載のアミノ酸配列を三つ繰返した配列からなるオリゴペプチドである。さらに配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドには、そのC末端側に不溶性担体へ固定化するためのタグ配列(Lys-Lys-Lys)を付加している(配列番号4の278番目から280番目まで)。
(2-1)50μg/mLのカナマイシンを含む2×YT液体培地(トリプトン1.6%(w/v)、酵母エキス1%(w/v)、塩化ナトリウム0.5%(w/v))20mLに、(1)で作製したpET-SpA4VDADS3を含む遺伝子組換え大腸菌を接種し、前培養した(30℃、16時間)
(2-2)前培養後の培養液100mLを、50μg/mLのカナマイシンを含む2×YT液体培地1Lに接種し、37℃で2から3時間培養後、0.5MのIPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を200μL加えて、さらに20℃で終夜振とう培養した。
(3-1)(2)で調製した、精製免疫グロブリン結合性タンパク質を含む画分を、Amicon Ultra(メルクミリポア社製)により元の体積の10分の1量まで濃縮後、当該濃縮溶液の10倍量のリン酸ナトリウム緩衝液を加えてAmicon Ultra(メルクミリポア社製)により元の体積の10分の1量まで濃縮することで、前記タンパク質溶液の濃縮および緩衝液置換を行なった。
(4-1)(3)で作製した免疫グロブリン吸着剤を50%(w/v)スラリーに調製し、当該スラリー100μLをミニバイオスピンカラム(BIORAD社製)へ添加した。
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、配列番号20に記載のアミノ酸配列からなるリンカーを介して四つ結合したポリペプチドを設計した(配列番号21)。なお配列番号20に記載のアミノ酸配列からなるリンカーは、配列番号32に記載のアミノ酸配列(GSリンカー)を三つ繰返した配列からなるオリゴペプチドである。さらに配列番号21に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドには、そのC末端側に不溶性担体へ固定化するためのタグ配列(Lys-Lys-Lys)が付加されている(配列番号21の278番目から280番目まで)。
PCRプライマーセットとして配列番号22および配列番号23に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、N末端側にある、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド(N末端側から数えて一つ目)を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ポリヌクレオチドA)が合成され、
PCRプライマーセットとして配列番号25および配列番号26に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、C末端側にある、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド(N末端側から数えて四つ目)を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ポリヌクレオチドB)が合成され、
PCRプライマーセットとして配列番号24および配列番号23に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、N末端側とC末端側との間にある、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド(N末端側から数えて二つ目または三つ目)を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ポリヌクレオチドC)が合成される。
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるSpA免疫グロブリン結合ドメインを、リンカーを介さず六つ連結したポリペプチドを設計した(配列番号27)。
免疫グロブリン結合性タンパク質として、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるSpA免疫グロブリン結合ドメインを、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるリンカーを介して六つ連結したポリペプチド(配列番号28)を用いた他は、比較例2と同様な方法で、前記ポリペプチドを発現可能な遺伝子組み換え大腸菌の調製、免疫グロブリン吸着剤の作製、および当該吸着剤の静的吸着量の算出を行なった。
免疫グロブリン結合性タンパク質として、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるSpA免疫グロブリン結合ドメインを、配列番号29に記載のアミノ酸配列からなるリンカーを介して六つ連結したポリペプチド(配列番号30)を用いた他は、比較例2と同様な方法で、前記ポリペプチドを発現可能な遺伝子組み換え大腸菌の調製、免疫グロブリン吸着剤の作製、および当該吸着剤の静的吸着量の算出を行なった。なお配列番号29に記載のアミノ酸配列からなるリンカーは、配列番号31に記載のアミノ酸配列を五つ繰返した配列からなるオリゴペプチドである。
Claims (8)
- ブドウ球菌属細菌由来Protein Aの免疫グロブリン結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドを四つ以上と、当該ポリペプチド間を連結させるためのリンカーとを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質であって、
前記リンカーが、配列番号31に記載のアミノ酸配列の繰返し単位3以上からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドであって、
ブドウ球菌属細菌由来Protein Aの免疫グロブリン結合ドメインが、以下の(a)から(c)のいずれかである、前記タンパク質:
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1から5個のアミノ酸残基の置換、欠失および/または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチド、または請求項3に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。
- 宿主が大腸菌である、請求項4に記載の遺伝子組換え宿主。
- 請求項4または5に記載の遺伝子組換え宿主を培養し請求項1に記載のタンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。
- 不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した請求項1に記載のタンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
- 請求項7に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。
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