CN118191294A - 一种非侵入性尿酸比色试纸及其制造方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的非侵入性尿酸比色试纸及其制造方法和检测方法,包括亲水衬垫和疏水衬垫,亲水衬垫固定设置在疏水衬垫靠近一端的位置;亲水衬垫上饱和浸渍包括显色剂、多功能改性剂、尿酸酶和辣根过氧化物酶的混合试剂。使用结合酶反应、氧化反应和催化反应的方法,利用特定显色剂和多功能改性剂检测尿酸水平。在含有尿酸的溶液中,三个主要连续反应导致亲水垫的颜色从无色变为蓝色。更高浓度的尿酸产生更高浓度的H2O2,形成更高浓度的二胺‑二亚胺电荷转移(CT)复合物,导致更强烈的蓝色。根据蓝色强度的差异,可以确定生物体液中尿酸水平,特别是在尿样本中。可以无创快速现场测试尿酸,实现尿酸水平检测结果的快速实时获取。
Description
技术领域
本发明属于医疗检测设备技术领域,具体涉及一种非侵入性尿酸比色试纸及其制造方法和检测方法。
背景技术
尿酸是人体内嘌呤代谢的终末产物,正常情况下大约有三分之一的尿酸通过胃肠道***,其余三分之二通过尿液***;当尿液中的尿酸过量时则会发生一种称为高尿酸尿的情况。高尿酸尿不仅与血液中尿酸水平过高(即高尿酸血症)相关,还可能与痛风疾病相关,还可能进一步地对人体健康具有其他方面独立的重要影响;尿液中尿酸水平升高会导致肾脏和膀胱中尿酸和草酸钙结石的形成。此外,持续高水平的尿酸尿还可能促成慢性肾病(CKD)的发展。因此,除了持续努力检测高尿酸血症外,还必须重视识别低尿酸尿和高尿酸尿(尿液中尿酸水平偏低和偏高)。通过监测和处理尿液中的尿酸水平,医疗保健专业人员可以更好地评估肾结石形成和肾病的风险,从而改善患者的预后和整体健康状况。
临床检查传统测定尿液中尿酸水平的方法通常采用专用的尿生化分析仪,将现场采集或24小时收集的尿液样本引入设备中,添加液体形式的试剂混合物,再通过在装置中的光谱仪测量光吸光度的变化;待检患者需要留置24小时尿样,冷藏,并且在一小时内送到病理诊所,在实验室进行复杂的检验处理程序,以获得最佳检测结果,以确保检测结果准确可靠;尿生化分析仪通常只配置在病理诊所等相关专业场所,操作不方便,耗费时间长,不能实现现场快速检验,不能轻易重复测试操作;现场快速检验能够快速实时获得检测结果,从而根据检测结果实时采取应对措施,例如如果检测结果显示尿尿酸水平高,则除了通过相关的药物治疗以外,还需要建议患者注意饮食,摄入低嘌呤饮食,多运动,保持身体水分,几个月后重复检测;而对于众多普通百姓来说,严格管理生活方式并不容易实现;通过家庭快速即时检测有助于个人追踪其日常饮食和生活方式对其健康的影响。
现有技术中能够现场快速检验快速得到检验结果的POCT检测装置和检测方法只能用于血尿酸水平的POCT检测,不能用于尿尿酸的POCT检测;现有技术中的尿液试剂条虽然能够定性和半定量检测尿液中的各种分析物,包括白细胞、尿胆原、微量白蛋白、蛋白质、胆红素、葡萄糖、抗坏血酸、比重、酮体、亚硝酸盐、肌酐、pH值、血液和钙,其基于比色法(通常是视觉比色法)工作,也遗漏了尿尿酸检测;现有技术中的家用POCT试纸条已经商业化,可用于检测尿液中不同的分析物,但是其同样遗漏了尿尿酸检测。例如专利公开号为CN116482090A的《一种新型尿酸检测试纸》发明专利,其公开的技术方案中采用OPD作为尿酸检测的显色剂,采用含有OPD底物的纸片作为底物片,在检测过程中产生的DAP可见的颜色改变是从无色到黄色,通过肉眼不易清晰观察不同浓度尿酸时的黄色颜色变化情况,需要依靠光谱仪才能检测光吸收的变化,该方法成本高昂,且不能作为POCT进行快速即时检验。
现有技术中的临床和医院检查昂贵、耗费时间长、操作不方便,而且不能每天或偶尔重复。因此,现有技术中缺少一种能够实现现场快速检验尿尿酸的POCT检测装置。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题,本发明目的在于提供一种非侵入性尿酸比色试纸及其制造方法和检测方法,用于检测生物液体样本,特别是尿液样本;无需去临床和医院等专业检测场所,成本低,耗费时间少,操作方便,能够实现非侵入式地现场快速检验尿尿酸,从而快速实时获得尿尿酸水平检测结果。
本发明所采用的技术方案为:
第一技术方案:提供一种非侵入性尿酸比色试纸,包括有亲水衬垫和疏水衬垫,所述亲水衬垫为矩形结构,所述疏水衬垫为长条形结构,所述亲水衬垫固定设置于疏水衬垫的上表面靠近一端的位置;
所述亲水衬垫上设置有混合试剂;所述混合试剂用于暴露在尿酸样本时发生连续的选择性酶反应和催化氧化反应;
所述混合试剂至少包括有尿酸酶、辣根过氧化物酶、显色剂和多功能改性剂;
所述尿酸酶用于选择性捕获尿酸分子后转化为5-脲基乙内酰脲,二氧化碳和作为氧化剂的过氧化氢;
所述显色剂用于与过氧化氢发生单电子氧化反应,首先产生一种自由基阳离子,然后形成蓝色二胺-二亚胺电荷转移复合物;
所述辣根过氧化物酶用于催化并促进亲水衬垫中显色剂的单电子氧化反应;
所述多功能改性剂用于通过交联和接枝将尿酸酶和辣根过氧化物酶固定于亲水衬垫内,增加显色剂稳定性和色素在亲水衬垫内的分布均匀性,以及亲水性垫的润湿性。
进一步地,所述多功能改性剂为D(+)-海藻糖二水合物、明胶、壳聚糖、戊二醛、甲氧基聚乙二醇丙醛、乙二胺四乙酸、聚乙二醇辛基苯基醚、聚丙二醇和甘油中的一种或者多种混合物。
进一步地,所述亲水衬垫的材料为吸收纸、滤纸或者层析纸。
进一步地,所述疏水衬垫的材料为疏水材料。
进一步地,所述显色剂为3,3′,5,5′-四甲基联苯二胺。
进一步地,所述亲水衬垫的面积为16-49mm2,所述显色剂饱和浸渍于亲水衬垫内。
进一步地,所述亲水衬垫内饱和浸渍有6-30ul混合试剂。
第二技术方案:提供一种非侵入性尿酸比色试纸制造方法,用于制造非侵入性尿酸比色试纸,包括以下制作步骤:
S01,备料矩形亲水衬垫和条带形疏水衬垫;
S02,制备混合试剂,并通过混合试剂浸渍亲水衬垫后干燥;
通过pH为8-9的缓冲溶液、20-140u/mL尿酸酶、0.1-0.3mg/mL辣根过氧化物酶、浓度为5-25mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯二胺和10-30%的多功能改性剂制备混合试剂;采用混合试剂饱和浸渍亲水衬垫后,干燥,密封存储;
或者,制备溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ;将壳聚糖粉溶于稀释的乙酸中,得到浓度为0.5~3mg/ml的壳聚糖溶液Ⅰ;将3,3′,5,5′-四甲基联苯二胺溶液溶解在醇溶液中,得到浓度为5-25mM的溶液Ⅱ;将辣根过氧化物酶溶于pH为6-7的缓冲液中,得到溶液Ⅲ;将尿酸酶溶解在pH为8-9的缓冲溶液中,得到溶液Ⅳ;将亲水衬垫依次浸透溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ并分别晾干后,密封存储;
S03,将亲水衬垫固定粘合于疏水衬垫的一端;
S04,制得非侵入性尿酸比色试纸。
第三技术方案:提供另外一种非侵入性尿酸比色试纸制造方法,用于制造上述非侵入性尿酸比色试纸,包括以下制作步骤:
S01,备料亲水纸张原料和疏水片材原料;
S02,通过冲剪裁切工艺将亲水纸张原料制成若干块边长为4~7mm的矩形亲水衬垫;
S03,通过冲剪裁切工艺将疏水片材原料制成若干条4~7mm×50~100mm的条带形疏水衬垫;
S04,将尿酸酶溶解于缓冲溶液中制备尿酸酶溶液;
S05,将适量辣根过氧化物酶溶解于缓冲液中制备辣根过氧化物酶溶液;
S06,将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶解于甲醇或乙醇的醇溶液中制备显色剂溶液;
S07,将壳聚糖粉末溶于稀释的乙酸中制备壳聚糖溶液;
S08,取尿酸酶溶液、辣根过氧化物酶溶液、显色剂溶液和壳聚糖溶液,混合制成混合溶液;
S09,在每块亲水衬垫上分别沉积6-30ul混合溶液;
S10,将亲水衬垫在25~40℃温度条件下孵育15-90分钟;
S11,干燥,使试剂固定化;
S12,将亲水衬垫固定粘合于疏水衬垫的一端;
S13,制得非侵入性尿酸比色试纸。
第四技术方案:提供一种非侵入性尿酸比色试纸的检测方法,使用上述非侵入性尿酸比色试纸,包括以下制作步骤:
P01,根据显色剂从无色变为蓝色过程中的颜色变化情况,预设多个不同蓝色深度级别;
P02,用缓冲液或人工尿液制备尿酸样品;
P03,将尿酸样本滴加至非侵入性尿酸比色试纸的亲水衬垫上,或者将亲水垫浸入尿酸样品中1秒;
P04,尿酸浓度不同,蓝色的强度也不同;通过肉眼与标准色表比较颜色来确定尿酸样品的尿酸浓度,或者通过计算机视觉数字分析来确定尿酸浓度。
本发明的有益效果为:
一种非侵入性尿酸比色试纸及其制造方法和检测方法,包括亲水衬垫和疏水衬垫,亲水衬垫固定设置于疏水衬垫的上表面靠近一端的位置;在亲水衬垫上饱和浸渍包括显色剂、多功能改性剂、尿酸酶和辣根过氧化物酶的混合试剂,采用酶促反应、氧化反应和催化反应相结合的方法,使用特异性显色剂和多功能改性剂检测尿酸水平;在含有尿酸的溶液存在下,三种主要的连续反应导致亲水衬垫的颜色从无色变为蓝色;高浓度的尿酸产生高浓度的H2O2,进而形成高浓度的二胺-二亚胺电荷转移(CT)复合物即在本发明中称为TMB(CT-OX),导致蓝色越来越深。不同浓度的尿酸,其蓝色强度不同,肉眼可检测到。肉眼可以观察到明显的颜色差异,特别是尿液样本中尿酸水平的无、下限和上限;能够实现非侵入式地现场快速检验尿尿酸,从而快速实时获得尿尿酸水平检测结果。
本发明非侵入性尿酸比色试纸,提供一种低成本、操作简单、易于使用的POCT检测尿尿酸的方法,无需去临床和医院等专业检测场所,成本低,耗费时间少,操作方便,可以每天在任何地点重复多次,跟踪监测患者的生活方式对尿尿酸水平的影响。
附图说明
图1是本发明的非侵入性尿酸比色试纸结构示意图;
图2是本发明的非侵入性尿酸比色试纸测尿酸溶液示意图,显示了两种测试方法:将尿酸滴加到亲水垫上或将亲水垫浸入尿酸样品中1秒;
图3是本发明的一个示意图,显示了使用非侵入性尿酸比色测试条检测尿酸的化学步骤和机制;
图4是本发明的非侵入性尿酸比色试纸在添加不同浓度尿酸溶液时的尿酸浓度与Δ(灰度值)之间的相关性线性示意图;
图5是本发明的非侵入性尿酸比色试纸在添加不同浓度尿酸溶液时的六个不同尿酸水平的蓝色深度级别示意图。
具体实施方式
下面对本发明实施例一中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明的目标是通过开发一种低成本、对用户友好的家用POCT传感器用于检测尿液中的尿酸,为人类健康做出贡献,具体提供一种无创试纸传感器使得患者个人能够方便地重复进行测试,从而能够有效管理自己的生活方式和药物以改善健康。本发明的非侵入式条形传感器能够让患者个人在任何时间和地点执行和重复测试,帮助患者合理控制和管理其生活方式以及药物使用情况,以更好的保持健康状态。本发明的目的是为了提供一种家用即时检测(POCT)设备,使得患者个人能够随时监测其日常习惯对健康的影响。
本发明为了解决现有技术中存在的问题,具体策划方案如下:
第一技术方案提供一种非侵入性尿酸比色试纸,作为用于检测生物体液中尿酸的干化学试纸传感器,特别是用于检测尿液中尿酸的干化学试纸传感器;或者作为用于检测低尿酸尿和高尿酸尿的干化学条形试纸传感器。
本发明的非侵入性尿酸比色试纸包括固定试剂混合物的亲水衬垫1和用于操纵试纸传感器的疏水衬垫2,如图1所示;亲水衬垫1固定设置于疏水衬垫2的上表面靠近一端的位置;亲水衬垫1为矩形结构,亲水衬垫1的材料为吸收纸、层析纸、滤纸或者色谱纸。疏水衬垫2为长条形结构,疏水衬垫2的材料为由疏水性聚合物构成的疏水性材料,例如塑料,疏水衬垫2的材料具体可以优选PVC(聚氯乙烯)。
在亲水衬垫(下称亲水性衬垫、亲水性垫、亲水垫)上设置混合试剂(也即试剂混合物);混合试剂至少包括显色剂、多功能改性剂(多功能修饰剂、非反应性稳定剂、多功能稳定剂)、尿酸酶和辣根过氧化物酶;
通过尿酸酶可以与尿酸通过酶促反应产生过氧化氢;也即通过尿酸酶可以选择性捕获尿酸分子,将它们转化为5-脲基乙内酰脲,二氧化碳(CO2)和作为氧化剂的过氧化氢(H2O2)。
通过显色剂可以与过氧化氢(H2O2)发生氧化反应,首先产生一种自由基阳离子,然后形成蓝色二胺-二亚胺电荷转移(CT)复合物。并根据过氧化氢的浓度显示不同深度的蓝色;显色剂采用特异性显色剂,具体可以采用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。
通过辣根过氧化物酶可以催化加速显色剂的氧化反应;也即通过辣根过氧化物酶(HRP)可以催化并促进水性垫中TMB的单电子氧化反应。
亲水衬垫的面积为16-49mm2,显色剂饱和浸渍在亲水衬垫内。具体在16-49mm2亲的水衬垫内可以饱和浸渍6-30ul显色剂。
多功能改性剂可以通过交联和接枝将尿酸酶和辣根过氧化物酶固定于亲水衬垫内,增加显色剂稳定性和色素在亲水衬垫内的分布均匀性,以及亲水性垫的润湿性。
多功能改性剂为D(+)-海藻糖二水合物、明胶、壳聚糖、戊二醛、甲氧基聚乙二醇丙醛、乙二胺四乙酸、聚乙二醇辛基苯基醚、聚丙二醇和甘油中的一种或者多种混合物。
本发明中采用干化学和比色学相结合的原理制作POCT尿尿酸的干化学条带试纸,利用一系列酶反应、催化——单电子氧化反应和平衡的电荷转移复合物形成反应来对检测目标产生响应;通过酶促反应、氧化反应和催化反应相结合的方法,使用特异性显色剂和多功能稳定剂检测尿酸水平。本发明的非侵入性尿酸比色试纸为条带状试纸结构,通过一个浸渍了试剂的亲水性衬垫固定附着在疏水性衬垫上。疏水性衬垫的首选材料是疏水材料,最好是PVC;亲水性衬垫的优选主要组份是吸收纸,优选层析纸或滤纸。采用试剂混合物饱和浸渍在亲水性衬垫内,然后干燥,也即将试剂混合物饱和浸渍在衬垫内并干燥以稳定固定。配制混合试剂并进行优化以获得最佳结果,该混合试剂含有两种酶:尿酸酶和辣根过氧化物酶;(两种酶一种是尿酸酶,尿酸酶用于特定尿酸捕获,即用于与尿酸选择性相互作用;另外一种是辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶作为色素试剂氧化催化剂,即用于显色剂的催化氧化)、一种显色剂(即色素试剂,采用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺或TMB)和多功能改性剂。多功能改性剂可以采用一种或者或两种或者多种以下材料的组合:D(+)-海藻糖二水合物,明胶,壳聚糖,戊二醛,甲氧基聚乙二醇丙醛,乙二胺四乙酸(乙酸),Triton X-100,聚丙烯醇(聚丙烯乙二醇)和甘油;多功能改性剂具有各种作用,例如通过交联增强酶的固定,改善色素试剂的稳定性,确保颜色均匀分布和增强润湿性。亲水性衬垫内浸渍试剂混合物的具体容量范围,在面积为16-49mm2的亲水性衬垫内浸渍6-30ul的混合试剂使之达到饱和浸渍。混合试剂干燥后稳定固定在亲水性衬垫内,从而构成易于操作POCT尿尿酸的干化学条带试纸。
本发明中的混合试剂整合稳定固定于亲水性衬垫内,从而构成了便于现场快速检测应用的(POCT)比色尿酸干化学条带试纸;比色尿酸干化学条带试纸与含尿酸样本接触时,比色尿酸干化学条带试纸通过三个不同的连续反应导致亲水性衬垫的颜色从无色变为蓝色,这些反应如下三个反应式所示:
反应式一:
反应式二:
反应式三:
首先,尿酸分子通过固定在亲水性衬垫内的尿酸酶催化的选择性酶反应被捕获。这种相互作用将尿酸分子转化为5-脲基乙内酰脲、二氧化碳(CO2)和作为氧化剂的过氧化氢(H2O2)。随后,在前一步骤中的氧化剂与亲水性衬垫内的显色试剂3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)之间发生单电子氧化反应。这第二次氧化反应由同样存在于亲水性衬垫内的HRP催化剂催化和促进。结果是形成色素TMB·+的无色自由基阳离子形式。最后,快速平衡反应产生了一种称为TMB(CT-OX)的蓝色二胺-二亚胺电荷转移(CT)复合物。这个复合物负责在亲水性衬垫内形成蓝色。更高的尿酸浓度分产生更多的TMB(CT-OX),导致更加明显和深色的蓝色色调。即蓝色的强度随着不同尿酸浓度而变化,使得可以用肉眼进行视觉检测。
尿酸和固定在传感器亲水垫内的尿酸酶之间的选择性相互作用导致5-脲基乙内酰脲、二氧化碳(CO2)和过氧化氢(H2O2)的产生。其中,过氧化氢是一种氧化剂,可以氧化固定在亲水垫中的显色剂3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。后者的反应在环境条件下是缓慢的;因此,通过固定在亲水性垫中的辣根过氧化物酶(HRP)催化剂来进一步加速反应。氧化后,TMB的电荷转移(CT)复合物形成,它是蓝色的,称之为TMB(CT-ox)。高浓度的尿酸产生高浓度的H2O2,进而形成高浓度的TMB(CT-OX),导致蓝色越来越深。不同浓度的尿酸,其蓝色强度不同,肉眼可检测到。肉眼可以观察到明显的颜色差异,特别是尿液样本中尿酸水平的无、下限和上限。
现阶段家庭现场检测(POCT)尿液试纸检测虽然已用于检测尿液中的各种分析物,但是并不包括尿酸的检测。临床和医院用于测定尿液中尿酸水平的方法通常采用专用的尿生化分析仪,测试费用高、耗时长、令人不适,不利于每天或间歇性重复。本发明的技术方案将干化学和比色学相结合的点护理测试(POCT)方法应用于尿尿酸检测的发展,提出了一种经济实惠、易于使用的POCT方法,用于检测尿液中的尿酸。这种方法操作简单,可以在一天内多次重复,使患者个人能够监测他们的生活方式对尿液中尿酸水平的影响,无论身处何地。
本发明中采用干化学和比色学相结合的原理制作POCT尿尿酸的干化学条带试纸,混合试剂中使用的酶是尿酸氧化酶(也称为尿酸酶)和一种过氧化物酶。用尿酸酶与尿酸进行特异性和选择性反应。采用辣根过氧化物作为催化剂对显色剂进行氧化。其中,3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)作为显色剂。尿酸与固定在亲水性垫内的尿酸酶相互作用,导致5-脲基乙内酰脲、CO2和H2O2的产生。所产生的H2O2是一种氧化剂,它将TMB氧化成自由基阳离子(TMB·+),然后迅速形成二胺-二亚胺电荷转移(CT)复合物即在本发明中称为TMB(CT-OX)。TMB是无色的而TMB(CT-OX)是蓝色的。高浓度的尿酸会产生更多的H2O2,从而产生更多的TMB(CT-OX),从而导致更深的蓝色。本实验中使用了多功能改性剂,其具有多种优点,包括更好地固定试剂,尤其是酶在亲水垫上,更高的显色剂稳定性,颜色在亲水垫内均匀分布,pH稳定性。更好的固定试剂,特别是增加酶和显色剂的稳定性,并保持其活性在亲水垫。
第二技术方案提供一种非侵入性尿酸比色试纸的制造方法,用于制造上述非侵入性尿酸比色试纸,包括以下制作步骤:
S01,备料亲水纸张原料和疏水片材原料;
S02,通过冲剪裁切工艺将亲水纸张原料制成若干块边长为4~7mm的矩形亲水衬垫;
S03,通过冲剪裁切工艺将疏水片材原料制成若干条(4~7)mm×(50~100)mm的条带形疏水衬垫;
S04,将尿酸酶溶解于缓冲溶液中制备尿酸酶溶液;
S05,将适量辣根过氧化物酶溶解于缓冲液中制备辣根过氧化物酶溶液;
S06,将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶解于甲醇或乙醇的醇溶液中制备显色剂溶液;
S07,将壳聚糖粉末溶于稀释的乙酸中制备壳聚糖溶液;
S08,取尿酸酶溶液、辣根过氧化物酶溶液、显色剂溶液和壳聚糖溶液,混合制成混合溶液;
S09,在每块亲水衬垫上分别沉积6-30ul混合溶液;
S10,将亲水衬垫在25~40℃温度条件下孵育15-90分钟;
S11,干燥,使试剂固定化;
S12,将亲水衬垫固定粘合于疏水衬垫的一端;
S13,制得非侵入性尿酸比色试纸。
进一步地,步骤S08中,还添加多功能改性剂制备混合溶液;
多功能改性剂为D(+)-海藻糖二水、明胶、壳聚糖、戊二醛、甲氧基聚乙二醇丙醛、依地酸和甘油中的一种或者多种混合物。
第三技术方案:
S01,备料矩形亲水衬垫和条带形疏水衬垫;
S02,制备混合试剂,并通过混合试剂浸渍亲水衬垫后干燥;
通过pH为8-9的缓冲溶液、20-140u/mL尿酸酶、0.1-0.3mg/mL HRP、浓度为5-25mM的TMB和10-30%的多功能改性剂制备混合试剂;采用混合试剂饱和浸渍亲水衬垫后,干燥,密封存储;
或者,制备溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ;将壳聚糖粉溶于稀释的乙酸中,得到浓度为0.5~3mg/ml的壳聚糖溶液Ⅰ;将TMB溶液溶解在醇溶液中,得到浓度为5-25mM的溶液Ⅱ;将HRP溶于pH为6-7的缓冲液中,得到溶液Ⅲ;将尿酸酶溶解在pH为8-9的缓冲溶液中,得到溶液Ⅳ;将亲水衬垫依次浸透溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ并分别晾干后,密封存储;
S03,将亲水衬垫固定粘合于疏水衬垫的一端;
S04,制得非侵入性尿酸比色试纸。
第四技术方案:提供一种非侵入性尿酸比色试纸的检测方法,采用前述非侵入性尿酸比色试纸,包括以下制作步骤:
P01,根据显色剂从无色变为蓝色过程中的颜色变化情况,预设多个不同蓝色深度级别;
P02,用缓冲液或人工尿液制备尿酸样品;
P03,将尿酸样本滴加至非侵入性尿酸比色试纸的亲水衬垫上,或者将亲水垫浸入尿酸样品中1秒;
P04,尿酸浓度不同,蓝色的强度也不同;通过肉眼与标准色表比较颜色来确定尿酸样品的尿酸浓度,或者通过计算机视觉数字分析来确定尿酸浓度。
实际操作过程中,在步骤P01中,可以根据显色剂从无色变为蓝色过程中的颜色变化情况,预设六个不同蓝色深度级别,也可以预设更多不同蓝色深度级别或者更少不同蓝色深度级别;
在步骤P04中,待亲水衬垫颜色变化稳定后,与预设六个不同蓝色深度级别对比,或者与更多不同蓝色深度级别对比,或者与更少不同蓝色深度级别对比,判断确认尿酸样本的尿酸浓度。
本发明的非侵入性尿酸比色试纸及其制造方法和检测方法,包括亲水衬垫和疏水衬垫,亲水衬垫固定设置于疏水衬垫的上表面靠近一端的位置;在亲水衬垫上饱和浸渍包括显色剂、多功能稳定剂、尿酸酶和辣根过氧化物酶的混合试剂,采用酶促反应、氧化反应和催化反应相结合的方法,使用特异性显色剂和多功能稳定剂检测尿酸水平;在含有尿酸的溶液存在下,通过三个连续反应导致亲水衬垫的颜色从无色变为蓝色;高浓度的尿酸产生高浓度的H2O2,进而形成高浓度的TMB(CT-OX),导致蓝色越来越深;三个连续反应如下三个反应式所示:
反应式一:
反应式二:
反应式三:
不同浓度的尿酸,其蓝色强度不同,肉眼可检测到。肉眼可以观察到明显的颜色差异,特别是尿液样本中尿酸水平的无、下限和上限;能够实现非侵入式地现场快速检验尿尿酸,从而快速实时获得尿尿酸水平检测结果。
本发明非侵入性尿酸比色试纸,提供一种低成本、操作简单、易于使用的POCT检测尿尿酸的方法,无需去临床和医院等专业检测场所,成本低,耗费时间少,操作方便,可以每天在任何地点重复多次,跟踪监测患者的生活方式对尿尿酸水平的影响。
实施例一:
实施例一按照策划技术方案的发明构思,实验一种用于制备非侵入性尿酸比色试纸的混合试剂,也即试剂混合物,具体操作过程如下:
制备试剂混合物的原料为:pH在8-9范围内的缓冲溶液;20-140u/mL尿酸酶,0.1-0.3mg/mL HRP,和浓度为5-25mM的TMB,以及10-30%(体积/体积)的多功能改性剂(多功能修饰剂)。多功能改性剂是不干扰主要反应并提供几种好处的材料,包括在亲水衬垫内颜色的均匀分布,改善酶的固定和稳定性,增加润湿性。它们同时作为稳定剂、表面活性剂和络合剂。多功能改性剂采用以下材料中的一个或两个或更多个的组合:D(+)-海藻糖二水合物,明胶,壳聚糖,戊二醛,甲氧基聚乙二醇丙醛,乙二胺四乙酸,Triton X-100,聚丙烯甘油醚,和甘油。缓冲溶液可以从磷酸缓冲液、布氏-罗宾逊缓冲液和柠檬酸缓冲液等选项中选择,其中磷酸缓冲液是最受青睐的。亲水性垫被上述混合物浸渍和饱和,干燥,然后存放在带有干燥剂的密封容器中。
实施例二:
实施例二按照策划技术方案的发明构思,实验一种用于制备非侵入性尿酸比色试纸的亲水衬垫,具体操作过程如下:
制备两组不同的试剂混合物,分别标记为“混合物I”和“混合物II”("Mixture I"和"Mixture II")。“混合物I”("Mixture I")由缓冲溶液、尿酸酶、HRP和多功能改性剂组成,“混合物II”("Mixture II")由显色试剂(具体为3,3',5,5'-四甲基联苯胺)以及醇溶液(醇溶液优选甲醇或者乙醇溶液)组成。亲水性垫依次浸渍“混合物I”和“混合物II”("Mixture I"和"Mixture II")。首先,用亲水衬垫“混合物II”("Mixture II")浸透亲水衬垫并干燥。然后,用“混合物I”("Mixture I")浸透亲水衬垫并干燥。干燥过程在25-75℃的温度下进行。按照策划技术方案,每一步骤的理想操作时间为1-10分钟。
实施例三:
实施例三按照策划技术方案的发明构思,实验另外一种用于制备非侵入性尿酸比色试纸的亲水衬垫,具体操作过程如下:将混合试剂逐层添加到亲水性垫上。
准备了四种不同的浸渍溶液:
Ⅰ)将壳聚糖粉溶于稀释的乙酸中,得到浓度为0.5~3mg/ml的壳聚糖溶液Ⅰ。
Ⅱ)将TMB溶液溶解在醇溶液中,得到浓度为5-25mM的溶液Ⅱ;醇溶液可以是甲醇或乙醇溶液。
Ⅲ)将HRP溶于pH为6-7的缓冲液中,制备浓度为0.1-0.6mg/ml的HRP溶液。得到溶液Ⅲ。
Ⅳ)将尿酸酶溶解在pH为8-9的缓冲溶液中,生成每体积活性为20-140u/ml的尿酸酶溶液。得到溶液Ⅳ。
将亲水衬垫分四个步骤依次浸透上述四种溶液:溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ。首先将亲水衬垫浸透溶液Ⅰ然后晾干;再浸透溶液Ⅱ再晾干;接着浸透溶液Ⅲ晾干;然后浸透溶液Ⅳ并晾干,最后存放于带干燥剂的密闭容器中。
并按照策划技术方案的发明构思制备本发明的非侵入性尿酸比色试纸。
实施例四:
实施例四按照策划技术方案的发明构思,制备尿酸样品;具体操作过程如下:
尿酸标准溶液配有不同浓度制备于缓冲溶液,涵盖0.0mM(对照样本)、0.02mM、0.1mM、0.4mM、1.3mM以及4.5mM的尿酸浓度,代表尿酸的从低到高水平。取样3-20μl的尿酸样品以满足检测要求并得到检测结果。
实施例五:
实施例五按照策划技术方案的发明构思,制备尿酸样品;具体操作过程如下:
采用另一种实验方法,进行了参照类似实验,其中尿酸标准样本包括0.0mM(对照样本)、0.02mM、0.1mM、0.4mM、1.3mM以及4.5mM的尿酸浓度,并使用人工尿溶液进行制备。
实施例六:
实施例六按照策划技术方案的发明构思,通过施例三中制备的用于制备非侵入性尿酸比色试纸的亲水衬垫和非侵入性尿酸比色试纸(测试条),进行尿酸水平的测试验证;在实施例三中制备的非侵入性尿酸比色试纸的亲水衬垫滴加实施例四和实施例五中制备的各尿酸样品,如图2所示。
实验操作过程中通过微量移液管滴加尿酸样品(如实验4和实验5所述较少的尿酸样品量3-20μl尿酸样品)至亲水衬垫,即获得了检测结果;因此,日常使用过程中将非侵入性尿酸比色试纸的亲水衬垫浸入尿样,足以引发试纸传感器的响应,然后取出,放在白色餐巾纸或白纸上更能可靠得出结果,有利于后续拓展检测应用范围。
实验过程中根据测试结果绘制灰度值线性图,如图3所示,经过不同浓度尿酸处理的测试条产生了明显的颜色变化。这些颜色差异可以通过肉眼进行观察。响应速度很快,一旦尿酸样品到达亲水垫,颜色就会发生变化。在所有实例中,颜色变化在不到2分钟内就稳定下来,足以进行肉眼检测或数字分析。这种颜色稳定性带来显著优势,因为它减少了个体在完成测试和比较颜色时所需的时间差。值得注意的是,含有多功能改性剂的实施例具有更长的颜色稳定性。本发明的非侵入性尿酸比色试纸能够检测尿酸浓度低至0.02mM,高至4.5mM的尿酸水平。因为24小时内尿酸浓度超过4.2mM会导致肾结石、痛风病和其他肾功能障碍的风险,因此,本发明的非侵入性尿酸比色试纸检测灵敏度理有利于日常监测尿酸水平和保持身体健康。此外,实验发现,制备本发明的非侵入性尿酸比色试纸可以使用单一的浸渍溶液在一个步骤中实现,从而有效地减少了制造过程的时间和成本。
图4展示了本发明的非侵入性尿酸比色试纸的检测响应效果,并举例说明了我们实验中获得的视觉色度结果。照片是使用iPhone 13相机拍摄的,相机平行放置在白色纸张背景的条形比色试纸的上方。虽然不含尿酸的溶液不会改变衬垫上的颜色,但不同浓度尿酸的溶液呈现不同深度的蓝色强度。可以通过肉眼观察到由于尿酸浓度不同而产生的颜色差异。此外,后续还可以拓展颜色/浓度校准,以制作参考色彩图表。此外,后续还可以拓展数字分析技术,可用于更多生物流体,特别是尿液中尿酸的定量测量。该分析可拓展后通过计算机软件或智能手机进行。例如,使用ImageJ软件进行颜色分析以评估灰度值,特别是平均灰度值。然后,从每种颜色的平均灰度值中减去0.0mM(无尿酸)的平均灰度值以获取Δ(灰度值)。评估尿酸浓度与Δ(灰度值)之间的相关性,如图5所示尿酸浓度的对数与Δ(灰色值)之间的线性相关性,除灰度色外,还给出了相应的颜色以供比较。
还观察到尿酸浓度的对数与Δ(灰度值)之间存在线性相关关系,R2值为0.9379。这些结果表明,尿酸浓度的对数与通过颜色分析计算出的Δ(灰度值)呈线性相关。这些相关性适用于开发针对尿液等生物样本中尿酸含量的更多定量分析。
实施例六中最终确定六个蓝色强度等级,如图5所示对不同浓度尿酸的响应,深蓝色表示尿酸浓度较高,分别代表从0.0mM至4.5mM的不同尿酸浓度水平。
实际操作过程中也可以根据显色剂从无色变为蓝色过程中的颜色变化情况,预设多个不同蓝色深度级别;
尿酸浓度不同,蓝色的强度也不同。尿酸样品的尿酸浓度既可以通过肉眼与色表比较颜色来确定尿酸浓度,后续随着智能控制程序与操作***的拓展与完善,也可以通过数字分析和计算机视觉***来确定尿酸浓度。
本发明不局限于上述可选实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:包括有亲水衬垫和疏水衬垫,所述亲水衬垫为矩形结构,所述疏水衬垫为长条形结构,所述亲水衬垫固定设置于疏水衬垫的上表面靠近一端的位置;
所述亲水衬垫上设置有混合试剂;所述混合试剂用于暴露在尿酸样本时发生连续的选择性酶反应和催化氧化反应;
所述混合试剂至少包括有尿酸酶、辣根过氧化物酶、显色剂和多功能改性剂;
所述尿酸酶用于选择性捕获尿酸分子后转化为5-脲基乙内酰脲,二氧化碳和作为氧化剂的过氧化氢;
所述显色剂用于与过氧化氢发生单电子氧化反应,首先产生一种自由基阳离子,然后形成蓝色二胺-二亚胺电荷转移复合物;
所述辣根过氧化物酶用于催化并促进亲水衬垫中显色剂的单电子氧化反应;
所述多功能改性剂用于通过交联和接枝将尿酸酶和辣根过氧化物酶固定于亲水衬垫内,增加显色剂稳定性和色素在亲水衬垫内的分布均匀性,以及亲水性垫的润湿性。
2.根据权利要求1所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:所述多功能改性剂为D(+)-海藻糖二水合物、明胶、壳聚糖、戊二醛、甲氧基聚乙二醇丙醛、乙二胺四乙酸、聚乙二醇辛基苯基醚、聚丙二醇和甘油中的一种或者多种混合物。
3.根据权利要求1所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:所述亲水衬垫的材料为吸收纸、滤纸或者层析纸。
4.根据权利要求1所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:所述疏水衬垫的材料为疏水材料。
5.根据权利要求1所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:所述显色剂为3,3′,5,5′-四甲基联苯二胺。
6.根据权利要求1所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:所述亲水衬垫的面积为16-49mm2,所述显色剂饱和浸渍于亲水衬垫内。
7.根据权利要求6所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:所述亲水衬垫内饱和浸渍有6-30ul混合试剂。
8.一种非侵入性尿酸比色试纸制造方法,用于制造权利要求1~7之一所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:包括以下制作步骤:
S01,备料矩形亲水衬垫和条带形疏水衬垫;
S02,制备混合试剂,并通过混合试剂浸渍亲水衬垫后干燥;
通过pH为8-9的缓冲溶液、20-140u/mL尿酸酶、0.1-0.3mg/mL辣根过氧化物酶、浓度为5-25mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺和10-30%的多功能改性剂制备混合试剂;采用混合试剂饱和浸渍亲水衬垫后,干燥,密封存储;
或者,制备溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ;将壳聚糖粉溶于稀释的乙酸中,得到浓度为0.5~3mg/ml的壳聚糖溶液Ⅰ;将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液溶解在醇溶液中,得到浓度为5-25mM的溶液Ⅱ;将辣根过氧化物酶溶于pH为6-7的缓冲液中,得到溶液Ⅲ;将尿酸酶溶解在pH为8-9的缓冲溶液中,得到溶液Ⅳ;将亲水衬垫依次浸透溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ并分别晾干后,密封存储;
S03,将亲水衬垫固定粘合于疏水衬垫的一端;
S04,制得非侵入性尿酸比色试纸。
9.一种非侵入性尿酸比色试纸制造方法,用于制造权利要求1~7之一所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:包括以下制作步骤:
S01,备料亲水纸张原料和疏水片材原料;
S02,通过冲剪裁切工艺将亲水纸张原料制成若干块边长为4~7mm的矩形亲水衬垫;
S03,通过冲剪裁切工艺将疏水片材原料制成若干条4~7mm×50~100mm的条带形疏水衬垫;
S04,将尿酸酶溶解于缓冲溶液中制备尿酸酶溶液;
S05,将适量辣根过氧化物酶溶解于缓冲液中制备辣根过氧化物酶溶液;
S06,将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶解于甲醇或乙醇的醇溶液中制备显色剂溶液;
S07,将壳聚糖粉末溶于稀释的乙酸中制备壳聚糖溶液;
S08,取尿酸酶溶液、辣根过氧化物酶溶液、显色剂溶液和壳聚糖溶液,混合制成混合溶液;
S09,在每块亲水衬垫上分别沉积6-30ul混合溶液;
S10,将亲水衬垫在25~40℃温度条件下孵育15-90分钟;
S11,干燥,使试剂固定化;
S12,将亲水衬垫固定粘合于疏水衬垫的一端;
S13,制得非侵入性尿酸比色试纸。
10.一种非侵入性尿酸比色试纸的检测方法,使用权利要求1~7之一所述非侵入性尿酸比色试纸,其特征在于:包括以下制作步骤:
P01,根据显色剂从无色变为蓝色过程中的颜色变化情况,预设多个不同蓝色深度级别;
P02,用缓冲液或人工尿液制备尿酸样品;
P03,将尿酸样本滴加至非侵入性尿酸比色试纸的亲水衬垫上,或者将亲水垫浸入尿酸样品中1秒;
P04,尿酸浓度不同,蓝色的强度也不同;通过肉眼与标准色表比较颜色来确定尿酸样品的尿酸浓度,或者通过计算机视觉数字分析来确定尿酸浓度。
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