KR102228072B1 - 생체시료 내 메탄올 검출 방법 - Google Patents

생체시료 내 메탄올 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르는 본 발명에 따르는 생체시료에 포함된 메탄올을 확인하는 메탄올 검출 방법에 있어서,
대상체로부터 생체시료를 채취하는 단계(생체시료 추출단계)와; 생체시료와, 내부표준물질 수용액과, NaCl 포화수용액과, 메탄올 표준용액이 혼합되어 제1 시료혼합물이 형성되는 단계(시료 혼합단계)와; 상기 생체시료 내 메탄올(methanol)과 내부표준물질을 유도체화 시키는 단계(유도체화 단계)와; 상기 유도체화된 메탄올과 유도체화된 내부표준물질을 추출하여 분석하는 단계(추출 분석 단계)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법에 관한 것이다.

Description

생체시료 내 메탄올 검출 방법{A method for detecting methanol in a biospecimen}
본 발명은 생체시료 내 메탄올 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체시료에 포함된 메탄올을 유도체화 시킨 다음 GC/MS(Gas chromatography-Mass Spectrometry)로 분석함으로써 생체시료 내 메탄올의 포함 여부를 보다 빠르게 확인 가능한 생체시료 내 메탄올 검출 방법에 관한 것이다.
일반적으로 메탄올(methanol)은 용제, 의약품, 농약, 연료, 수지, 전자제품 등의 제조에 사용되어 주변에서 쉽게 접할 수 있기 때문에 이로 인한 인명피해가 다수 보고되어 있다. 체내에 흡수된 메탄올은 대사되어 독성이 강한 포름알데히드(formaldehyde) 및 포름산(formic acid)을 생성하여 실명 및 사망에 이르게 되며 간에서 대사과정을 거쳐 알코올 분해효소(ADH)에 의해 포름알데히드(formaldehyde)로 전환되고, 전환된 포름알데히드(formaldehyde)는 알데히드분해효소(ALDH)에 의해 포름산(formic acid)으로 대사된다. 이때 포름산(formic acid)은 망막과 신경에 독성을 야기하며 미토콘드리아의 에너지 대사를 막아 생체를 파괴시키며 중독량 및 치사량은 개인차에 따라 일정치 않으나 치사량은 일반적으로 30∼100 ㎖로 알려져 있고, 혈중 농도가 0.033％가 되면 실명, 0.114％ 이상에서 사망하는 것으로 보고되어 있다.
메탄올 음독에 의한 사망은 밀주나 의약품 오용 또는 자살을 위해 음용한 농약 등에 의해 발생하는 경우가 있으며 메탄올 음독 사고가 발생하였을 경우 응급처치 방법은 위세척 및 에탄올(ethanol) 투여 등이 있다. 체내에 들어온 메탄올은 에탄올과 대사 과정에서 경쟁 반응 관계에 있기 때문에 메탄올 음독 변사자가 발생하였을 경우 빠른 응급처치가 무엇보다 중요하며 그러기 위해서는 무엇보다 신속한 검출이 중요하다.
메탄올 분석은 GC-FID(Gas chromatography-Flame Ionization Detector)로 분석하는 것이 일반적이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 혈액 중 메탄올을 GC-FID로 분석하여 머무름 시간 0.96분(도 1(A))의 메탄올과 2.4분(도 1(B))의 터셔리-부틸 알코올(t-butyl alcohol) 두 개의 피크를 확인할 수 있는데 GC-FID를 이용한 분석 결과만으로는 검출되는 메탄올의 특정화가 곤란하였다. 왜냐하면, 머무름 시간 0.96분의 피크는 메탄올에서 유래한 것일 수도 있으나 에탄올의 대사 물질인 아세트알데히드(acetaldehyde)일 수도 있으며 특히 음주상태에서 메탄올을 음용하였다면 머무름 시간이 오버랩되어 0.96분의 피크가 메탄올에서 유래한 것인지 또는 에탄올 음용 후 그 대사 물질인 아세트알데히드에서 유래한 것인지에 대한 정보를 정확히 제시하지 못하는 문제점이 있었다.
이런 이유로 머무름 시간만으로 분석하는 GC-FID에 의한 메탄올 분석은 정성 및 정량에 어려움이 있다. 이를 극복하기 위해 GC/MS(Gas chromatography-Mass Spectrometry)를 이용한 분석이 가능하지만, 이 또한 도 2에 도시된 바와 같이 메탄올의 분자량이 산소(O2)와 유사하고, 특히 헤드스페이스(headspace)에서 포집하여 주입할 경우 시료 중의 수분에 의한 칼럼 브리딩(column bleeding) 현상이 발생할 수 있는 문제점이 있었다.
대한민국 공개특허공보 제10-2015-0109995호(2015.10.02) 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0131560호(2009.12.29) 대한민국 등록특허공보 제10-2040820호(2019.10.30)
본 발명은 상기와 같은 종래 기술이 가지는 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 생체시료에 포함된 메탄올을 유도체화 시킨 다음 GC/MS로 분석함으로써 생체시료 내 메탄올의 포함 여부를 빠르게 확인 가능하며, 이를 법과학적 사건뿐만 아니라 메탄올 음독 시 응급처치를 위한 메탄올 검출에 적용하여 변사자가 메탄올에 의한 중독임을 보다 빠르고 정확하게 규명할 수 있는 생체시료 내 메탄올 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따르는 생체시료에 포함된 메탄올을 확인하는 메탄올 검출 방법에 있어서,
대상체로부터 생체시료를 채취하는 단계(생체시료 추출단계)와;
생체시료와, 내부표준물질 수용액과, NaCl 포화수용액과, 메탄올 표준용액이 혼합되어 제1 시료혼합물이 형성되는 단계(시료 혼합단계)와;
상기 생체시료 내 메탄올(methanol)과 내부표준물질을 유도체화 시키는 단계(유도체화 단계)와;
상기 유도체화된 메탄올과 유도체화된 내부표준물질을 추출하여 분석하는 단계(추출분석단계)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법을 제공한다.
상기에서, 생체시료는 혈액이고, 내부표준물질 수용액은 0.1％ 중수소로 치환된 에탄올 수용액이며;
상기 시료 혼합단계에서 혈액:내부표준물질 수용액:NaCl수용액:메탄올 표준용액의 혼합 비율은 1:1:2:1인 것을 특징으로 한다.
상기에서, 유도체화 단계에서는 pyran계 화합물과 산 촉매를 첨가하여 메탄올과 내부표준물질을 유도체화 시키는 것을 특징한다.
상기에서, 유도체화 단계에서는 제1 시료혼합물에 화합물 첨가 후 산촉매가 첨가되며;
상기 pyran계 화합물은 생체시료 부피의 0.1v/v％∼100v/v％ 혼합되는 것을 특징으로 한다.
상기에서, pyran계 화합물은 DHP(3,4-Dihydro-2H-pyran)인 것을 특징으로 한다.
상기에서, 산 촉매는 진한 염산, 황산, 질산 중 하나인 것을 특징으로 한다.
상기에서, 산 촉매인 진한 염산은 생체시료 부피의 0.1v/v％∼50v/v％ 혼합되는 것을 특징으로 한다.
상기에서, 추출분석단계에서는 용매 추출법(solvent extraction) 또는 고상 미세 추출법(SPME)으로 추출되는 것을 특징으로 한다.
상기에서, 고상 미세 추출법(SPME)은 Carboxen/PDMS, polyacrylate(PA), PDMS, carbowax/DVB 중 하나로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기에서, 추출분석단계에서는 Carboxen/PDMS 추출법으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기에서, 포르메이트(formate) 분석단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 생체시료 내 메탄올 검출 방법은 생체시료 내 메탄올의 포함 여부를 용이하며 신속하게 확인 가능하고 경제적이다. 이를 법과학적 사건에 적용하여 변사자가 메탄올에 의한 중독임을 보다 빠르고 정확하게 규명할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 GC-FID에 의한 생체시료의 분석 결과를 도시한 그래프이며,
도 2는 GC/MS를 이용한 메탄올의 분석 결과를 도시한 그래프이고,
도 3은 메탄올과 DHP의 반응식(A)과 중수소로 치환된 에탄올(D5-ethanol)과 DHP의 반응식(B)을 도시한 도면이며,
도 4는 유도체화된 메탄올과 유도체화된 중수소로 치환된 에탄올(D5-ethanol)의 GC/MS에 의한 분석 결과를 도시한 그래프이고,
도 5는 유도체화된 메탄올 이온의 질량 스펙트럼 결과를 도시한 그래프이며,
도 6은 유도체화된 중수소로 치환된 에탄올(D5-ethanol) 이온의 질량 스펙트럼 결과를 도시한 그래프이고,
도 7은 베이스 이온(A)과 유도체화된 메탄올 이온(B) 및 유도체화된 중수소로 치환된 에탄올 이온(C)의 분자 구조를 도시한 도면이며,
도 8은 표준 메탄올 용액을 첨가한 변사자의 혈액에 대한 GC/MS 크로마토그램을 도시한 그래프이고,
도 9는 유도체화된 내부표준물질에 대한 유도체화된 메탄올의 면적 비율을 플로팅한 보정 곡선을 도시한 그래프이며,
도 10은 이온크로마토그래피를 이용하여 포르메이트(formate)에 대해 분석한 결과를 도시한 그래프이며,
도 11은 이온크로마토그래피에 의한 포르메이트(formate)의 보정 곡선을 도시한 그래프이며,
도 12는 본 방법의 적용 방법을 설명하기 위한 도면이다.
이하에서 도면을 참조하여 본 발명에 따르는 생체시료 내 메탄올 검출 방법에 대하여 상세하게 설명한다.
도 3은 메탄올과 DHP의 반응식(A)과 중수소로 치환된 에탄올(D5-ethanol)과 DHP의 반응식(B)을 도시한 도면이며, 도 4는 유도체화된 메탄올과 유도체화된 중수소로 치환된 에탄올(D5-ethanol)의 GC-FID에 의한 분석 결과를 도시한 그래프이고, 도 5는 유도체화된 메탄올 이온의 질량 스펙트럼 결과를 도시한 그래프이며, 도 6은 유도체화된 중수소로 치환된 에탄올(D5-ethanol) 이온의 질량 스펙트럼 결과를 도시한 그래프이고, 도 7은 베이스 이온(A)과 유도체화된 메탄올 이온(B) 및 유도체화된 중수소로 치환된 에탄올 이온(C)의 분자 구조를 도시한 도면이며, 도 8은 표준 메탄올 용액을 첨가한 변사자의 혈액에 대한 GC/MS 크로마토그램을 도시한 그래프이고, 도 9는 유도체화된 내부표준물질에 대한 유도체화된 메탄올의 면적 비율을 플로팅한 보정 곡선을 도시한 그래프이며, 도 10은 이온 크로마토그램을 이용하여 포르메이트(formate)에 대해 분석한 결과를 도시한 그래프이며, 도 11은 이온크로마토그래피에 의한 포르메이트(formate)의 보정 곡선을 도시한 그래프이며, 도 12는 본 방법의 적용 방법을 설명하기 위한 도면이다.
본 발명에 따르는 생체시료 내 메탄올 검출 방법은 메탄올(methanol)을 유도체화 시킨 다음 GC/MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometry)를 이용하여 분석하는 방법이다. 생체시료 내 메탄올에 대한 GC/MS 분석은 표준첨가법(standard addition method)으로 이루어진다.
상기 생체시료 내 메탄올 검출 방법은 생체시료 추출단계(ST-100)와, 시료 혼합단계(ST-200)와, 유도체화단계(ST-300)와, 추출분석단계(ST-400)로 이루어진다(도 12 참조).
생체시료 추출단계(ST-100)에서는 대상체로부터 생체시료를 추출한다. 이하에서 생체시료는 혈액을 예로 설명한다.
시료 혼합단계(ST-200)에서는 대상체로부터 추출된 혈액과, 내부표준물질 수용액과, NaCl포화수용액과, 메탄올 표준용액이 혼합되어 제1 시료혼합물이 형성된다.
상기 내부표준물질은 혈액 내 포함된 메탄올의 정량을 위한 것으로써 도 3의 (B)에 도시된 바와 같은 5개의 중수소로 치환된 에탄올(D5-EtOH)이 사용된다. 상기 내부표준물질로는 Sigma-Aldrich(Darmstadt, Hessen, GER)가 사용되었다.
상기 내부표준물질은 일반 자연환경에 존재할 가능성이 극히 희박할 뿐만 아니라 메탄올의 거동과 유사하고, 특히 에탄올이 함유된 음주자 혈액에서 에탄올의 정량분석에도 적용할 수 있는 장점이 있다.
상기 NaCl수용액은 시료 용액의 이온세기(ionic strength)를 증가시켜 기체상으로 분석대상물질의 휘발성을 증가시키기 위한 것이다.
상기 제1 시료혼합물에서 혈액:내부표준물질 수용액:NaCl포화수용액:메탄올 표준용액의 혼합 비율은 1:1:2:1로 이루어진다. 이때, 상기 내부표준물질 수용액은 0.1％인 중수소로 치환된 에탄올(D5-EtOH) 수용액이고, NaCl수용액의 농도는 그 온도에서의 NaCl 포화수용액이다.
상기 제1 시료혼합물은 10 ㎖ 바이알(vial)에 혈액 100 ㎕와, 내부표준물질 수용액 100 ㎕와, NaCl수용액 200 ㎕와, 메탄올 표준용액 100 ㎕가 혼합되어 이루어진다. 메탄올 표준용액으로는 Supelco(Bellefonte, PA, USA)사의 analytical standard grade가 사용 되었다.
상기 제1 시료혼합물에서 메탄올 표준용액의 농도는 0.025％, 0.05％, 0.10％, 0.15％ 및 0.20％의 농도로 이루어지며, 메탄올 표준용액의 각 농도에 대해 혈액과, 내부표준물질 수용액과, NaCl수용액이 5개의 바이알에서 각각 혼합된다.
상기 유도체화 단계(ST-300)에서는 메탄올을 유도체 하기 위해 각각의 바이알에 DHP(3,4-Dihydro-2H-pyran)를 첨가하여 균질화 시킨 후 산 촉매를 첨가하여 유도체화 시킨다. 상기 DHP는 유기합성에서 알코올(alcohol)에 대한 보호기로서 적용되기도 하는 화합물이다.
상기 DHP는 생체시료 부피의 0.1v/v％∼100v/v％ 범위로 첨가된다. DHP는 바람직하게는 25v/v％∼50v/v％ 범위로 첨가되며, 더 바람직하게는 생체시료의 35v/v％ 첨가된다. 이하에서 DHP는 생체시료 100 ㎕당 35 ㎕ 첨가된다. 상기 DHP로는 TCI(Kita-ku, Tokyo, JPN)가 사용되었다.
상기 산 촉매는 진한 염산, 황산, 질산 중의 하나로 이루어진다. 상기 산 촉매로는 진한 염산이 가장 바람직하다. 상기 산 촉매로 진한 염산이 선택될 경우, 진한 염산은 생체시료 부피의 0.1v/v％∼50v/v％ 범위로 첨가된다. 진한 염산은 바람직하게는 생체시료의 15v/v％∼35v/v％ 범위로 첨가되며, 더 바람직하게는 생체시료의 25v/v％ 첨가된다. 이하에서 진한 염산은 생체시료 100 ㎕당 25 ㎕ 첨가된다.
유도체화를 위한 이 반응은 친핵성 첨가반응(nucleophilic addition reaction)을 통해 진행되었으며, 반응 결과 메탄올은 2-메톡시테트라하이드로피란(2-methoxytetrahydropyran)을 형성하였고(도 3(A)), 내부표준물질은 2-D5-에톡시테트라하이드로피란(2-D5-ethoxytetrahydropyran)을 형성하였다(도 3(B)).
상기 추출분석단계(ST-400)에서는 반응 결과 생성된 2-메톡시테트라하이드로피란의 GC/MS 분석을 위하여 여러가지 전처리 기법이 사용된다. 전처리 기법으로는 액체-액체 추출법(liquid-liquid extraction), 고체상 추출법(solid phase extraction), 고상 미세 추출법(SPME;solidphase Micro Extraction) 등이 있다. 본 발명에서는 바이알의 해드스페이스(heaspace)에서 고상 미세 추출법(SPME)을 이용하여 추출을 시행하였다.
전처리 시료 추출을 위한 SPME fiber로는 Carboxen-polydimethylsiloxane(CAR/PDMS), polyacrylate(PA), polydimethylsiloxane(PDMS), Carbowax/divinylbenzene(Carbowax/DVB) 등이 있으며, 이 중 CAR/PDMS로 구성된 SPME fiber를 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 SPME fiber는 Supelco(Bellefonte, PA, USA)사의 CAR/PDMS, PDMS, PA 및 carbowax/DVB가 있으며, 본 발명에서는 CAR/PDMS로 구성된 75 ㎛ SPME fiber를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 추출분석단계(ST-400)에서는 유도체화 단계(ST-300)에서 생성된 2-메톡시테트라하이드로피란을 SPME를 이용하여 추출한 후 이를 바로 GC/MS로 분석한다.
GC/MS에 의한 분석은 Agilent Technologies(Foster City, CA, USA)사의 7890B GC 및 5977B MSD 시스템을 이용하였으며, DB-5MS UI capillary column(30m length×0.23㎜ i.d., 0.25 ㎛ film thickness, J&W Scientific, Folsom, CA, USA)을 이용하여 99.999％ He 캐리어 가스(carrier gas)로 1.0 ㎖/min로 일정한 흐름으로 이루어졌다.
인젝터(injector) 온도는 260℃, 인터페이스(interface) 온도는 280℃, 오븐(oven) 온도는 40℃에서 3분 유지 후에 250℃까지 10℃/min으로 승온하여 3분 유지하였다. 용매 지연 시간은 유도체화 시약인 DHP의 영향을 배제하기 위해 4.2분을 설정하였고, 스플릿(split)비율 10:1에서 질량 스펙트럼은 70 eV의 EI 모드로 분석하였다.
상기 분석을 통해 도 4에 도시된 분석 결과와 같이 머무름 시간 5.9분에서 유도체화된 메탄올인 2-메톡시테트라하이드로피란을 확인할 수 있었고, 7.3분에서 유도체화된 내부표준물질인 2-D5-에톡시테트라하이드로피란을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5와 도 6을 통하여 각 성분에 대한 질량스펙트럼을 확인할 수 있다. 도 5와 도 6에서 베이스 이온(base ion)의 분자량은 m/z 85로 도 7(A)의 분자구조와 같고, 메탄올에 의한 2-메톡시테트라하이드로피란 이온의 분자량은 m/z 115로 도 7(B)의 분자구조와 같으며, 내부표준물질에 의한 2-D5-에톡시테트라하이드로피란 이온의 분자량은 m/z 134로 도 7(C)의 분자구조와 같다.
상기 생체시료인 혈액에 대해 시료 혼합단계(ST-200)에서 메탄올(methanol)을 0∼0.20％ 농도 범위에서 표준 첨가하여 유도체화 시킨 GC/MS 분석 결과는 도 8과 같았으며, 메탄올의 m/z 115인 이온 면적에 대하여 내부표준물질의 m/z 134인 이온의 면적 비를 적용하여 도 9와 같은 검정 곡선을 도출하였다. 상기 검정 곡선의 직선성에 대해서는 r2 값이 0.9999로 매우 우수하였으며, 검출 한계(detection limit)는 0.56 ㎍/㎖이었고, 정량 한계(quantification limit)는 1.7 ㎍/㎖이었다. 검출 한계 및 정량 한계에 대해서는 10개의 블랭크(blank) 시료의 S/N 비가 3 및 10을 초과하는 농도로 계산하였다.
본 발명에 따르는 생체시료 내 메탄올 검출 방법에서는 포르메이트(formate) 분석 단계(ST-500)가 더 포함될 수 있다.
상기 포르메이트(formate)는 메탄올 음독 시 발생하는 대사체이다. 상기 포르메이트는 IC(Ion Chromatography)를 이용하여 분석한다.
도 10(A)에 도시된 바와 같이, 생체시료인 혈액을 탈염수로 50배 희석하여 분석하였으며, 그 결과 머무름 시간 3.7분에서 포르메이트가 검출되었고, 이를 확인하기 위하여 25 ㎍/㎖의 포르메이트를 탈염수로 희석된 시료에 1:1로 첨가함으로써 도 10(B)와 같이 도 10(A)에서 머무름 시간 3.7분에 확인된 피크가 포르메이트 임을 확인할 수 있었다.
포르메이트 정량을 위하여 포르메이트를 탈염수에 희석하여 포르메이트 농도가 5∼50 ㎍/㎖가 되도록 한 다음 분석하여(도10(C)참조) 면적으로 도 11과 같은 검정 곡선을 도출하였으며, r2=0.9997의 우수한 직선성을 나타내었다.
상기 포르메이트 분석 단계(ST-500)에서 IC 분석을 위한 음이온 용리제(anion eluent)는 Thermo Fisher Scientific(Sunnyvale, CA, USA)가 사용되었으며, 혈액에 포함된 포르메이트 정량을 위해 사용된 표준 포르메이트는 AccuStandard(New Haven, CT, USA)사의 100 ppm standard stock solution을 탈염수로 희석하여 사용하였다.
포르메이트의 IC 분석은 Dionex((part of Thermo Scientific) Sunnyvale, CA, USA)의 ICS 5000시스템을 사용하여 5 ㎕ 주입하여 분석하였다. 칼럼 오염방지를 위해 Thermo Scientific(Sunnyvale, CA, USA)의 IonPac AG-11 4 ㎜ guard 칼럼을 이용하였으며, IonPac AS-11 4 ㎜ 칼럼으로 분리하였다. 용리제(Eluent)는 Thermo Scientific의 4.5 mM/1.5 mM 농도의 carbonate/bicarbonate 용리제를 1 ㎖/min isocratic flow rate로 Thermo Scientific의 ASRS 4 ㎜ 서프레서(suppressor)에 전류 26 ㎃를 인가하여 전기전도도 검출기(conductivity detector)로 분석하였다.
본 발명에 따르는 생체시료 내 메탄올 검출 방법은 생체시료에 포함된 메탄올을 유도체화 시킨 다음 GC/MS로 분석함으로써 혈액 내 메탄올의 포함 여부를 빠르고 간편하게 확인 가능하며, 메탄올 음용자가 나타날 경우 이를 통해 신속하게 메탄올 음용 여부를 확인하여 메탄올에 의한 사망원인을 규명할 수 있을 뿐만 아니라 메탄올 음용자의 빠른 응급 처치가 가능하게 된다.

Claims (11)

  1. 생체시료에 포함된 메탄올을 확인하는 메탄올 검출 방법에 있어서,
    대상체로부터 생체시료를 채취하는 단계(ST-100;생체시료 추출단계)와;
    생체시료와, 내부표준물질 수용액과, NaCl 포화수용액과, 메탄올 표준용액이 혼합되어 제1 시료혼합물이 형성되는 단계(ST-200;시료 혼합단계)와;
    상기 생체시료 내 메탄올(methanol)과 내부표준물질을 유도체화 시키는 단계(ST-300;유도체화 단계)와;
    상기 유도체화된 메탄올과 유도체화된 내부표준물질을 추출하여 분석하는 단계(ST-400;추출분석단계)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 생체시료는 혈액이고, 내부표준물질 수용액은 0.1％ 중수소로 치환된 에탄올 수용액이며;
    상기 시료 혼합단계(ST-200)에서 혈액:내부표준물질 수용액:NaCl수용액:메탄올 표준용액의 혼합 비율은 1:1:2:1인 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 유도체화 단계(ST-300)에서는 pyran계 화합물과 산 촉매를 첨가하여 메탄올과 내부표준물질을 유도체화 시키는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 유도체화 단계(ST-300)에서는 제1 시료혼합물에 pyran계 화합물 첨가 후 산촉매가 첨가되며;
    상기 pyran계 화합물은 생체시료 부피의 0.1v/v％∼100v/v％ 혼합되는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 pyran계 화합물은 DHP(3,4-Dihydro-2H-pyran)인 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 산 촉매는 진한 염산, 황산, 질산 중 하나인 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 산 촉매인 진한 염산은 생체시료 부피의 0.1v/v％∼50v/v％ 혼합되는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 추출분석단계(ST-400)에서는 용매 추출법(solvent extraction) 또는 고상 미세 추출법(SPME)으로 추출되는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 고상 미세 추출법(SPME)은 Carboxen/PDMS, polyacrylate(PA), PDMS, carbowax/DVB 중 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 추출분석단계(ST-400)에서는 Carboxen/PDMS 추출법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 포르메이트(formate) 분석단계(ST-500)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 메탄올 검출 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102647396B1 (ko) * 2023-05-03 2024-03-13 경찰대학 산학협력단 문서 작성 시기 판별 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090131560A (ko) 2008-06-18 2009-12-29 아주대학교산학협력단 메탄올로부터 디메틸에테르를 제조하는 방법
KR20150109995A (ko) 2014-03-21 2015-10-02 주식회사 인터내셔널 사이언티픽 스탠다드 Ｌｃ-ｍｓ／ｍｓ를 이용한 생체시료 내 포르피린 검출 방법
US20150299760A1 (en) * 2012-11-21 2015-10-22 Oslo Universitetssykehus Hf Systems and methods for monitoring biological fluids
WO2017077392A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and devices for detecting methanol poisoning using formate oxidase
KR20180047229A (ko) * 2016-10-31 2018-05-10 한국과학기술연구원 유도체를 이용한 식품 중 에틸렌 옥사이드 분석방법
KR102040820B1 (ko) 2016-11-28 2019-11-06 주식회사 엘지화학 메탄올 및 아세톤의 제거 유닛 및 이를 포함하는 페놀 및 비스페놀 a의 제조 시스템

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090131560A (ko) 2008-06-18 2009-12-29 아주대학교산학협력단 메탄올로부터 디메틸에테르를 제조하는 방법
US20150299760A1 (en) * 2012-11-21 2015-10-22 Oslo Universitetssykehus Hf Systems and methods for monitoring biological fluids
KR20150109995A (ko) 2014-03-21 2015-10-02 주식회사 인터내셔널 사이언티픽 스탠다드 Ｌｃ-ｍｓ／ｍｓ를 이용한 생체시료 내 포르피린 검출 방법
WO2017077392A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and devices for detecting methanol poisoning using formate oxidase
KR20180047229A (ko) * 2016-10-31 2018-05-10 한국과학기술연구원 유도체를 이용한 식품 중 에틸렌 옥사이드 분석방법
KR102040820B1 (ko) 2016-11-28 2019-11-06 주식회사 엘지화학 메탄올 및 아세톤의 제거 유닛 및 이를 포함하는 페놀 및 비스페놀 a의 제조 시스템

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
제34회 한국법과학회, 'ICT 융합환경에서 법과학 증거의 연계성(CDC)과 인증', 2018. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102647396B1 (ko) * 2023-05-03 2024-03-13 경찰대학 산학협력단 문서 작성 시기 판별 방법

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