CN104936594A - 治疗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于治疗氧化应激相关疾病的组合物和治疗氧化应激相关疾病的方法。

Description

治疗组合物

相关申请的交叉引用

该申请要求2012年9月21日提交的美国临时申请号61/704,401、2012年9月27日提交的美国临时申请号61/706,670、2012年9月28日提交的美国临时申请号61/707,141的权益。将这些临时申请中的每一个以其完整形式作为参考并入。

技术领域

本发明公开了用于治疗与氧化应激和减少的线粒体DNA有关的疾病的组合物。

背景技术

实际上所有的生物化学，从基因转录到结构、蛋白和酶的制造，都是在盐水中发生。鉴于此，不奇怪所有的生命，从最原始的原核细菌到最高级的真核哺乳动物细胞(甚至植物)，都已经进化了氧化和还原盐水的能力，从而制造出两类活性分子，即“还原态物质”(RS)和“活性氧物质”(ROS)。这些化学物质两者是从盐水中制造的且在哺乳动物细胞中是普遍的。

哺乳动物细胞在多种生物过程中利用RS/ROS。在糖的代谢过程中，RS/ROS特别地通过在线粒体中的氧化磷酸化过程在细胞中大量制造。

发明内容

实施方式包括一种组合物，所述组合物包含氧化还原信号剂(RXN)和过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)激动剂。在一个实施方式中，PPAR激动剂包括游离脂肪酸(FFA)。在一个实施方式中，PPAR激动剂包括类二十烷酸、或噻唑烷二酮、或纤维酸类药物(fibrate)。在一个实施方式中，PPAR激动剂包括双重激动剂如阿格列扎(aleglitazar)、莫格他唑(mruaglitazar)或替格列扎(tesaglitazar)。实施方式包括将包含RXN和PPAR激动剂的组合物用于治疗PPAR介导的疾病，例如包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病的糖尿病，肥胖症或癌症。用于治疗癌症的实施方式可包括激活PPAR通路的第一疗法和至少一种其他药剂，其中所述至少一种其他药剂不激活PPAR通路，例如是放射物或化学治疗剂。用于治疗癌症的实施方式可包括动员游离脂肪酸(FFA)的第一疗法和至少一种其他药剂，其中所述至少一种其他药剂不动员FFA，例如是放射物。

实施方式包括治疗氧化应激相关病症的方法，这种方法包括：向经历氧化应激的患者施用组合物，所述组合物包含选自如下的至少一种物质：O₂，H₂，Cl₂，OCl^-，HOCl，NaOCl，HClO₂，ClO₂，HClO₃，HClO₄，H₂O₂，Na⁺，Cl^-，H⁺，H^-，OH^-，O₃，O₄ ^*-，¹O，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O₃，O₂ ^*-，HO₂ ^*，NaCl，HCl，NaOH，水分子簇或其组合；和治疗氧化应激相关病症。

实施方式包括治疗线粒体DNA减少症的方法，所述方法包括：向经历线粒体DNA减少症的患者施用组合物，所述组合物包含选自如下的至少一种物种：O₂，H₂，Cl₂，OCl^-，HOCl，NaOCl，HClO₂，ClO₂，HClO₃，HClO₄，H₂O₂，Na⁺，Cl^-，H⁺，H^-，OH^-，O₃，O₄ ^*-，¹O，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O₃，O₂ ^*-，HO₂ ^*，NaCl，HCl，NaOH，水分子簇或其组合；增加线粒体DNA密度；和治疗线粒体DNA减少症。这种病症包括肌肉减少症、糖尿病、阿尔兹海默症、帕金森病、神经***疾病、老化引起的肌肉损失、肥胖症或心血管障碍。

附图说明

图1是在本文中描述的方法的流程图。

图2示出了在电极处生成各种分子的示例性图。写在电极之间的分子描述起始反应物，在电极外部的分子描述在电极处产生的分子/离子和它们的电极电位。

图3示出了用于制造根据本发明的组合物的方法和***的平面图。

图4示出了用于准备水以进一步加工成本文中描述的组合物的示例性***。

图5示出了pH为12.48的NaClO、NaCl溶液，和在本文中描述的组合物(所述组合物标记为“ASEA”)的Cl35谱图。

图6示出了本公开的组合物的¹H NMR谱图。

图7示出了DIPPMPO与本文中描述的组合物组合的31P NMR谱图。

图8示出了显示DIPPMPO的母峰和碎片分布的质谱，具有在264、222和180处的m/z峰。

图9示出了与水和NaClO相比，本文中描述的组合物的氧气/氮气比率(所述组合物标记为“ASEA”)。

图10示出了与水和NaClO相比，本文中描述的组合物的氯气/氮气比率(所述组合物标记为“ASEA”)。

图11示出了与水和NaClO相比，本文中描述的组合物的臭氧/氮气比率(所述组合物标记为“ASEA”)。

图12示出了与水和NaClO相比，本文中描述的组合物的二氧化碳对氮气的比率(所述组合物标记为“ASEA”)。

图13示出了自由电子的EPR裂分模式。

图14示出了在实施例3中描述的小鼠研究的流程图(组合物治疗组标记为“ASEA”)。

图15是显示小鼠准备和研究的总概述的流程图(使用的组合物被称作“ASEA”)。

图16示出了分组为安慰剂治疗和ASEA(本文中描述的组合物)治疗的小鼠的奔跑时间和糖原耗竭。

图17A示出了不同小鼠组相对于ASEA(本文中描述的组合物)治疗组的倍数变化。图17B示出了ASEA定栖(不奔跑)组和ASEA奔跑组之间的倍数变化差值。

图18示出了不同小鼠组的、产生的肝超氧化物歧化酶(SOD)的量(使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图19A和19B示出了不同小鼠组(定栖的/奔跑的；治疗/安慰剂)的氧化型谷胱甘肽(使用的组合物实施方式称作“ASEA”)。

图20示出了不同小鼠组的IL-6和TNF-α的倍数变化(使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图21示出了摄取后24小时，各条件之间的A-B比率的比较(使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图22示出了人类奔跑表现研究实验方案的流程图(在所述实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图23示出了根据实施例7的实验方案进行的12周随机试验的流程图(在所述实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图24示出了从实施例8中的研究得到的VCO₂对VO₂的图(在实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图25示出了HMVEC-L细胞p65亚单位NF-kB毒性筛选的每种培养物结果的细胞图像(实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图26示出了P-Jun毒性筛选的结果(实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图27示出的图显示了氧化剂在11分钟间隔期间的还原(垂直刻度以RFU为单位)。

图28示出的图显示了11分钟间隔期间的抗氧化活性(实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图29示出了NRF2的HMVEC-L核积聚结果的核染色分布情况(实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图30示出了暴露于低浓度ASEA(本文中公开的组合物)的血清饥饿型细胞培养物。

图31示出了在ASEA治疗后NRF2核积聚的蛋白质印迹确认。

图32示出了在ASEA治疗后小鼠细胞和HMVEC-L细胞增殖和LDH活性的结果。

图33示出了在ASEA治疗后小鼠细胞和HMVEC-L细胞增殖和LDH活性的其他结果。

图34示出了暴露于高浓度的ASEA和逐渐增加量的恶质素(Cachexin)应激源的HMVEC-L活力结果(实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

图35示出了HMVEC-L细胞对恶质素损伤的浓度依赖性反应的结果(实验方案中使用的组合物实施方式称为“ASEA”)。

具体实施方式

在本文中描述的是通常包含至少一种氧化还原信号剂(RXN)的治疗组合物。RXN可包括但不限于超氧化物：O₂ ^*-、HO₂ ^*；次氯酸类：OCl^-、HOCl、NaOCl；次级氯酸类(hypochlorate)：HClO₂、ClO₂、HClO₃、HClO₄；氧衍生物：O₂、O₃、O₄ ^*-、¹O；氢衍生：H₂、H^-；过氧化氢：H₂O₂；羟基自由基：OH^*-；离子化合物：Na⁺、Cl^-、H⁺、OH^-、NaCl、HCl、NaOH；氯气：Cl₂；和水分子簇：n^*H₂O—诱导的围绕离子的偶极层。如在本文中描述的包含RXN的组合物可以动员游离脂肪酸(FFA)和增加线粒体密度。FFA可激活过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)。

实施方式可还包括PPAR激动剂。PPAR可以是核受体。PPAR家族包括三种同种型，指定为α、γ和δ(也称作β)，各自由不同的基因编码。这些受体形成了转录因子和核受体的超家族的部分，可能在调节脂质和糖代谢中起主要作用。PPAR可能在调节高级生物体的细胞分化、发育和代谢(糖、脂质、蛋白)和肿瘤发生中起重要作用。

PPAR-α可能控制脂质代谢(肝的和肌肉的)和葡萄糖稳态(homeostasis)，和可能通过直接控制基因的转录而影响脂质和糖的细胞内代谢，所述基因编码在脂质稳态中涉及的蛋白。PPAR-α可能还发挥抗炎症和抗增殖效果和可能通过刺激胆固醇外流来防止巨噬细胞中胆固醇积聚的致动脉粥样硬化(proatherogenic)效果。PPAR-γ是脂肪生成的主要调节剂。其可能也在成熟脂肪细胞的脂质代谢中、在葡萄糖稳态中、在胰岛素耐受性中、在炎症中、在巨噬细胞水平的胆固醇积聚中和在细胞增殖中涉及。结果PPAR-γ可能在肥胖症、胰岛素耐受性和糖尿病的发病机制中起作用。PPAR-δ可能在控制脂质和糖代谢中、在能量平衡中、在神经退行性变中、在肥胖症中、在泡沫细胞的形成中和在炎症中涉及。

制备治疗组合物的方法被描述为包括使用一组电极以约50-60安培如56安培的电流强度电解盐化了的水以形成生命增强组合物，所述盐化了的水具有约10g NaCl/加仑如10.75g NaCl/加仑的盐浓度，其中将水激冷至室温以下且在电解期间循环水。

制造公开的组合物的方法可包括如下步骤的一个或多个：(1)制备氯化钠在水中的超纯均匀溶液，(2)通过一组惰性催化电极控制温度和调节流动，(3)调整的电解过程，其导致形成这样的稳定的分子部分和复合物。在一种实施方式中，所述方法包含所有这些步骤。

盐水通常应该没有有机和无机两者的污染物，且在低至分子的水平上是均匀的。特别地，金属离子干扰电催化表面反应，因此避免金属是有益的。在一个实施方式中，使用浓盐水溶液使水盐化。浓盐水溶液可具有约540g NaCl/加仑如537.5g NaCl/加仑的NaCl浓度。在一个实施方式中，组合物可包含例如如下的至少一种物质：O₂，H₂，Cl₂，OCl^-，HOCl，NaOCl，HClO₂，ClO₂，HClO₃，HClO₄，H₂O₂，Na⁺，Cl^-，H⁺，H^-，OH^-，O₃，O₄ ^*-，¹O，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O₃，O₂ ^*-，HO₂ ^*，NaCl，HCl，NaOH，水分子簇或其组合。

在一个实施方式中，组合物可包含例如如下的至少一种物质：H₂，Cl₂，OCl^-，HOCl，NaOCl，HClO₂，ClO₂，HClO₃，HClO₄，H₂O₂，O₃，O₄ ^*-，¹O₂，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O₃，O₂ ^*-，HO₂ ^*，水分子簇或其组合。

在一个实施方式中，组合物可包含例如如下的至少一种物质：HClO₃，HClO₄，H₂O₂，O₃，O₄ ^*-，¹O₂，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O₃，O₂ ^*-，HO₂ ^*，水分子簇或其组合。

在一个实施方式中，组合物可包含O₂。在一个实施方式中，组合物可包含H₂。在一个实施方式中，组合物可包含Cl₂。在一个实施方式中，组合物可包含OCl^-。在一个实施方式中，组合物可包含HOCl。在一个实施方式中，组合物可包含NaOCl。在一个实施方式中，组合物可包含HClO₂。在一个实施方式中，组合物可包含ClO₂。在一个实施方式中，组合物可包含HClO₃。在一个实施方式中，组合物可包含HClO₄。在一个实施方式中，组合物可包含H₂O₂。在一个实施方式中，组合物可包含Na⁺。在一个实施方式中，组合物可包含Cl^-。在一个实施方式中，组合物可包含H⁺。在一个实施方式中，组合物可包含H^-。在一个实施方式中，组合物可包含OH^-。在一个实施方式中，组合物可包含O₃。在一个实施方式中，组合物可包含O₄ ^*-。在一个实施方式中，组合物可包含¹O₂。在一个实施方式中，组合物可包含OH^*-。在一个实施方式中，组合物可包含HOCl-O₂ ^*-。在一个实施方式中，组合物可包含HOCl-O₃，O₂ ^*-。在一个实施方式中，组合物可包含HO₂ ^*。在一个实施方式中，组合物可包含NaCl。在一个实施方式中，组合物可包含HCl。在一个实施方式中，组合物可包含NaOH。在一个实施方式中，组合物可包含水分子簇。实施方式可包含其组合。

基于这一点，在这种过程中的步骤示于图1中。100是任选的逆渗透步骤102。可从各种源供给水，所述源包括但不限于生活用水、过滤水、超纯(nanopure)水等。

逆渗透过程可以变化，但是能够提供的水具有的总溶解固体含量为小于约10ppm、约9ppm、约8ppm、约7ppm、约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm等。

逆渗透过程可以在约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃等的温度下进行。可根据需要重复逆渗透步骤以实现特定的总溶解固体水平。不管是否利用任选的逆渗透步骤，都可以进行任选的蒸馏步骤104。

蒸馏过程可以变化，但是能够提供的水具有的总溶解固体含量为小于约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm、约0.1ppm等。可在约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃等的温度下进行蒸馏步骤。

可根据需要重复蒸馏步骤以实现特定的总溶解固体水平。在已对水进行逆渗透、蒸馏、或其两者、或无其任一者处理后，在水中的总溶解固体水平可以为小于约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm、约0.1ppm等。

在逆渗透、蒸馏、或其两者、或无其任一者之前可有碳过滤步骤。

纯化的水可以直接与本文中描述的***和方法一起使用。

在一个实施方式中，可通过以下步骤从商购水源中去除污染物：水流动通过活性碳过滤器以去除芳族和挥发性污染物，然后经受逆渗透(RO)过滤以去除溶解的固体和多数有机和无机污染物。所得过滤的RO水可含有小于约8ppm的溶解固体。多数剩余的污染物可通过蒸馏步骤去除，导致溶解的固体测量值小于1ppm。除了去除污染物，蒸馏还可用于将水调整至正确的结构和氧化还原电位(ORP)，以在随后的电催化过程中促进铂电极上的氧化性和还原性反应电位。

在已对水进行逆渗透、蒸馏、或其两者、或无其任一者处理后，在盐化步骤106中将盐加至水中。盐可以是未精炼的、精炼的、结块的、解结块的等。在一个实施方式中，盐是氯化钠(NaCl)。在一些实施方式中，盐可包含添加剂。盐添加剂包括但不限于碘化钾、碘化钠、碘酸钠、右旋糖、氟化钠、亚铁***、磷酸三钙、碳酸钙、碳酸镁、脂肪酸、氧化镁、二氧化硅、硅酸钙、铝硅酸钠、铝硅酸钙、富马酸亚铁、铁、或叶酸。例如，上面的添加剂可以在快装瓶之前添加。

盐可以以浓盐水溶液的形式添加至水中。为了混合浓盐水溶液，可以使用物理混合装置或可以使用循环或再循环。在一个实施方式中，将纯的医药级氯化钠溶于制备好的蒸馏水中以形成15重量％的亚饱和浓盐水溶液，且不断再循环和过滤直到盐完全溶解并且所有大于0.1微米的颗粒被去除。这一步骤可占用数天。然后将过滤的、溶解的浓盐水溶液以约1:325的比率(盐:水)注入蒸馏水罐中以形成0.3％的盐溶液。在一个实施方式中，可使用10.75g的盐/1加仑水的比率形成所述组合物。在另一个实施方式中，可以使用在约3-4g的水如3.7875g的水中10.75g的盐来形成所述组合物。然后允许这一溶液再循环和扩散直到实现在分子尺度上的均一性。

在一个实施方式中，将均匀的盐溶液激冷至约4.8±0.5℃。在整个电催化过程期间可以使用温度调节，因为从电解过程本身生成的热能可以造成加热。在一个实施方式中，电极处的过程温度在电解期间可以被不断地冷却和维持在约4.8℃。

然后将浓盐水加至事先处理过的水或加至新的未处理过的水中以实现如下的NaCl浓度：约1g NaCl/加仑水至约25g NaCl/加仑水，约8g NaCl/加仑水至约12g NaCl/加仑水，或约4g NaCl/加仑水至约16gNaCl/加仑水。一旦将浓盐水以合适的量加至水，则可以将溶液彻底地混合。在混合期间液体的温度可以是室温或被控制到期望的温度或温度范围。

为了混合溶液，可以使用物理混合装置或可以使用循环或再循环。然后可以在激冷步骤108中激冷盐溶液。

对于大量的组合物，可以使用各种激冷(chilling)和冷却(cooling)方法。例如可以使用通过液氮冷却线的低温冷却。同样地，可以将溶液流经丙二醇热交换器以实现期望的温度。激冷时间可以根据液体的量、起始温度和期望的激冷温度变化。

来自阳极反应的产物可以被有效地输送至阴极，以提供在阴极表面形成稳定复合物的必要反应物。在催化表面之间循环的流体中维持高度的均一性也可以是有益的。可以使用约2-8ml/cm^2*s的恒定流动，在大罐中典型网状电极的距离相隔2cm。通过在电解期间从电极释放的气体的对流，可部分维持这一流动。

然后通过在电解步骤110中使用至少一个电极，可以对激冷的或未激冷的混合溶液进行电化学处理。每个电极可以是导电金属或包含导电金属。金属可包括但不限于铜、铝、钛、铑、铂、银、金、铁、其组合或合金如钢或黄铜。电极可以涂布或镀覆有不同的金属，例如但不限于铝、金、铂或银。在一个实施方式中，每个电极是由钛形成并用铂镀覆。电极上的铂表面本身可以最佳地催化需要的反应。粗糙的双层铂镀层可以保证局部的“反应中心”(尖锐突起)是有活性的并且反应物与下面的电极钛基底不接触。

在一个实施方式中，垂直的、共轴的、圆柱几何形式的粗糙镀铂网状电极在阳极和阴极之间具有如下间隔可以是最佳的：不大于2.5cm，不大于5cm，不大于10cm，不大于20cm，或不大于50cm。流经每个电极的电流强度可以是约2安培至约15安培，约4安培至约14安培，至少约2安培，至少约4安培，至少约6安培，或使用这些值中的任何值产生的任何范围。在一个实施方式中，每个电极使用7安培。

可以使电流量通过电极足够的时间以电解盐溶液。在电化学过程期间可以激***液。在电化学过程期间还可以混合溶液。可以进行这一混合以保证基本上完全的电解。

电极之间的电场可以造成离子的移动。阴离子可以向阳极移动和阳离子向阴极移动。这使得能够在电极之间交换反应物和产物。在一些实施方式中，在电极之间不需要屏障。

在线粒体中，已看到发生线粒体电位的波动，特别是电位的脉冲。相似地，也可以利用本文中公开的组合物生产单元的电源中的脉冲电位。当生活电力线中的交流电改变极性时，在整流电源中缺乏滤波电容器可造成电压每秒120次降至零，产生强尖峰(spike)。这一强尖峰在傅里叶转换下可发射大带宽的频率。实质上，电压从高电位至零每秒120次地变化。

在电流量已经流经溶液足够的时间后，产生了电解溶液。可以在储存/试验步骤112中储存溶液和/或试验特定的性质。

这一电解过程的终产物可以在盐溶液内反应以制造许多不同的化学实体。本文中描述的组合物可以包括一种或多种这些化学实体，其被称为氧化还原信号剂或RXN。

电解溶液的氯气浓度可以为约5ppm至约34ppm，约10ppm至约34ppm，或约15ppm至约34ppm。在一个实施方式中，氯气浓度为约32ppm。

电解溶液中的盐浓度可以为例如约0.10％w/v至约0.20％w/v，约0.11％w/v至约0.19％w/v，约0.12％w/v至约0.18％w/v，约0.13％w/v至约0.17％w/v，或约0.14％w/v至约0.16％w/v。

组合物通常可包括纯盐水的电解和/或催化产物，其模拟在人类细胞中和人类细胞周围发现的天生盐水化合物的氧化还原信号分子组成。可以对所述组合物进行微调以模拟或反映不同生物介质的分子组成。除存在的氯气外，组合物可具有活性物种。如描述的，本文中描述的组合物中存在的物种可包括但不限于O₂，H₂，Cl₂，OCl^-，HOCl，NaOCl，HClO₂，ClO₂，HClO₃，HClO4，H₂O₂，Na⁺，Cl^-，H⁺，H^-，OH^-，O₃，O₄ ^*-，¹O₂，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O3，O₂ ^*-，HO₂ ^*，NaCl，HCl，NaOH，和水分子簇：n^*H₂O-诱导的围绕离子的偶极层等。

本文中公开的组合物还可包括PPAR激动剂，例如FFA，纤维酸类药物(非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特、吉非贝齐)，噻唑烷二酮类(罗格列酮和匹格列酮)，L-165041，GW501516，KD3010，类二十烷酸类，***素类(E1-前列地尔、I2-环***素、PGJ2)，环***素类(依前列醇、曲前列环素、维利萃(Veletri)、曲前列尼尔钠、万他维(伊洛前列素))，凝血烷类(凝血烷A2、凝血烷B2)，白三烯类(LTC4、LTD4、LTE4和LTF4)，全氟辛酸，全氟壬酸，黄连素，RS5444等。PPAR激动剂可以是“双重型”、“平衡型”或“泛”PPAR配体(“格列扎类”(glitazar))，包括例如阿格列扎、莫格他唑、替格列扎、AM3102、CAY10506、CP 775146、DRF 2519、(+)-乙莫克舍钠盐水合物、GSK3787、GW0742、GW 1929、GW 7647、GW1929水合物、W501516、L-165041、甲基-8羟基-8-(2-戊基-氧基苯基)-辛-5-炔酸酯、NPC 15199、nTZDpa、PAz-PC、吡格列酮、罗格列酮(钾盐)、罗格列酮-d3马来酸酯、S26948、WY 14643等。

在实施方式中，PPAR激动剂可以与包含至少一种RXN的RXN组合物分开包装。例如，在一个实施方式中PPAR激动剂可以在即将向患者施用之前添加至RXN组合物。在实施方式中，PPAR激动剂和RXN可以以单独的组合物施用。在实施方式中，PPAR激动剂可以被包含在悬浮于RXN组合物中的微球内。在实施方式中，PPAR激动剂/RXN组合物可包含胶丸胶丸。

PPAR激动剂和/或RXN组合物的施用可通过任何合适的方法实现，所述方法包括例如肠胃外的、经注射的、上皮的、吸入的、灌肠、滴眼剂、滴耳剂、经身体内黏膜的、经嘴的(口服的)、胃喂养管、十二指肠喂养管、胃造口术、直肠给药、静脉内的、动脉内的、骨内输液、肌内的、脑内的、脑室内的、皮下的等。

本发明的组合物可以配制成任何合适的样子，例如气溶胶、液体、酏剂、糖浆、酊剂、乳霜、软膏、洗剂、薄膜、固体、胶丸、微球悬液、软明胶胶囊等。

当作为液体组合物施用时，其可以每天服用1次、2次、3次、4次或更多次。每次施用可以为约1oz、约2oz、约3oz、约4oz、约5oz、约6oz、约7oz、约8oz、约9oz、约10oz、约11oz、约12oz、约16oz、约20oz、约24oz、约28oz、约32oz、约34oz、约36oz、约38oz、约40oz、约46oz、约1oz至约32oz、约1oz至约16oz、约1oz至约8oz、至少约2oz、至少约4oz、或至少约8oz。在一个实施方式中，组合物可以以约4oz每天两次的速率施用。

在其他实施方式中，施用可以是急性的或长期的。例如，组合物可以施用1天、1周、1月、1年或更长。

本文中描述的组合物当被施用时可以用于治疗病症或疾病。例如，无论结合运动与否，本文中描述的组合物当被施用时都能增加线粒体DNA的密度。例如，当与未服用所述组合物的个体相比时，线粒体DNA增加约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约32％、约34％、约36％、约38％、约40％、约45％、约1％至约40％、约1％至约10％、约20％至约30％、至少约5％、至少约10％、或至少约20％。线粒体DNA的增加可导致血液中较低水平的自由基，转而导致氧化应激的量减小。

本文中描述的组合物可用于治疗与线粒体DNA有关的疾病。因此，描述的组合物可以治疗的病症或疾病例如但不限于肌肉减少症、帕金森病、神经相关的年龄病、肥胖症、老化、生活压力如由恐惧引起的生活压力、神经退行性疾病、认知障碍、肥胖症、代谢率降低、代谢综合征、糖尿病、心血管疾病、高血脂、神经退行性疾病、认知障碍、情绪障碍、紧张、焦虑症；用于体重管理、或增加肌肉表现或精神表现、AIDS、痴呆复合征、阿尔兹海默症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、肾上腺脑白质营养不良、亚历山大症、进行性脑灰质萎缩、共济失调毛细血管扩张、贝敦氏症、牛绵状脑病(BSE)、卡纳万病、皮质基底核退化症、克雅二氏症、路易体痴呆、致命性家族性失眠症、额颞叶退化、亨廷顿氏舞蹈病、甘乃迪氏症、克拉伯病、莱姆病、马查多·约瑟夫病、多发性硬化、多***萎缩症、神经棘红细胞增多症、尼曼-匹克病、匹克病、原发性脊髓侧索硬化、进行性核上性麻痹、雷夫叙姆病、山霍夫氏病、弥散性成髓细胞硬化、脊髓小脑性共济失调、脊髓亚急性联合变性、脊髓痨、泰-萨二氏病、中毒性脑病、传染性海绵状脑病、和刺猬摇摆症候群、认知功能异常、感知异常、注意障碍、语言理解障碍、阅读理解障碍、图像创建障碍、学习障碍、推理障碍、情绪障碍、抑郁、产后抑郁、心境恶劣、双相情感障碍、广泛性焦虑、恐慌症、广场恐慌症、恐旷症、社交焦虑障碍、强迫性精神障碍、创伤后应激障碍、肌骨失常、缺乏力量、缺乏耐力、癌症、粥样硬化病变、动脉硬化、氧化应激、动脉粥样化形成、高血压、高胆固醇血症和退行性疾病。

本文中说明的组合物可用于治疗涉及PPAR通路的疾病，所述疾病包括例如代谢综合征、心血管疾病、糖尿病、肥胖症、葡萄糖不耐症、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、和高血压、炎症、血管功能、和血管重构、癌症、炎症、神经退行性疾病、与线粒体生物合成有关的疾病、老化等。

在实施方式中，本发明的组合物可以包括通过多重机制起作用的疗法的组分。例如，双重作用的疗法可以包括激活PPAR通路的第一疗法和不激活PPAR通路的至少一种其他药剂。在实施方式中，所述第一药剂可以为至少一种RXN。在实施方式中，所述至少一种其他药剂为mAb、放射物、手术、血管生成抑制剂、移植、癌症疫苗、基因疗法、激光治疗、光能疗法、烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝***抑制剂、皮质类固醇、激素疗法、免疫疗法等。

实施方式可以为超氧化物和/或包含RXN的脂肪酸氧化(FAO)酶提供体外底物。实施方式可以包括治疗癌症的方法，所述方法包括组合疗法，其中一种疗法包括含有增加FFA的至少一种RXN的组合物；和至少一种其他药剂，其中所述至少一种其他药剂不增加FFA。

在其他实施方式中，治疗氧化应激相关病症的方法被描述为包括向经历氧化应激的患者施用组合物，和治疗氧化应激相关病症，所述组合物包括选自如下的至少一种物质：O₂，H₂，Cl₂，OCl^-，HOCl，NaOCl，HClO₂，ClO₂，HClO₃，HClO₄，H₂O₂，Na⁺，Cl^-，H⁺，H^-，OH^-，O₃，O₄ ^*-，¹O，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O₃，O₂ ^*-，HO₂ ^*，NaCl，HCl，NaOH，水分子簇或其组合。在一些实施方式中，施用每天发生两次或一次。每次施用可包含每天约1oz至约16oz。在其他实施方式中，氧化应激相关病症是糖尿病、心血管疾病、或肥胖症。

实施例1

图3示出了用于制造根据本说明书的生命增强组合物的方法和***的平面图。本领域的技术人员理解可以对***作出修改以改变所述生命增强组合物，这些改变在本说明书的范围内。

进入的水202可以在约15-20℃的温度下经受逆渗透***204，以获得总溶解固体为约8ppm的纯化水206。然后在约15-20℃的温度下，将纯化水206进料至蒸馏器208中，并处理以获得总溶解固体为约0.5ppm的蒸馏水210。然后可以在罐212中储存蒸馏水210。

图4示出了用于准备水以进一步加工成治疗性饮料的示例性***。***300可包括能够直接进料至碳过滤器304的水源302。在将油类、醇类、和其他挥发性化学残余物和微粒通过碳过滤器304去除后，可以将水导流至水软化器306内的树脂床，其可以去除溶解的矿物。然后，如上所述的，水可以通过逆渗透***204和蒸馏器208。

根据需要，使用管线216可将蒸馏水210从罐212重力进料至盐水储罐组件214中。在一个实施方式中的盐水储罐组件214可包括12个罐218。每个罐218可使用蒸馏水210填充至约1300加仑。可使用手持计量器试验蒸馏水的盐度。

然后使用浓盐水***220盐化盐水储罐组件214。浓盐水***220可包括两个浓盐水罐222。每个罐可具有约500加仑的容量。使用管线224用蒸馏水210将浓盐水罐222填充至475加仑，然后以约537.5g/加仑液体的比率将NaCl添加至浓盐水罐222。这时，在浓盐水罐222中以约2000加仑/小时的速率将水循环226约4天。

在将浓盐水添加至罐218之前，可以使用手持电导计如YSIecp300(YSI公司，Yellow Springs，OH)测定罐218中水的盐度。这时可作出基于盐度测量的任何校正。然后将浓盐水溶液228添加至罐218以获得约10.75g/加仑的盐浓度。在罐218中以约2000加仑/小时的速率将盐化水循环230，持续不小于约72小时。在室温下进行这一循环。可再次使用手持探针测定盐化溶液的盐度。在一个实施方式中，盐度为约2.8ppth。

在用于在浓盐水储料罐中填充和混合盐水的一个方法中，测量了在罐中剩余的液体量。通过记录以厘米计，液位离支撑所述罐的地面的高度，并参照这一高度表示的加仑数，来测量在罐中剩余的液体量。如果罐是半透明的，则可以从罐的外部完成测量。也可以测量在连接的罐两者中的初始液体高度。然后，在确认关闭了出口阀之后，可以将蒸馏水泵入。然后，被泵入储料罐的蒸馏水的量可通过测量液位的升高来计算：从填充高度减去初始高度，然后用该差值乘以已知因子。

然后，通过对已经添加至罐的每加仑蒸馏水乘以11克的盐来计算要添加至罐的盐的量。可以小心地称出盐并将其倾倒入罐中。

然后，通过启动再循环泵和然后打开罐上的顶部和底部阀来搅拌罐。液体从罐的底部泵至顶部。罐在准备好被处理之前可以被搅拌3天。

在搅拌罐超过6小时后，通过从罐中采样和对其试验，使用盐度计检查盐度。可以加入盐或水来调节罐内的盐度。如果加入额外的水或额外的盐，则然后将罐搅拌额外的6小时并再次试验。在搅拌约3天后，罐准备好了被处理。

然后，将盐化水232转移至冷的盐水罐234中。在一个实施方式中，使用4个250加仑的罐。移动的盐化水232的量为约1000加仑。使用激冷器236如16吨的激冷器以将热交换器238冷却至约0-5℃。通过热交换器循环240盐化水，所述热交换器使用丙二醇循环直到盐化水的温度为约4.5-5.8℃。对1000加仑的盐化水进行激冷通常占用约6-8小时。

然后，将冷的盐化水242转移至处理罐244中。在一个实施方式中，使用8个罐且每个罐具有约180加仑的容量。将每个处理罐填充至约125加仑，总计1000加仑。再次使用热交换器246以激冷添加至处理罐244的冷的盐化水242。每个处理罐可包括激冷管的圆柱且可以循环丙二醇。热交换器可由4-5吨的激冷器248提供动力。冷的盐化水242的温度在处理期间可以维持在4.5-5.8℃。

在将陈化的盐水转移至处理罐之前，可以将陈化的盐水搅拌约30分钟以充分地混合陈化的盐水。然后，可将再循环阀关闭，打开制备罐上的合适入口阀，对罐进行填充使得盐水覆盖冷却旋管和上升至填充标记(约125加仑)。

一旦陈化的盐水达到制备温度，则将泵关闭，但是激冷器仍然开着。在整个电化学处理期间的过程中，罐应该被足够地搅拌或再循环，且温度应自始至终保持恒定。

每个处理罐244包括电极250。电极250可以是由钛形成的3英寸长环形结构且用铂镀覆。冷的盐化水的电化学处理可以运行8小时。使用电源252以向8个电极(每个处理罐244中一个)提供每个7安培的电力，共计56安培。在电化学处理期间以约1000加仑/小时的速率循环254冷的盐化水。

可使用独立的电流计以将电流设置为约7.0安培。可以注意以保证电压不超过12V且不低于9V。正常运作可以为约10V。

可以将运行计时器设置为预定的时间(约4.5～5小时)。每个制备罐可具有其自己的计时器和/或电源。计时器到时间后应关闭电极。

可以定期地检查制备罐。温度和/或电流可以保持基本恒定。开始时，电极可从顶部看见，发出可见气泡。在约3小时后，因发生氧气饱和，未溶解氧气的小气泡开始在罐中累积，使看不清电极。轻微的氯气气味是正常的。

在8小时电化学处理完成后，产生了生命增强水256，其具有约6.8-8.2的pH、32ppm的氯气、100％OCl^-和100％O^-2。将组合物256转移至储罐258。

实施例2

按实施例1中的描述制备的饮料的表征

使用多种不同的表征技术分析如在实施例1中描述制备且以商品名市售的组合物。使用ICP/MS和³⁵Cl NMR分析和定量氯气含量。使用顶部空间质谱分析来分析饮料中吸收的气体含量。使用¹HNMR来查证饮料中的有机物质含量。使用利用自旋捕集分子的³¹PNMR和EPR实验来探索饮料的自由基。

收到组合物，将其在不用时在约4℃下储存。

氯NMR

在不同的pH值下制备次氯酸钠溶液。5％的次氯酸钠溶液具有12.48的pH。将浓硝酸添加至5％的次氯酸钠溶液中以产生在9.99、6.99、5.32和3.28的pH下的溶液。然后，通过NMR谱分析这些溶液。饮料的测定pH为8.01，在不稀释的情况下用NMR直接分析。

使用配备有BBO探头的400MHz布鲁克(Bruker)波谱仪进行NMR谱实验。使用单脉冲实验在39.2MHz的频率下进行³⁵Cl NMR实验。使用10s的循环延迟，每个样品获取128次扫描。使用NaCl在水中的溶液作为外部化学位移参比。所有实验在室温下进行。

收集NaCl溶液、调至不同pH值的NaClO溶液、和组合物的³⁵ClNMR谱。图5示出了NaCl溶液、pH为12.48的NaClO溶液、和组合物的Cl35谱图。化学位移范围通过将Cl^-峰设定为0ppm来对照。pH大于7的NaClO溶液具有相同的谱图，具有在约5.1ppm处的峰。pH小于7.0时，ClO^-峰消失并由更宽的较不易识别的峰代替。组合物给出在约4.7ppm处的一个峰，来自组合物中的ClO^-。对该峰进行积分以估算组合物中ClO^-的浓度，组合物中ClO^-的浓度被确定为2.99ppt或0.17M。

质子NMR

通过将550μL的ASEA和50μL的D₂O(Cambridge IsotopeLaboratories(剑桥同位素实验室))加至NMR管中制备ASEA样品，并将样品震摇10s。在配备有QNP低温冷却探头的700MHz布鲁克波谱仪上进行¹H NMR实验。实验在水共振实验上使用单脉冲和预饱和。获取总共1024次扫描。所有实验在室温下进行。

确定了组合物的¹H NMR谱并在图6中给出。从该谱中仅能够区分出与水相关的峰。该谱图显示使用这一方法能够检测非常少的有机物质，如果有的话。

磷NMR和质谱

通过量出约5mg的DIPPMPO至2mL的离心管中来制备DIPPMPO(5-(二异丙氧基磷酰基)-5-1-吡咯啉-N-氧化物)(VWR)样品。然后，将550μL的组合物或水加入所述管中，接着加入50μL的D₂O。还使用组合物制备了溶液，但是没有添加DIPPMPO。对这些溶液加以震摇和转移到NMR管中用以分析。通过将约5mg的DIPPMPO溶于600μL的组合物中并震摇来制备用于质谱分析的样品，然后通过将100μL的样品和900μL的水添加至小瓶并震摇来稀释样品。

使用配备有QNP低温冷却探头的700MHz布鲁克波谱仪进行NMR实验。进行的实验是在283.4MHz的³¹P频率下的单个30°脉冲。使用2.5s的循环延迟和16384次扫描。使用磷酸作为外部标准。所有实验在室温下进行。

通过直接将ASEA/DIPPMPO样品直接注射进Waters/Synapt飞行时间质谱仪来进行质谱实验。绕过LC，将样品直接注射进质谱仪，并且在阳离子模式和阴离子模式两者下监测。

收集水中DIPPMPO的、组合物单独的、和组合物添加有DIPPMPO的³¹P NMR谱。使用外部参比磷酸作为化学位移参比。图7示出了DIPPMPO与组合物组合的³¹P NMR谱。在21.8ppm处的峰被确定为是DIPPMPO，在DIPPMPO有组合物(图7)和没有组合物(未绘出)的谱图两者中均可看见。在24.9ppm处的峰最可能是DIPPMPO/ΟΗ·，如在其他DIPPMPO研究中确定的。该峰可能在有和没有组合物的DIPPMPO混合物两者中看见，但是在有组合物的溶液中以大得多的浓度被检测到。在DIPPMPO与组合物的混合物中，存在另一个在17.9ppm处的峰。该峰可能来自组合物中的另一自由基物种例如ΟΟΗ·或者可能是不同的自由基复合物。组合物/DIPPMPO溶液中的自旋捕集复合物的近似浓度如下：

溶液	浓度
		DIPPMPO	36.6mM
DIPPMPO/OH·	241μM
		DIPPMPO/自由基	94μM

为了尝试确定未识别的自由基的组成而收集质谱数据。如在图8中看到的，质谱显示了DIPPMPO的母峰和碎片分布，具有在264、222和180处的m/z峰。图8还显示了DIPPMPO/Na加和物的峰和随后的在286、244和202m/z处的碎片。图8展示了具有329m/z的一个DIPPMPO/自由基复合物的峰。阴离子模式质谱也具有在327m/z处的相应峰。如在图8中所呈现的，还有在349、367和302处的较低强度的其他峰。这些峰都不能被明确地确认。然而，存在会产生这些质量分布的可能结构。对于在329处生成的峰的一种可能是由自由基与DIPPMPO组合形成的结构。这种自由基的可能性包括硝酰基-过氧化物自由基(ΗΝΟ-ΗΟΟ·)，其可能是因为与来自空气的氮气的反应而在饮料中形成。在349处的另一个峰也可能是由于DIPPMPO/自由基组合的结果。在此，该自由基的可能性可以是次氯酸盐-过氧化物(ΗΟCl^-HΟΟ·)。然而，该峰的强度小且其在阴离子模式质谱中对应的峰347的强度小，表明这可能是非常低浓度的杂质且不是存在于ASEA组合物中的化合物。

ICP/MS分析

在Agilent 7500系列感应耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)上分析样品，以确认由NMR确定的次氯酸盐浓度。使用5％的次氯酸钠储备液在去离子Milli-Q水中制备下述的一系列稀释物：300ppb、150ppb、75ppb、37.5ppb、18.75ppb、9.375ppb、4.6875ppb、2.34375ppb和1.171875ppb。使用这些标准物建立标准曲线。

基于NMR次氯酸盐浓度数据，制备下述的一系列稀释物：164.9835ppb、82.49175ppb、41.245875ppb、20.622937ppb、10.311468ppb和5.155734ppb。然后，将这些理论值与通过ICP-MS分析确定的值进行比较。仪器参数如下：

分析的元素	35Cl，37Cl
		每质量的点#	20
重复#	5
		总采集时间	68.8s
摄取速度	0.50rps
		摄取时间	33s
稳定化时间	40s

调谐	无气体
		喷雾器流速	1mL/分钟
火炬功率	1500W

ICP-MS分析的结果如下：

稀释	测定的浓度(ppb)	NMR得出的浓度(ppb)
			1	81	82
2	28	41
			3	24	21
4	13	10
			5	8	5

将稀释物与ICP-MS信号用图表作比较并拟合至线性方程(R²＝0.9522)。假设ICP-MS信号呈现线性行为，则次氯酸盐在饮料中的浓度测定为3.02ppt。通过计算初始饮料的稀释物的浓度并估算初始的饮料次氯酸盐浓度为3ppt(如由³⁵Cl NMR分析确定的)来确定浓度值。ICP-MS数据与³⁵Cl NMR数据很好地关联，确认了次氯酸盐浓度大致为1/3％(3ppt)。应注意ICP-MS分析能够测量溶液中的总氯原子浓度，而不是特定的氯物种。NMR数据表明氯在饮料中主要以ClO^-存在。

气相四极杆质谱

样品配制

一式三份地配制三组样品用于分析：1)Milli-Q去离子水2)组合物，和3)5％次氯酸钠标准溶液。使用的小瓶是具有磁性钳口盖的20mL顶空瓶(GERSTEL)。将小的搅拌子与10mL样品一起放入每个小瓶(VWR)中。将小瓶盖上，然后放入Branson型5510超声波仪中，在60℃下持续1小时。

将超声波仪设定为脱气，这使得任何溶解的气体从样品中释放到顶部空间中。在脱气之后，将样品放置在配备有加热的搅拌器和顶空注射器的CTC PAL自动取样器上。将搅拌器设定为750rpm和95℃和将注射器设定为75℃。在注入仪器之前，将各个小瓶放入搅拌器20分钟。从小瓶中收集2.5mL的顶空体积并注入仪器中。

仪器参数

使用的仪器是Agilent 7890A GC***，其连接至为电子电离而设置的Agilent 5975C EI/CL单四极杆质量选择检测器(MSD)。将GC烘箱设定为40℃，前进样口和传送线分别设定为150℃和155℃。使用的载气是氦，将其设定为15PSI的压力。

将MSD设定为单离子模式(SIM)以检测以下分析物：

分析物	质量
		水	18
氮气	28
		氧气	32
氩气	40
		二氧化碳	44
氯气	70
		臭氧	48

将电离源的温度设定为230℃和将四级杆温度设定为150℃。将电子能设定为15V。

从水、组合物和次氯酸盐溶液的气相顶部空间的分析中获得质谱数据。为了消除任何的***性仪器变化，将由质谱仪获得的原面积计数归一化为氮气的面积计数。将氮气和水两者作为标准，是因为它们在小瓶中以等体积存在，氮气占据顶部空间而水为溶剂。假定在脱气后，对于每个样品，水和氮气整体上的体积将是一样的。为了使这一假设正确，每个样品的氮气对水的比率应该相同。对于相对标准偏差百分比(％RSD)，使用5％的截断值。在所有九个样品中，观察到了4.2％的％RSD。要注意的是，样品NaClO^-3好像是异常值，因此当去掉后，％RSD跌至3.4％。

图9-11示出了氧气/氮气、氯气/氮气、和臭氧/氮气比率。看起来，这些气体从组合物中释放的要比从水或氮气中释放的更少。应注意，臭氧和氯气两者的信号非常弱。因此，可能这些信号是由于仪器噪音而不是来自目标分析物。

图12示出了二氧化碳对氮气的比率。看起来，从组合物中释放的二氧化碳比氧气多。然而，这可能是因为来自大气的背景污染。

基于以上，从水和次氯酸钠两者中释放的氧气比从组合物中释放的氧气多。

EPR

制备两种不同的组合物样品用于EPR分析。未添加任何东西的组合物是一个样品。另一样品通过将31mg的DIPPMPO添加至20mL的组合物(5.9mM)、震摇并将样品放置在4℃冰箱中过夜来制备。将两个样品放入小的毛细管中，然后***标准5mm EPR管中用于分析。

在布鲁克EMX 10/12EPR波谱仪上进行EPR实验。利用3500高斯的中心场位置和100高斯的扫频宽度，在9.8GHz下进行EPR实验。使用20mW的能量脉冲，调制频率为100kHz且调制幅度为1G。实验使用100次扫描。所有温度在室温下进行。

在溶液中有和没有混入DIPPMPO的组合物上进行EPR分析。图9显示了从与组合物混合的DIPPMPO生成的EPR谱图。仅仅是组合物的话在100次扫描后未显示EPR信号(未示出)。图13示出了自由电子的EPR裂分模式。这一电子看似由三种不同的核裂分。该数据表明这是OΗ·自由基与DMPO(与DIPPMPO相似)相互作用的特征裂分模式。这一模式可以描述为¹⁴N将峰裂分为三个相等的峰，三个键长外的¹H将该模式裂分为两组相等的三重峰。如果这些裂分相同，则其可产生四重峰裂分，其中两个中间峰的大小是外面峰的两倍。这一模式在图13中出现两次，一个四重峰的较大峰在3457和3471处，另一个四重峰的较大峰在3504和3518处。在这种情况下，¹⁴N裂分和¹H裂分两者均大致为14G，与ΟΗ·自由基连接至DMPO相似。图13中的两组四重峰模式由另外的47G裂分产生。这一裂分最可能来自与³¹P的耦合，之前已看见过相似的模式。图13中的EPR谱表明溶液中存在DIPPMPO/ΟΗ·自由基。

实施例3

向运动小鼠递送组合物

研究表明，与对照小鼠相比，向小鼠增补绿茶提取物8-10周导致平板运动(treadmill)至力竭时间增加。在用绿茶提取物处理的运动小鼠中测出了较高的肌糖原和增加的脂肪酸β-氧化。基于这些研究，进一步探索能够增加物理性质如至力竭时间、VO_2max等的其他增补物可能是有用的。

研究了小鼠中组合物(ASEA)摄取对平板运动耐力、食物基材利用率、组织炎症和组织氧化应激的影响。如果ASEA引起脂肪酸动员增加，则服用ASEA(与安慰剂相比)的小鼠的耐力增加。当服用ASEA时，可以看出节约了肌糖原。给予小鼠等同于约人类ASEA剂量一半的剂量。

从Jackson实验室购买六个月大的雄性无特定病原C57BL/6实验室小鼠(n＝60)。将小鼠随机分配至四个治疗组中的一个(每个n＝15)，如在图14中示出的。在图15中示出了小鼠准备和研究的总概述。

在涉及运动和营养干预性研究两者的先前研究中使用了这一特别的小鼠品系和模型。因此，使用这一品系使能够与来自其他研究的数据进行比较。对于这种类型的研究，小鼠可以是人类的合适替代品，因为小鼠与人类基因上相似，因此在这一研究中获得的数据可转移至人类干预性研究。

所有的动物处理程序在北卡罗来纳州研究校区(North CarolinaResearch Campus)的实验动物科学中心(Center for Laboratory AnimalSciences)(CLAS)内发生，实验方案由机构动物保护和利用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)审查和同意。

通过填喂法(gavage)给小鼠施用ASEA或安慰剂(与ASEA组合物成分相同，未加入专利的信号分子)，每天一次，持续1周。确定所有小鼠在研究开始时的平均体重和用于填喂的ASEA的体积，但是体积未超过每个小鼠0.3ml。填喂法的指南如下：“体积不应超过体重的1-2％(对于20g的小鼠为0.2-0.4ml)”。因此，对于6个月大的30g小鼠，0.3ml的体积很好地低于这一体积提议。

组合物不美味，小鼠不情愿喝它。因为小鼠不喝研究组合物，所以填喂法是可接受的可选法，以保证小鼠不会变得脱水。填喂法由CLAS的动物饲养员实施。在一个实施方式中，可以给予小鼠本文中描述的日人类剂量相等量的组合物。

在1周(7天)处理时期后，将小鼠安乐死，采集组织以进一步分析结果测量值。四组小鼠每天逐步进入1周实验方案。例如，如果组1在给定的一天开始实验方案，组2在接下来的一天开始实验方案，组3在接下来的一天开始，组4在那之后的一天。然后，来自组1的小鼠将在最后的平板跑步试验后(治疗的第7天)被安乐死，组2、组3和组4各自在随后的一天。因此，小鼠实验方案的总时间是11天。平板运动练***板运动试验和安乐死日有重叠。如所述的，在安乐死之前，来自组1和组3的小鼠利用在下表中总结的实验方案经受耐力平板运动试验至力竭。

在最大耐力试验之前的3天时期期间，小鼠每天进行平板运动练***板上经受最大耐力试验。

来自组2和组4的小鼠不进行耐力试验，并在1周处理的最后安乐死。收集从这些小鼠采集的组织以评估试验组合物在没有运动干预下的慢性效果。所有的血液/血浆和组织在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃下直至化验。

对于平板运动练***板(哥伦布仪器，哥伦布OH)上跑步。一旦将每个小鼠放在平板运动跑道中，就启动1分钟休息时期。这时，小鼠能够适应平板运动室的内部。在1分钟休息时期之后，以约10m/min的速度开动平板运动跑带，并遵循上表中描述的实验方案。

使小鼠奔跑直到它们不能再跟上跑带且后肢在电击网上停留超过约5秒。当小鼠不再奔跑时(通过4爪离开跑带，坐在电击网上超过5秒来评价)，立即从电击网上移走小鼠并放回居住笼中。然后，在练习回合后，观察小鼠恢复至少约20分钟的时期。

每只小鼠仅进行一次最大耐力试验，在该试验后立即将小鼠安乐死。当在试验期间的任何点小鼠不能够从电击网跑下到运动平板上时或者力竭的迹象(高于正常心率和供氧的迹象)很明显时，试验终结。

使用的力竭迹象包括小鼠坐在电击网上超过5秒，快速呼吸，和/或增加的心率。我们的经验是未疲乏的小鼠不会显示这些迹象，且将在停下的5秒内继续奔跑。这些程序遵循基于该领域的研究的国家推荐(美国生理学会之动物运动实验方案设计的资源手册(AmericanPhysiological Society's,Resource Book for the Design of Animal ExerciseProtocols)，2006)。如果在试验期间的任何点处，小鼠的脚夹在了电击网和运动平板之间，则立即终止试验。如果小鼠受了伤并需要治疗，则遵循合适的程序并通知动物园工作人员。如果认为小鼠未受伤，则允许其恢复并放回其居住笼中并在接下来的一天再试验。一旦小鼠完成了实验方案，则将小鼠放回其居住笼中。一般来讲，在耐力试验后回到居住笼30秒内，小鼠通常就恢复并在笼内四处跳动了。然而，在所述程序后的20-60分钟期间仍然监控小鼠若干次，记录任何的不正常情况如漠然或采食量降低。

需要一些形式的激励来让小鼠在运动平板上奔跑，特别是在练***板封闭了运动平板，用手拍打尾巴是不理想的。因此，对于运动平板上的运动，电击网是最好的激励方法。

电击网位于运动平板的后面。电击网以150伏下1.0毫安培的平均电流输送脉冲冲击(电击网在0-3.4mA的范围内可调节)。用安培计定期地检查电击网以保证恰当的运行。使用的冲击水平比文献中接受的冲击水平低22倍。另外，***的电流强度比小鼠的致死水平低167-500倍，***的总功率比小鼠的致死水平低60倍。不存在新的数据或指南来暗示用我们提议的设置来使用电击网是根本不合适的。

基于相似的研究，效应值(effect size)计算为1.647。在先验乘幂分析(priori power analysis)期间，显著性使用p＝0.0125。使用G-Power软件作出了以下计算，动物的最小有效数被认为是12只/组。每组使用15只动物(估算乘幂为0.95)，以便如果有动物没有通过实验方案时抵消乘幂损失。

分析：先验：计算所需要的样本大小

基于来自小鼠研究的结果，将结果示于图16-20中。图16(A和B)示出使用了ASEA的小鼠奔跑至力竭的时间增加。因此，在运动员运动时，ASEA可用于增加至力竭的时间。

图17A和17B示出了与不同小鼠组的ASEA相关的倍数变化；p＝0.042。这一测定监测12sRNA(线粒体DNA拷贝数)。定栖的小鼠食用一周的ASEA并没有增加肌肉线粒体的密度。相对于ASEA定栖(P<0.05)，观察到一个长的至力竭耐力运动回合与AESA之间的相互作用。当ASEA与运动一起递送时，倍数变化增加，但是运动不存在时则降低。这证实ASEA帮助降低肌肉中的氧化应激水平。

图18示出当施用了ASEA并进行运动时，小鼠中肝内制造的SOD降低。U是抑制超氧化物自由基50％歧化所需要的酶量。剧烈的运动回合激活CuZnSOD活性，但是多数研究报道其mRNA和酶蛋白水平没有变化，说明增加的活性是因为增加的O^2-浓度。这一结果可以表明ASEA与运动相关联可以减小氧化应激。

图19A和19B示出当施用ASEA并进行运动时，小鼠中氧化型谷胱甘肽降低。这一结果可以表明ASEA与运动相关联可以减小氧化应激。

图20示出对于IL-6和TNF-α运动增加了mRNA(基因表达)，表明典型的前炎症反应。ASEA倾向于减少这些炎症细胞因子的基因表达。

实施例4

人类骑车运动研究

使用其中实验对象喝了ASEA组合物的本发明的***和方法进行研究来估计个体代谢的增加。研究在北卡罗来纳州研究校区的代谢组学实验室(Metabolomics Laboratory,North Carolina Research Campus)、David H.Murdock研究所(David H.Murdock Research Institute)与阿巴拉契亚州立大学(Appalachian State University)进行。研究的目的是测定ASEA对能够变化以响应增补的小分子(代谢物)的影响。取决于营养产品，代谢物的变化可以代表对炎症、氧化应激和生理应激的影响。

22个实验对象参加了研究。测试了各个实验对象的VO_2max和身体组成的基线值。然后，给予10个参与者ASEA组合物，一天一次，持续7天，而且给予10个实验对象安慰剂，一天一次，持续7天。

在研究的第一阶段之日，从所有的22个参与者收集血液和尿液，然后22个参与者各自骑车75km。正要完成75km骑车之前和其后一小时收集血液和尿液。结果在下面列成表。

然后过了三周的清除期，期间参与者未食用ASEA组合物。在该三周之后，参与者交换并给予相反的组合物，持续7天。进行相同的例行程序(血尿、75km骑车、血尿、一小时后血尿)。结果在下面列成表。

摄取了7天ASEA的运动员在开始75km的自行车试验时具有高的血液游离脂肪酸，导致脂肪氧化增加并节约了氨基酸(和潜在地节约肌糖原)。

实施例5

人类奔跑表现

一项研究，其确定当运动员在运动平板上以调节至70％VO_2max的速度奔跑时，在2周期间摄取本发明的组合物相对于摄取安慰剂是否提高了奔跑至力竭的时间。该研究试验方案的流程图示于图22中。

收集血液和骨骼肌活检样品并分别分析代谢物和糖原利用度变化，以研究根本的机制。

当本发明的组合物与运动一起使用时，代谢物和糖原利用度改变。

实施例6

摄取ASEA对过重/肥胖中的疾病风险因子变化的功效 女性

根据图23中的实验方案进行12周的随机试验。该研究评估在12周时期内，与安慰剂相比，4fl oz/天的ASEA在帮助成年女性改善与：动脉僵硬度、炎症、胆固醇状态、血压、氧化应激和氧化能力、空腹血糖和代谢激素相关的疾病风险因子中的有效性。

在12周时期内摄取ASEA降低动脉僵硬度、降低炎症、改善胆固醇状态、降低血压、降低氧化应激和氧化能力、降低空腹血糖和改变代谢激素。

实施例7

免疫支持性增补物ASEA对运动表现的效果

描述的是一项初步研究，其测定了免疫支持性增补物对运动表现的可能影响，如通过标准VO_2max和换气阈值(VT)运动耐力试验测定的。

该初步研究的目的是：(1)确认免疫支持性增补物对运动表现有效果的一般观察，和(2)确定在有氧和无氧运动阶段两者期间由口服这一增补物所影响的特定生理参数：心率(HR)、吸入的O₂体积(VO₂)、呼出的CO₂体积(VCO₂)、呼出的气体体积(VE)、呼吸率(RR)、呼吸交换率(RER)、有氧阈值(AeT)、无氧阈值(AT)、VO_2max和换气阈值(VT)。

作为免疫支持性增补物的本发明组合物含有氧化还原信号分子的均衡混合物，其据称增加细胞间通信通道的效率，促使较快的免疫***响应和细胞治愈活性。体内的酶还将这些氧化还原信号分子分解成盐水和新生态氧。提出了涉及能够影响运动表现的氧化还原信号转导的两种机制：(1)细胞吸收和使用氧气的效率增加，延长了有氧机制，和(2)乳酸能储和组织修复机制的进程更加有效，延长了无氧机制。

在物理活动期间，来自肌组织的增加的能量需求需要增加可用能储的代谢。糖的持续有氧代谢能够满足这一能量需求，只要血液中有足够的氧气和糖供给即可。当能量需求超过了呼吸和心血管***向肌组织输送充足氧气的能力时，涉及糖类、肌酸类、丙酮酸盐类等的无氧代谢的方法开始变得普遍。

无氧代谢满足能量的过量需求，但是伴有CO₂和乳酸盐的产生。延长的或过量的无氧代谢对可用能储的清除要快过它们的再生；累积的CO₂和乳酸盐也会干扰有氧代谢，因此，当能储耗尽时，将导致疲劳。

因为无氧代谢的特点是CO₂和乳酸盐的过量产生，可通过测定运动期间呼出的过量CO₂或在血液中的乳酸盐的累积来监测。换气阈值(VT)是当过量的CO₂首次在呼出的气息中被检测到的点；其与无氧代谢开始变得普遍处的点相关。

在该初步研究中，从VCO₂对VO₂图图表性地确定VT。VCO₂是每分钟呼出的CO₂体积，VO₂是每分钟吸入的O₂体积。VO_2max简单地是任何给定个体可能的每分钟吸入的最大O₂体积。以mL/kg/min(每千克体重每分钟的O₂毫升)测定VO_2max。在VO₂曲线的峰处测定VO_2max。通过软件确定有氧阈值(AeT)，其表明燃脂代谢活动开始由有氧代谢所主导时的时间。无氧阈值(AT)通过软件确定，其标出当无氧机制开始完全主导时的点。

招募方法：对18个运动员进行标准VO_2max试验，所述运动员对张贴在体育俱乐部的招募传单和向本地的竞赛型铁人三项队发出的邀请做出回应。基于来自资格问卷的回答选择参与者，所述资格问卷证实了他们：

1.平均至少每周五小时进行严格的体力锻炼。

2.没有可能妨碍参与的身体状况。

3.同意遵循饮食和饮水指导。

4.在研究期间愿意仅进行正常的日常工作。

5.家族未有心脏问题史。

最后的选择是水准比在招聘传单中反映的预期高的多的运动员，大多是在常规运动竞赛中涉及的运动员。所有的参与者在研究前都未服用过该增补物。

参与者为接受任何的金钱补偿，但是确实接受了一箱产品和来自VO_2max试验的结果。

在体育俱乐部由认证的专业人员完成VO_2max试验，所述专业人员持有运动生理学的学位并有多于10年的执行VO₂试验的日常经验。让参与者选择在运动平板或固定自行车上进行试验。代谢图测定心率(HR)、吸入和呼出的气体(VO₂，VCO₂，VE)，并记录重量、高度、年龄和体重指数(BMI)。每分钟记录运动平板或自行车上的功率设置。

每个参与者按计划进行两次VO_2max试验：(1)基线试验和(2)最终试验。在任何增补物摄取前进行基线试验。在基线试验和最终试验(7-10天后)之间，参与者每天喝4oz.的增补物，并在开始最终试验前10分钟喝8oz.的增补物。对于基线试验，由试验管理员确定自行车或运动平板的功率设置。对于每个参与者，最终试验的功率设置与基线试验的功率设置完全匹配。鼓励参与者严格地维持他们的正常饮食和运动惯例并水分充足地来参与每次试验(在每次试验前最后2小时至少8oz.的水)。

每个参与者配有呼吸面罩和心脏监护器。每组VO_2max试验包含10分钟的热身期，其中参与者在由管理员确定的较低功率设置下行走或骑车。接下来是提升(ramp up)期，其中管理员根据他们对参与者的身体状况的评估每分钟地增加功率设置，并且在RER(VCO₂/VO₂)>1.0时当管理员开始看见最大VO₂读数的迹象时终止或由管理员判定终止。管理员具有足够的经验来在这一设备上获得恒定的VO_2max，在过去5年中试验到试验变动估计约为6％。

从软件收集原始数据(HR，VO₂，VCO₂，VE，功率设置)用于分析。通过软件，将数据点在15-25秒的呼吸间隔内自动取平均值，使用平均的VO₂峰法也通过软件确定了VO_2max。从VCO₂对VO₂图的斜率图表性地确定VT。

使用线性回归法确定斜率、VCO₂的变化对VO₂的变化。理论上，当有氧机制切换至无氧机制时，排出的CO₂的体积(VCO₂)相对于吸入的O₂的体积(VO₂)成比例增加。这反映为VCO₂对VO₂图的斜率增加，如在图中看出，在VT点周围有清楚的弯曲。使用线性回归确定在VT之前和之后两者的斜率。通过线性回归，在VT点之前和之后的数据点的线性区域上确定斜率，所述数据点排除了围绕VT和靠近VO_2max的点。使用前线和后线的交叉点确定报道的VT点(图24)。

从基线试验到最终试验，将用于在任何个体参与者上确定VT点的方法保持一致。平均HR在功率提升期间HR增加的线性范围内取平均值，将数据集的开始后和结束前几分钟的点排除。在各种情况下，对于每个参与者，最终试验使用的数据分析方法与基线试验使用的相同。

基于对服从问题的回答，就参与者和管理员而言，对实验方案的服从非常高。一组数据集因VCO₂值低而被放弃，可能是由于面罩松弛引起。抛弃了该参与者的换气数据，剩下17组有效数据换气数据集。然而，对所有18个参与者的心率(HR)进行比较。

在所有参与者(N＝17)上测量到的平均VO_2max读数相对较高，为62.5mL/kg/min，指示了样品中运动员的质量。只有4个参与者的VO_2max读数低于55mL/kg/min；这四个未参与竞争训练方案。

数据显示生理参数的两个显著变化可以归因于组合物的摄取，如通过统计性配对t-试验分析确定的。到达VO_2max所占用的平均时间增加了10％，具有非常高的可信度(P＝0.006)，并且到达换气阈值(VT)占用的平均时间增加了12％，具有临界的可信度水平(P＝0.08)。

鉴于基线试验和最终试验之间的功率提升点对于每个参与者是相同的，在最终试验中获得VO_2max和VT的时间量增加还表明在这种阈值下的平均功率输出更高。没有可用的经校准的功率输出测量值。然而，在达到基线试验记录的最大功率时，最终试验的试验管理员，在参与者达到最终试验的VO_2max前有规律地超过这一最大功率。

所有其他生理参数(VO_2max，VT，AeT，AT，起始HR，在AeT处的HR，在AT处的HR，在VO_2max处的HR，总平均HR)不被增补物摄取显著改变。然而，这些参数在基线试验和最终试验之间的高度一致性证实了试验的可重现性。对于所有的参数，试验到试验的重现性具有小于5％的估算标准偏差。

研究中的17个参与者中，他们中的70％经历了达到VO_2max的时间的显著增加，18％的参与者显示多于25％的增加，41％的显示多于10％的增加，18％的参与者显示不显著的变化，还有12％显示略微降低(少于10％)。

“到达VO_2max的时间”和“到达VT的时间”的增加之间有中等的但显著的相关性(相关系数0.35)，意味着到达VO_2max的时间的增加是中等的但不总是与到达VT所用的时间的增加成比例。到达VO_2max的时间的增加和平均总心率的降低之间有强的相关性(相关系数-0.67)，意味着到达VO_2max的时间的增加将常常伴有平均总心率的降低。

显示出在等同的仔细调节的功率提升条件下，在VO_2max试验前7-10天摄取和在VO_2max试验前立即摄取试验增补物本发明的组合物显著提高70％的参与者达到VO_2max所用的时间。同样地，到达VT的时间也显著延长。

在相似的对能量的增加的需求下，到达VT的时间延长直接表明代谢的有氧阶段延长，和/或随着能量需求的增加，无氧阶段以某种方式被延迟。

任何其他生理参数(VO_2max，VT，AeT，AT和相关心率)变化的缺乏表明心血管容量、肺容量和血氧容量和调节未受影响。这一假设是合理的，鉴于这一研究期间短，排除了训练效应的可能性。

对结果的一个可行解释在于有氧效率的提高，意味着在相同的生理状态可以提取更多的有氧能量，或乳酸盐或CO₂的的清除变得更为有效，这再次允许较大的有氧效率。注意在这一研究中未汇编“到达AeT的时间”和“到达AT的时间”，然而这些参数的变化会被预期到且可能提供线索来确定根本的机制。

这一初步试验的结果表明存在运动表现提高的强力证据，进一步的研究显得必要。基于安慰剂的双盲试验将为这一效果提供可辨证据并为某些具体的根本性作用机制提供更好的支持，所述双盲试验测量在受控的、校准的功率提升期间，在换气和心率中的细微效应以及血液乳酸盐水平的增加。

实施例8

体外生物活性研究

描述了来自体外实验的多种结果，所述实验在国家研究所进行，研究本文中公开的组合物当处于与活细胞直接物理接触时的生物活性。具体研究包括活细胞中的主要抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)的体外毒性和抗氧化剂效率，以及已知在人类细胞中调节毒性反应和抗氧化剂制造的两种被深入研究的转录因子(NF-kB，NRF2)的移位(translocation)。对人类细胞中与诱导的氧化应激相关的浓度依赖性以及细胞增殖、计数，也进行了一些初步工作。

所述研究的目的是：(1)确定当不同浓度的特定氧化还原信号化合物ASEA被放置与活细胞物理接触时，是否有明显的毒性迹象(NF-kB激活)，(2)确定这样的直接接触是否影响谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)的抗氧化剂功效，和(3)确定这种接触是否激活活的人类内皮细胞中与抗氧化剂的表达增加相关的移位性转录(NRF2)和通过蛋白印迹分析核实这种转录因子的表达，(4)确定这一氧化还原信号化合物对人类细胞的增殖细胞计数和细胞活力和健康的相关标记物(LDH)的影响，(5)确定这一氧化还原信号化合物对受到细胞因子(恶质素)、放射物和血清饥饿胁迫的细胞的影响。

所述免疫支持性组合物包含RXN[活性氧物质ROS)和还原态物质(RS)两者]的氧化还原均衡混合物，所述RXN参与人类细胞中各种各样的通路和受***点活性。例如，当细胞出于任何原因(外源毒素、DNA破裂或感染)损伤时，细胞内的天然氧化还原信号信使可以变得不平衡，常常表现为细胞内氧化剂和ROS(氧化应激)积聚。如此受到影响的细胞将激活防御和修复机制，旨在恢复适当的氧化还原信号稳态和适当的细胞功能。如果修复尝试不成功且不能够恢复正常的稳态氧化还原平衡，则在几个小时内，这种细胞中的过量氧化剂和ROS将促使凋亡步骤以内部消化和毁灭功能失调的细胞。然后，健康的相邻细胞将***来代替它。已经建立了称作“氧化还原信号转导”的完整科学领域来研究这种过程，差不多有成千上万的可用参考文献。

某些氧化还原信号分子的本质是当失去平衡或被分离时在与其接触过的活细胞中引起即时的可识别毒性反应；过氧化氢是这种氧化还原信号分子的一个实例。对于毒性物质的第一线细胞反应包括NF-kB移位进入核内作为炎症反应和其他防御机制的前体。在荧光显微镜下借助荧光标记分子，在活细胞中能够可视地追踪NF-kB向核内的移动。观察到NF-kB的核移位是毒性反应已经启动的确信标志。使用这一万能方法，甚至可以检测低水平的毒性；例如，低水平浓度的过氧化氢产生易于区分的阳性毒性反应。

单独的转录因子NRF2响应低水平的氧化应激而移入核中并促进抗氧化剂的生产增加。再次，通过使用荧光标记，在荧光显微镜下可在细胞中看到NRF2的核移位。NRF2核移位是第二线防御机制，被认为增加保护性酶和抗氧化剂如谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的生产。NRF2移位将经常伴有低水平的NF-kB活化且NF-kB活化(几乎)总是在NRF2移位之前。为了刺激这些天然的防御-修复-替代机制，长期以来已经使用显示低水平毒性的物质如微量顺势疗法毒素(homeopathic toxin)来激活NRF2通路。

抗氧化剂如谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)的酶功效，可通过标准化的ELISA试验来确定，其在活细胞已经被暴露于试验物质给定的时间段后，测量引入细胞裂解物中的某些氧化剂的时间相关的还原。必须选择ELISA试验的试剂，使得不能干扰试验物质或与试验物质作用。必须实验性地确定其他重要因素如暴露时间和浓度依赖性。

同样存在蛋白印迹法来实验性地确定细胞裂解物中的GPx或SOD的量。这些已被广泛接受的分子分离技术可用于直接证实这种抗氧化酶的量是否在样品中增加。然而，测定的抗氧化剂效率仍然是细胞抗氧化防御的最佳指示。

对细胞增殖、细胞计数和细胞死亡的化学指示剂的监测也通常被用于确定细胞活力和对应激物如放射物、细胞因子和毒素的总反应。例如恶质素是潜在毒素，是引起即时毒性反应和氧化应激在被暴露过的细胞中累积的细胞因子。受到如此胁迫的细胞更倾向于经受凋亡和死亡，由此将内部蛋白(如LDH)释放到周围血清中。

通常来讲，当这种应激物和毒素的引入在细胞培养物中引起氧化应激条件时，细胞计数下降，细胞增殖减弱，血清LDH水平升高，表明在培养物中发生细胞死亡。过氧化氢、放射物和血清饥饿也能够引起相似的反应。如上面概述的，氧化还原信号信使密切参与这种应激物的细胞接收(reception)和对这种应激物的反应；氧化还原信使参与调节抗氧化剂生产和保护细胞的活动，参与修理DNA和结构损伤所必须的修复机制中，还参与调节导致细胞死亡的凋亡步骤。

在血清中增加这种氧化还原信使的浓度可用于提高这些正常细胞过程的效率。必须实验性地确定各种氧化还原信号混合物的准确作用。独立的未公开的研究，包括质谱、荧光谱和电子自旋共振，已经明白地证实了本文中描述的组合物中存在几种氧化还原信号分子。已被广泛接受的氧化还原电化学也确认了这种氧化还原信号分子的存在。这一氧化还原平衡的混合物的稳定性比预期的大许多数量级。所确认的不稳定部分在该增补物中的保留可能由如下解释：存在某些稳定的分子复合物，它们中的一些通过质谱证实而且能够屏蔽自由基相互作用。然而，知识产权协议阻止了细节的公开。

以下研究由国家实验室的高级研究员尽力进行，并被设计用于在本发明的组合物处于与人类细胞直接接触时评价基本的作用方式：

1.从来自人类试验的10mL本发明组合物/kg当量的口服剂量推算体外研究中预计的初始剂量范围。

2.使用谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)ELISA来确定本发明的组合物是否改变小鼠表皮(JB6)细胞中的酶活性。

3.对暴露于本发明组合物的各种细胞类型确定LDH(非特异性细胞死亡)水平和细胞增殖率。

4.人微脉管内皮肺细胞(HMVEC-L)用本发明的组合物处理，细胞裂解物通过GSH-Px和SOD ELISA分析来确定抗氧化酶活性是否改变。

5.用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)阴性对照、5％和20％浓度的本发明组合物和恶质素阳性对照处理HMVEC-L细胞，以确定在30、60、90和120分钟间隔的NF-kB的p65亚单元的核移位活性(细胞因子转录)。使用荧光显微技术来成像细胞反应。

6.重复步骤(4)，不同的是确定了P-Jun的核移位活性作为步骤4的延伸/证实。

7.用低的小于1％浓度的本发明组合物处理HMVEC-L细胞的两种培养物，以确定与阴性(PBS)对照相比，在30、60、90和120分钟间隔的NRF2的核活性(抗氧化剂转录)，所述两种培养物一种有正常的随机细胞周期且另一种有血清饥饿。

8.与阳性过氧化氢对照相比较，对暴露于<1％的本发明组合物的血清饥饿型HMVEC-L细胞培养物的核外和核内部分进行蛋白印迹分析，以确定在0、30、60、90和120分钟间隔的核外部分中的磷酸化事件(氧化作用)和核内部分中的NRF2(抗氧化剂转录)，所述核外部分和核内部分通过差速离心来分离。

9.正常随机细胞期的HMVEC-L细胞被暴露于放射物，然后用本发明的组合物处理。进行细胞计数来确定生存率。

10.通过细胞中胞外和胞内LDH活性的变化确定融合期和正常期HMVEC-L细胞中的恶质素接收的功效，所述细胞被暴露于恶质素、PBS和本发明溶液组合物的各种混合物。

在原代人肺微脉管内皮细胞(HMVEC-L)中评价毒性反应使用的实验方法：HMVEC-L细胞(目录#CC-2527)作为冷藏保存细胞(Lot#7F4273)从Lonza(沃克斯维尔，MD)购买。根据制造商说明将细胞解冻和保持。细胞培养基(由Lonza提供的专利配方)含有表皮生长因子、氢化可的松、GA-1000、胎牛血清、血管活性内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素生长因子-1和抗坏血酸。

正常随机细胞周期中的HMVEC-L细胞培养物被暴露于血清介质中的浓度为5％和20％的高浓度ASEA，与被暴露于作为非毒性阴性对照的磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)的培养物和被暴露于作为阳性对照(高毒性的)的恶质素(5ng/mL)的培养物一起进行分析。在0、30、60、90和120分钟的间隔，将来自各个培养物的细胞等分试样置于荧光显微镜下，所述细胞通过被设计用于标记NF-kB的p65亚单元的荧光染料以及辅助电脑软件找出核的DAPI荧光核染色剂染色。通过几种细胞上的荧光分析，使用电脑自动化成像技术确定NF-kB向核内的相对移位程度。作为对读者的提醒，P65NF-kB移位是对毒性的第一阶段非特异性细胞反应。因此，如可视地从显微图像看到的NF-kB向核内的移动是一般毒性反应的敏感指标。

HMVEC-L细胞p65亚单位NF-kB毒性筛选的结果：下面示出了每一培养物的典型细胞图像。在被暴露于高浓度的本发明组合物的任何细胞培养物中未看到NF-kB的p65亚单位向核中的移位。自动化分析对此进行了证实并表明在0、30、90和120分钟间隔没有毒性反应。相反，被暴露于恶质素的细胞显示了即时的持久毒性反应(图25)。

恶质素是阳性对照并诱导NF-kB的p65亚单位从胞液向核内移位。DAPI染色显示了核在这些图像中的位置(见白色箭头)。本发明的组合物(5％和20％的最终v/v)未在30、60和120分时间点处诱导NF-kB的核移位。

鉴于暴露于高浓度ASEA之后未显示毒性，进行了另一试验来确认行为。

评价HMVEC-L细胞毒性反应的另外方法(P-Jun)：使用与NF-kB使用的方法相似的方法学确定抗-磷酸化-Jun(AP-1P-Jun)抗体指数的核移位(P-Jun是另一个毒性相关的氧化还原反应性转录因子)。HMVEC-L细胞被再次暴露于高浓度ASEA。所有程序与NF-kB分析相似，不同的是替换成了P-Jun荧光指示剂和自动化测量在100个细胞上进行以增加灵敏度。还分析了另外的幼稚型(未被接触的)培养物。

P-Jun毒性筛选的结果(图26)：使用抗-磷酸化-Jun(P-Jun)抗体确定AP-1指数。AP-1位于核并且在激活时P-Jun的磷酸化状态增加。抗-P-Jun抗体与磷酸化形式的结合反映为荧光强度增加(见恶质素对照)。对于用5％或20％ASEA处理的细胞，未在30、60和120分的时间处点观察到反映P-Jun水平增加的一致趋势，而恶质素阳性对照在30分处显著地增加了核P-Jun水平。

再次，未观察到毒性反应；在被暴露于高浓度的本发明组合物的细胞培养物的核中没有显著的P-Jun积聚。自动化分析表明在0、30、90和120分钟没有毒性反应，对于20％的本发明组合物，在30分钟时间点有轻微的但不显著的增加，在其他时间点未检测到增加。相反，暴露于恶质素的细胞(阳性对照)如预期的显示即时的持久毒性反应。

P-Jun分析的结果与在NF-kB分析中看到的反应相一致。对于两个试验，对于健康随机期HMVEC-L细胞，暴露于本发明组合物和暴露于阴性PBS对照之间没有显著区别。对于氧化还原信号分子的这一混合物，考虑到已知它们中的一些如果从混合物中分离会引起即时反应，因此这一确认的毒性缺乏一定程度上是意外的。

因为NF-kB和P-Jun的核移位通常是对血清毒性的第一反应物，并已知尤其是在超敏人内皮细胞中引发炎症反应，健康人细胞当直接暴露于本发明的组合物时，不期望显示防御性行为或引发炎症过程(例如释放炎症细胞因子)。从这一数据不确定暴露是否将抑制或逆转炎症过程。

对于所有的体内口服应用，这种氧化还原信号分子的血清水平，将不会超过1％的血清浓度，通常将小于0.1％。预期由于组分的酶性分解，血清水平随着时间降低。独立的体内药代动力学研究表明ASEA中的活性组分在血液中具有约17分钟的半衰期，因此在几小时内将从血液中有效地清除。因此，不预期由于健康细胞在这种水平下的暴露会有毒性反应。在这些体外研究中已经看出，人细胞对高达20％的血清浓度的直接暴露仍然被很好地耐受。与PBS对照具有可比性的毒性的完全缺乏是极其罕见的，并说明尽管该混合物有活性，其仍被人组织很好地耐受，并且与细胞外环境是相同或相容的。

用于确定谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的抗氧化剂功效的实验方法：使标准小鼠表皮细胞(JB6)的细胞培养物暴露于各种小浓度的本发明组合物(小于1％)和PBS溶液，持续24小时。制备细胞裂解物，以使用商购ELISA试剂盒(GPx活性试剂盒，Cat#900-158)、根据制造商(AssayDesigns,Ann Arbor,MI)说明书来测定GPx酶活性。在化学试剂(氢过氧化枯烯)引发反应后，在11分钟时间段内监测因GPx酶活性造成的氧化剂降低。氧化剂的降低指示了抗氧化剂功效。为了确定不同浓度的PBS和本发明组合物的GPx功效，每2分钟读取三次样品中的氧化剂残留以生成斜线，其表明每分钟相对荧光单位(RFU)(氧化剂残留)的降低。

GPx抗氧化剂功效试验的结果和观察：在激活后，氧化剂随时间的降低接近线性，如在下图中看到的(垂直刻度以RFU为单位)。在11分钟区间内建立了明确的斜线(图27)。由氧化剂随时间的降低测定抗氧化活性(图28)。

与PBS对照相比，在注入了ASEA的样品中看到了抗氧化活性的显著增加(第二幅图)。

然而，在5μL、10μL和20μL注入之间未看到浓度依赖性。这表明GPx抗氧化活性可能在比由5μL注入代表的浓度低的浓度处饱和。将在之后描述这种考虑。

下表总结了前面的图中示出的数据。

原始数据反映了与ASEA注入有关的大于10倍的抗氧化活性的增加。将实验不确定性考虑在内，98％地肯定小浓度(<1％)的本发明组合物的血清注入将抗氧化效率增加了至少800％。应该进行其他研究来证实这一增加，并探索这些低水平血清浓度的浓度依赖。

用于确定超氧化物歧化酶(SOD)的抗氧化功效的实验方法：用10％磷酸盐缓冲盐溶液(PBS；介质对照)、5％或10％本发明组合物处理人HMVEC-L细胞24小时，在此时间准备细胞裂解物，以使用商购试剂盒(SOD活性，cat#900-157)、按照制造商(Assay Designs,Ann Arbor,MI)说明书测定SOD活性。并行地测定细胞培养基的SOD活性。还尝试了使用<1％的较小浓度的本发明组合物和小鼠表皮细胞的有限试验。

确定本发明组合物高血清浓度的SOD活性的首次尝试方法的结果：稀释的裂解物显示与本发明组合物的处理相关的酶活性轻微增长。在5-10％的本发明组合物(最终浓度，v/v)的初始范围内，酶活性的变化是微小的。数据表示使用本发明组合物处理的原代HMVEC-L细胞测定SOD活性的首次尝试。可能的是，与5-10％的本发明组合物相关的SOD活性的缺乏可能与高剂量的非特异性抑制有关。主要的担心在于我们对原代人HMVEC-L细胞模型的了解不多，不能确定对于研究由本发明的组合物诱导的抗氧化防御调节，这些细胞是否是最佳的。例如，已知破坏本发明组合物中某些氧化还原信号复合物的抗坏血酸被增补至培养基中，可能对培养基配方进行一些改良(例如在由经验限定的短时间段内不使用抗坏血酸)能够产生更加优化的用于检测由本发明组合物调节的抗氧化防御的条件。作为增加敏感性和优化模型的方法，将这些细胞血清饥饿的初始尝试是不成功的，在24小时内导致广泛的细胞死亡，表明细胞依赖于在细胞培养基中补充以维持细胞活力的生长因子。如果我们将本发明组合物初始浓度(5-10％)解释为高的(基于培养基酶活性和细胞增殖的抑制)，然后则可能的是，此处观察的与细胞裂解物相关的酶活性的轻微增长可能没有准确地反映在较低浓度下可能发生的抗氧化防御调节。使用具有明确的和稳固的NRF2-调节的抗氧化防御反应的体外模型***能够帮助解决这些不确定性中的一些。回顾过去，我们已经观察到较低浓度的本发明组合物(1％)诱导了NRF2转录因子的核移位。此外，在初始筛选中选择24小时时间点作为用于体外研究的一般性时间点，所述体外研究能够捕获转录调节；然而，这一时间点不是最佳的。

在低的本发明组合物浓度(<1％)下SOD酶活性的进一步研究的结果：在另一研究中发现，NRF2核移位(数据和结果在以下部分)在本发明组合物的低剂量下(低于1％)发生，并在暴露后约30-120分钟处引起SOD抗氧化活性的峰值。因此，当在30-120分钟时间点测定由于暴露于低浓度的本发明组合物造成的SOD抗氧化活性时，在90-120分钟的时间点处，在小鼠表皮(JB6)细胞和血清饥饿型HMVEC-L细胞两者中均看到了与GPx酶活性相似的结果。在短的120分钟期间，SOD酶活性峰值估计增加了500％，可信度为95％。

用于确定NRF2在HMVEC-L细胞中核移位的实验方法和蛋白印迹证实：按照制造商说明将HMVEC-L细胞解冻和保持。在细胞周期随机(randomly cycling)的培养物中，培养基含有表皮生长因子、氢化可的松、GA-1000、胎牛血清、血管活性内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素生长因子-1和抗坏血酸。没有给予血清饥饿型培养物抗坏血酸。

使处于正常随机细胞周期和血清饥饿两者中的HMVEC-L细胞培养物暴露于血清培养基中的高浓度(5-20％)和低浓度(1％)ASEA，并与仅暴露于作为阴性对照的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)的培养物一起进行分析。在30、60、90和120分钟的时间点，将来自各个培养物的细胞等分试样置于荧光显微镜下，所述细胞通过被设计用于标记NRF2转录因子的荧光染料以及辅助电脑软件找出核的DAPI荧光核染色剂染色。通过对若干细胞的荧光分析，使用电脑自动化成像技术确定NRF2核积聚的相对程度。NRF2调节多种II期抗氧化防御酶的转录和提高其他抗氧化防御酶如谷胱甘肽转移酶可能通过接触ASEA来表达的可能性。因此，如可视地在显微图像看到的NRF2向核内的积聚是细胞内抗氧化剂表达增加的指标。

NRF2的HMVEC-L核积聚的结果：人表皮细胞的初筛表明，在用高浓度的本发明组合物处理后，细胞的亚群显示增加的核染色分布情况(有焦点的)。核的位置由下图中的DAPI染色指示。焦点在受到本发明组合物刺激的细胞中显得更亮，表明核内的NRF2转录因子的水平较高。使用H₂O₂作为阳性对照。基于核染色分布情况，难以定量这一效果(图29)。

对于所指出的暴露于低浓度本发明组合物的细胞培养物的典型细胞图像示于下面。在暴露于低浓度本发明组合物的血清饥饿型细胞培养物中，可以清楚地看到NRF2向核内的积聚。自动化分析揭示，在30和60分钟时间点，相对于阴性对照，血清饥饿型细胞中NRF2核积聚的时间依赖性强(图30)。

核染色分布情况与保持在最佳生长培养基中的细胞(细胞周期随机组)具有质的不同。在这些细胞中，在30、60和120分钟时间点，存在弱的定性的由暴露于本发明组合物诱导的NRF2核积聚，但是该效果没有如在血清饥饿型培养物中一样显著。然而，血清饥饿引起了显著的细胞死亡，使数据的解释变得复杂。趋势看起来弱，需要通过蛋白印迹证实。

NRF2核积聚的蛋白印迹验证的实验方法：用1％的本发明组合物处理HMVEC-L，在30、60和120分通过离心分离从核外胞液中分离核提取物，并进行NRF2的蛋白印迹分析。在蛋白印迹实验中，使用抗-磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸抗体的组合检查核外部分的磷酸化蛋白。实质上，所有的细胞过程由转译后修饰所调节，并且蛋白磷酸化是普遍机制。蛋白磷酸化中可观察到的变化能够导致对由本发明的组合物扰乱的细胞过程的机理性理解，和提供限定的端点以更好地对本发明组合物在体外对细胞功能的剂量依赖性调节进行限定，以及提供可以用于提供体外-体内关联的潜在候选分子标记物。过氧化氢(H₂O₂)被纳入作为氧化剂损伤的阳性对照。

NRF2核积聚的蛋白印迹验证的结果：在从用1％ASEA处理的HMVEC-L细胞制备的核提取物中，NRF2水平以时间依赖性方式增加。H₂O₂(30分钟)没有增加核NRF2水平。相反，当在核外部分中(通过差速离心与核分离)检验蛋白磷酸化时，我们通过蛋白印迹分析观察到单个条带，这可能是因为在细胞增殖期间核外部分的稀释(其他磷酸化蛋白明显存在但低于这些条件下的检测极限)或使用的抗-磷酸化-抗体的特异性不足以检测宽范围的磷酸化蛋白。然而，我们确实观察到在H₂O₂处理后检测到的蛋白磷酸化的显著增加，表明这一磷酸化事件对蛋白激酶的氧化还原调节或活化/氧化性损伤之后蛋白磷酸酶活性的去活化是高度敏感的。用1％的本发明组合物处理细胞以时间依赖性方式降低了与这一蛋白关联的磷酸化水平(图31)。

看到了核外部分中磷酸化-蛋白调节的减少和核部分中强的时间依赖性NRF2积聚，表明了抗氧化剂表达的清楚的时间依赖性上调。

这时，值得提出在与暴露于低浓度的本发明组合物联合时，清楚地检测到了NRF2活性，没有正常的在先NF-kB活性。这表明在没有正常的在先I期毒性反应的情况下，已经刺激了II期抗氧化防御机制。这一行为没有先例或极其罕见。从数据看起来，本发明的组合物能够在绝不引起在先的低水平I期毒性反应的情况下刺激抗氧化剂表达。

确定小鼠(JB6)细胞和HMVEC-L细胞的增殖和暴露于ASEA时LDH活性的实验方法：用5-20％ASEA将HMVEC-L细胞处理72小时，使用库尔特计数器确定细胞数。对照(0浓度组)用20％的PBS处理。在0-20％浓度的本发明组合物/血清浓度下，还测定血清LDH水平作为细胞培养物活力的指标。记得较低的血清LDH水平表示较少的细胞膜失效。对于小鼠(JB6)表皮细胞进行相似的实验。

小鼠和HMVEC-L细胞的增殖和LDH活性的结果(图41、42)：初始体外筛选表明血清中高浓度的本发明组合物可能在5-20％的浓度范围内抑制细胞增殖(对于小鼠表皮细胞[JB6]和原代人肺微脉管内皮细胞[HMVEC-L])。在这一浓度范围，我们还观察到LDH酶活性的直接抑制。数据在一定程度上是矛盾的，因为降低的细胞计数表明细胞死亡，而较低的血清LDH水平表明较高的细胞膜完整性。在试验的最高浓度(20％v/v)，细胞增殖被抑制了约20％。

减少的增殖背后的机制无法被推断出来，且不能与对生长因子反应性的干扰或其他可能的解释如损伤细胞的提高的程序死亡(凋亡反应)相关联。值得注意的是，用于体外酶增强研究的高血清浓度的本发明组合物不是最佳的，初筛可能低估了或甚至遗漏了通过本发明组合物的抗氧化防御(SOD)调节，因此表明为了这种目的应该采用低浓度(<1％)的本发明组合物和/或短的暴露时间。

完成了进一步的研究，所述研究调查在暴露于本发明组合物后受胁迫细胞的行为；应激源来自多种化学和环境应激物。这些调查为可能的机制提供线索。

确定暴露于恶质素应激物和高浓度的本发明组合物的各种混合物的HMVEC-L的细胞活力的实验方法：向具有正常随机细胞周期(pS)的HMVEC-L培养物和一般对恶质素较不敏感的接近融合的培养物(A2)注入浓度渐增的恶质素应激物(0-5ng/mL)。这些培养物已经用10％的PBS对照或5-10％浓度的本发明组合物进行了24小时预处理。对细胞活力使用了两种指示物。获得血清LDH水平作为膜完整性的指示，使用中性红染料作为溶酶体完整性的指示。记得当细胞膜失效时，LDH释放到血清培养基中。较低量的LDH表示较高的细胞活力。可行细胞功能所必须的溶酶体完整性通过中性红染料染色的吸收来测定。较高量的中性红吸收表示较高的细胞活力。

暴露于高浓度的本发明组合物和逐渐增加的恶质素应激物的量的HMVEC-L活力结果(图34)：在急性(高达5nm/mL)恶质素损伤后，融合(A2)和正常(pS)HMVEC-L培养物两者显示出与暴露于本发明的组合物相关的、高达30％的LDH水平的提高(相比于PBS对照)。LDH数据表明在暴露于本发明的组合物后，受恶质素胁迫的HMVEC-L细胞不太可能由于细胞膜失效而死亡。

经中性红吸收测定的HMVEC-L细胞中溶酶体完整性的行为显示了对细胞培养物阶段的行为依赖。如预期的，PBS对照中的融合(A2)细胞比PBS对照正常随机期(pS)培养物中的细胞对恶质素损伤的敏感性低很多；这在5ng/mL恶质素数据中得以证明：与pS培养物中的70％相比，A2细胞中的溶酶体水平仅降低了50％。在相似的恶质素损伤下，正常(pS)培养物暴露于本发明的组合物对于溶酶体完整性鲜有影响，但是融合(A2)细胞培养物暴露于ASEA使它们对恶质素损伤更为敏感，退回到与由正常更敏感(pS)细胞显示的行为相似的行为。

这是出现的首个证据，其表明异常(恶质素不敏感)HMVEC-L细胞暴露于本发明的组合物能够使它们更加敏感。数据表明受恶质素胁迫的融合(A2)细胞在暴露于本发明的组合物时更易于死亡，这些异常细胞在暴露于ASEA时，在恶质素存在下显示接近正常的行为。这一行为开始时是意外的，因为实验的假设是本发明的组合物将帮助细胞保护它们自己对抗毒性损伤。结果表明，看起来暴露于本发明的组合物仅帮助正常健康细胞保护它们自己对抗氧化损伤，但好像没有帮助细胞保护它们自己对抗恶质素。暴露于本发明的组合物可能甚至帮助促进受胁迫细胞的死亡，所述受胁迫细胞接近它们正常生命周期的尽头。顺便指出，恶质素在组织中的正常作用是促进受损细胞的死亡和替代。

确定针对恶质素损伤，A2和pS期HMVEC-L细胞的本发明组合物浓度依赖性反应的实验方法：使HMVEC-L细胞培养物暴露于血清浓度(2.5％、5％、10％、15％和20％的v/v)的PBS对照或本发明组合物24小时，所述HMVEC-L细胞培养物在以下两个阶段制备：在融合生命周期末(confluent end-of-life-cycle)A2期(对恶质素损伤通常不敏感的阶段)，和在正常随机周期pS期。然后，通过监测在胞内胞液和在周围生长培养基两者中的LDH活性来确定恶质素反应性。记得生长培养基中增加的LDH活性表示细胞膜破裂和死亡(LDH释放)，胞内LDH活性的降低表示失去细胞完整性。因此，对恶质素响应的细胞培养物将发生培养基LDH活性的增加和胞内LDH活性的降低。

将未接触的细胞培养物对照中的LDH活性与所考虑到的本发明组合物各个浓度下用5ng/mL恶质素损伤的细胞培养物的LDH活性作比较。然后，将各个被损伤的培养物和对照的LDH活性对本发明组合物的浓度依赖性作图。

HMVEC-L细胞对恶质素损伤的浓度依赖性反应结果(图35)：相对于PBS对照，正常pS细胞的恶质素反应比预期的小得多。在PBS对照培养物中仅看到轻微的细胞膜完整性降低，胞内LDH活性仍然相同。暴露于本发明的组合物的情况下，正常pS细胞培养物本身遭受轻微的整体细胞完整性降低和细胞死亡增加。应指出，因为对照pS细胞对恶质素的大的期望反应不明显，所以在该研究中使用的pS细胞培养物可能接近融合或非响应性状态。

然而，当向暴露于各种本发明组合物浓度的pS细胞培养物添加恶质素损伤时有清楚的反应，培养物展示了胞内LDH功能和完整性的清楚的损失。然而，未看到伴随的细胞死亡指示。这好像表明通过暴露于本发明的组合物，使“正常pS”细胞对恶质素接收更为敏感，但未完全达到细胞死亡点。

A2细胞培养物反应非常清楚。暴露于本发明的组合物，即使在没有恶质素的情况下，看起来也引起胞内LDH完整性的损失，但是其没有影响细胞死亡。然而，当将恶质素损伤施加至这种A2培养物时，暴露于本发明组合物清楚地放大了恶质素接收，快速地降低了细胞功能，而且存在浓度依赖性细胞死亡的清楚指示。存在强有力的证据：暴露于本发明组合物增加了A2细胞培养物中的恶质素反应性。

结果暗示暴露于本发明组合物显著增加A2和边缘型(borderline)pSHMVEC-L细胞培养物中的恶质素反应性。可能感兴趣的是，仅暴露于本发明的组合物可能在A2型细胞中降低细胞LDH活性的完整性；记得即使在大的浓度下，在细胞周期随机的细胞中检测到零毒性反应，因此预期在正常细胞中不会有毒性造成的影响。看起来，暴露于本发明组合物可能倾向于加速非响应性融合细胞的去除。当存在恶质素时明显是这样。这些结果可能还涉及如下观察：暴露于本发明组合物好像在高浓度减少了细胞增殖。对低浓度暴露没有尝试到这种趋势。注意难以排出如下可能性：高浓度效果可能仅仅是由于本发明组合物对生长培养基干扰造成的假象。

确定暴露于5-10％的本发明组合物对受到放射物和血清饥饿胁迫的细胞的影响的实验方法：小鼠(JB6)细胞培养物被暴露于高水平放射物(X射线)，在单独的研究中，培养物经受生长因子的血清饥饿24小时。然后，使细胞暴露于5-10％的ASEA暴露量，作为确定暴露于本发明组合物对这种受胁迫细胞的影响的手段。在暴露于本发明的组合物前后进行细胞计数。

暴露于5-10％的本发明组合物对受到放射物和血清饥饿胁迫的小鼠细胞的影响的结果：对这些结果没有汇编定量分析。然而，定性分析揭露了一些可能有趣的结果。对于放射损伤的培养物，在暴露于本发明的组合物后，多于一半的培养物观察到了即时的细胞死亡。此后，未看到进一步的细胞死亡。在显微镜下观察时，剩余的活细胞看起来正常并且健康。看起来，暴露于本发明组合物在损伤较为严重的细胞中帮助加速细胞死亡，并允许健康或可修复细胞的生存。

对于血清饥饿型细胞培养物得出了相似的观察，不同的是细胞死亡不是一样严重的，总计小于大致20％的损失。存活的细胞显得非常坚强和有活力。然而，在之后的实验中，在未暴露于本发明组合物的血清饥饿型培养物中看到了相似的损失。

氧化还原信号分子的特定混合物的生物活性的更好理解可以从涉及如下的体外研究中加以确定：使本发明的组合物与有活力的活HMVEC-L人细胞和小鼠表皮JB6细胞直接接触。寻求确定5个特定的目标：

1)体外毒性(基于NF-kB、P-Jun移位)

2)对抗氧化功效的影响(GPx和SOD的)

3)对抗氧化转录活性的影响(NRF2)

4)对细胞增殖和活力的影响(细胞计数)

5)对受胁迫细胞的影响(恶质素、放射物、饥饿)

对于在正常随机期(HMVEC-L或JB6)的任何健康细胞培养物，在暴露于高血清浓度的本发明组合物(高达20％)后，未观察到毒性反应。使用了两种方法确定毒性反应：NF-kB和P-Jun在核内的移位和积聚。已知这两种方法对低水平的毒性是敏感的，如由阳性对照所验证的。观察到了完全没有毒性指示和/或炎症细胞因子。

在暴露于低浓度的本发明组合物24小时后，看到HMVEC-L细胞中GPx抗氧化功效增加了800％(未看到浓度依赖性)。再次，在暴露于低浓度的本发明组合物(<1％)后，看到了SOD抗氧化功效在30至90分钟之间高达500％的短暂增加。在两种情况下，本发明组合物的低浓度与可能来自口服剂量的血液浓度是具有可比性的，尽管没有数据来证实。如果对非常低浓度下的浓度依赖性进行仔细研究，是可能看到这样的浓度依赖性的。

相比，暴露于高浓度的本发明组合物，仅引起GPx抗氧化功效的小的相对增加，其不是浓度依赖的。对于高浓度的本发明组合物或在长期(24小时)暴露后，未看到SOD功效的增加。在随后的研究中，将使用这一信息确定研究浓度依赖性的最佳浓度和时间点(<0.1％和0-120分钟)。

检查氧化还原反应性转录因子的核位移的研究表明，本发明的组合物在较低浓度(小于1％)下，在HMVEC-L细胞中引起20-30％的NRF2转录因子的核位移增加，其看起来是短暂的(30-60分钟)。我们还观察到本发明的组合物在核外蛋白的磷酸化中引起了平行的降低，所述核外蛋白的磷酸化状态在响应过氧化氢处理时明显增加，与抗氧化剂作用模式相一致。

作为增加敏感性的方法，对HMVEC-L细胞的血清饥饿处理显著地增加了由本发明组合物(1％)诱导的核NFF2信号。然而，血清饥饿引起了显著的细胞死亡，使数据的解释复杂化。

暴露于高浓度(5-20％v/v)的本发明组合物抑制HMVEC-L和JB6细胞类型两者的细胞增殖(由细胞计数确定)。HMVEC-L抑制明显是浓度依赖的，在20％ASEA浓度有20％的细胞计数损失。与降低的增殖相反，本发明组合物的浓度为5-20％的情况下，血清LDH水平显著降低，表明细胞膜完整性增加。结果好像表明在高浓度下，细胞增殖降低，而细胞膜活力增加。从数据无法推断出这种行为背后的机制，但是将在之后的部分看到另外的证据。

当受到恶质素胁迫时，HMVEC-L细胞的反应取决于细胞阶段。正常的细胞周期随机的HMVEC-L细胞(pS)当受到恶质素胁迫时显示典型的行为：显示细胞活力的降低，伴随细胞死亡。如预期的，融合生命周期末(A2)和边缘型HMVEC-L细胞对恶质素损伤较不敏感，显示显著性较低的细胞活力降低和更少的细胞死亡。

暴露于本发明的组合物在正常的细胞周期随机的pS细胞对恶质素的反应中未造成显著的变化(显示相似的细胞活力损失和细胞死亡)。然而，暴露于了本发明组合物的A2细胞培养物显示了对恶质素的增加的敏感性，恢复了与正常细胞的行为相似的行为。当检验到浓度依赖性时，更加支持了这一行为。显示较小恶质素反应的边缘型A2细胞和通常对恶质素损伤不敏感的A2细胞在暴露于本发明的组合物时，在活力降低和细胞死亡增加两者上，对恶质素显示强的多的反应。

看起来暴露于本发明组合物造成A2细胞死亡的速率增加，提高了恶质素在这种生命周期末细胞中的天然接收。但是不期望暴露于本发明组合物对正常细胞的活力上造成任何改变。

通常分泌恶质素以在损伤或功能失调的组织中激起细胞死亡，允许周围的健康细胞***和填充空位。因此，在功能失调的细胞中增加对恶质素的敏感性可能帮助加速这种过程且不总是有害的。

在受到放射物和血清饥饿胁迫的、并被暴露给本发明组合物的组织中也看到了细胞死亡的加速。

已经看到，向有活力的HMVEC-L和JB6细胞培养物注入使用本发明组合物的氧化还原信号分子的特定均衡混合物引起不同的生物活性。没有观察到毒性或炎症细胞因子表达的指示，但是有抗氧化和保护性酶的表达的增加(如由增加的核NRF2所证明的)，且两种主要抗氧化剂GPx和SOD的功效极大地增加。这一行为表明注入本发明组合物可能倾向于诱发和提高氧化防御机制，而不在这种细胞中诱发毒性或炎症反应。这种作用是未有先例的或极其罕见。通常，低水平毒性诱发轻微的氧化应激和炎症反应，其转而诱发氧化防御和细胞修复机制。通过注入超低浓度的本发明组合物，来确定这一效果的浓度依赖性会是有趣的。

也应该探究在功能失调的、受胁迫的或损伤的细胞的培养物中，注入本发明组合物对细胞死亡的诱导。天然治愈过程涉及修复或替代机制，由此当可能时，修复了轻微损伤的细胞，或者如果它们不能被修复，则进行凋亡、程序化死亡，然后通过健康相邻细胞的有丝***将它们替代。较为明显的是，仅注入本发明组合物本身对被暴露的细胞不造成直接的应激，然而其可能倾向于增加特定细胞因子“死亡结构域”信使(恶质素)的效率，所述信使被设计为在功能失调或损伤的细胞中诱发细胞死亡。NRF2的核位移可以视为II期氧化防御反应的部分，所述II期氧化防御反应包括抗氧化剂、DNA修复分子的表达和其他已知的修复机制。

凋亡是替代机制的部分，其中细胞已经受不可修复的损伤且必须被去除和替代。抗氧化防御和凋亡机制两者对于正常组织修复和再生都是重要的。氧化还原通信在几个通路中涉及，例如能够确定细胞是否经受凋亡的p53基因表达。慢性氧化应激倾向于促成细胞死亡。当然，恶质素和其他死亡结构域信使的存在促成细胞死亡。注入本发明组合物提高了恶质素接收，这一观察可能表明注入本发明组合物也可能作用于在信号转导过程中增强信使的接收，所述信号转导过程决定是否激活防御、修复或替代机制。

实施例9

2型糖尿病的治疗

通过静脉内注射组合产品，对诊断有2型糖尿病的42岁男性进行治疗，所述组合产品包含本发明的PPAR抑制剂(类二十烷酸)和氧化还原信号剂(RXN)的组合物。与在治疗前相比，在约1周后，患者保持更为正常的血糖状况，具有最小的血糖波动。

实施例10

1型糖尿病的治疗

通过静脉内注射组合产品，对诊断有1型糖尿病的22岁女性进行治疗，所述组合产品包含本发明的PPAR抑制剂(噻唑烷二酮)和氧化还原信号剂(RXN)的组合物。与在治疗前相比，在约1周后，患者保持更为正常的血糖状况，具有最小的血糖波动。

实施例11

癌症的治疗

通过静脉内注射组合产品，对诊断有癌症的31岁女性进行治疗，所述组合产品包含本发明的PPAR抑制剂(纤维酸类药物)和氧化还原信号剂(RXN)的组合物。在约1月后，患者显示出其症状的消退。

实施例12

2型糖尿病的治疗

通过口服施用组合产品，对诊断有2型糖尿病的72岁男性进行治疗，所述组合产品包含本发明的PPAR抑制剂(类二十烷酸)和氧化还原信号剂(RXN)的组合物。与在治疗前相比，在约1周后，患者保持更为正常的血糖状况，具有最小的血糖波动。

实施例13

1型糖尿病的治疗

通过口服施用组合治疗物，对诊断有1型糖尿病的61岁女性进行治疗，所述组合治疗物包含本发明的PPAR抑制剂(噻唑烷二酮)和氧化还原信号剂(RXN)的组合物。与在治疗前相比，在约1周后，患者保持更为正常的血糖状况，具有最小的血糖波动。

实施例14

癌症的治疗

通过口服施用组合产品，对诊断有口腔癌的31岁女性进行治疗，所述组合产品包含本发明的PPAR抑制剂(纤维酸类药物)和氧化还原信号剂(RXN)的组合物。在约1月后，患者显示出其症状的消退。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表达成分的量、诸如分子量的性质、反应条件等的所有数值，要理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非作出相反说明，否则在说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可根据由本发明寻求获得的期望性质而变化。最起码地，并且并非试图应用等同原则来限制权利要求书的范围，每个数值参数应至少根据所报道有效数字的位数并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值尽可能精确地进行报道。然而，任何数值固有地含有一定的误差，其必然地从在它们相应试验测定中发现的标准偏差产生。

除非本文中另有说明或者由上下文明确否定，在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)，不带明确数字的指征要被解释为覆盖了单数和复数。本文中数值范围的陈述仅仅旨在用作简化法，其各个地涉及落入所述范围内的各独立值。除非本文中另有说明，否则将各个单个的值并入说明书中，就好像其各个地在本文中进行了陈述。除非本文中另有说明或者除非由上下文明确否定，否则本文中使用的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实施例或示例性文字(如“例如”)的使用，仅仅旨在更好地阐明本发明，且不会对本发明所要求保护的范围造成限制。不应将说明书中的任何文字解释为指示任何没有要求保护的对本发明的实施起到关键作用的元素。

对本文中公开的本发明的可选元素的分组或实施方式不应解释为限制。各个组员可以以单独地方式，或以与本文中发现的所述组的其他成员或其他元素任意组合的方式被提到或要求保护。可预见的是，出于便利性和/或专利性，组的一个或多个成员可以被包括到组中或从组中删除。当任何这样的包括或删除发生时，说明书被视为是包含了修改的组，由此满足在权利要求书中使用的所有马库什组的书写说明。

本文中描述了本发明的特定实施方式，包括发明人所知的实施本发明的最佳方式。当然，在阅读前述说明书后，这些描述的实施方式的变体将对本领域的普通技术人员变得显而易见。发明人预期技术人员合理地使用这样的变体，发明人打算使本发明不仅仅是按照本文中具体描述的进行实施。因此，本发明包含了由适用的法律允许的权利要求书中陈述的主题内容的所有修改和等价体。此外，除非本文中另有说明或者除非由上下文明确否定，否则上述元素以其各种可能变体的任何组合被本发明所涵盖。

最后，应理解本文中公开的本发明的实施方式是对本发明原理的说明。可能采用的其他修饰在本发明的范围内。因此，通过举例而非限制，可以按照本文中的教导利用本发明的可选配置方式。因此，本发明不限于精确示出的和描述的实施例。

Claims (23)

1.一种组合物，其包含至少一种氧化还原信号剂(RXN)和PPAR激动剂。

2.权利要求1的组合物，其中所述PPAR激动剂包含游离脂肪酸(FFA)。

3.权利要求1的组合物，其中所述PPAR激动剂包含类二十烷酸。

4.权利要求1的组合物，其中所述PPAR激动剂包含噻唑烷二酮。

5.权利要求1的组合物，其中所述PPAR激动剂包含纤维酸类药物。

6.权利要求1的组合物，其中所述PPAR激动剂包含双重激动剂。

7.权利要求6的组合物，其中所述双重激动剂包含阿格列扎。

8.权利要求6的组合物，其中所述双重激动剂包含莫格他唑。

9.权利要求6的组合物，其中所述双重激动剂包含替格列扎。

10.包含RXN和PPAR激动剂的组合物在治疗PPAR介导的疾病中的应用。

11.权利要求10的应用，其中所述的PPAR介导的疾病是糖尿病。

12.权利要求11的应用，其中所述糖尿病是1型糖尿病。

13.权利要求11的应用，其中所述糖尿病是2型糖尿病。

14.权利要求10的应用，其中所述PPAR介导的疾病是肥胖症。

15.权利要气10的应用，其中所述PPAR介导的疾病是癌症。

16.包含至少一种RXN的组合物在治疗癌症中的应用，其包含激活PPAR通路的第一疗法和至少一种其他药剂，其中所述至少一种其他药剂不激活PPAR通路。

17.权利要求16的应用，其中所述至少一种其他药剂包含放射物。

18.权利要求16的应用，其中所述至少一种其他药剂包含化学治疗剂。

19.包含至少一种RXN的组合物在治疗癌症中的应用，其包含动员游离脂肪酸(FFA)的第一疗法和至少一种其他药剂，其中所述至少一种其他药剂不动员FFA。

20.权利要求19的应用，其中所述至少一种其他药剂包含放射物。

21.一种治疗氧化应激相关病症的方法，其包括：

向经历氧化应激的患者施用组合物，所述组合物包含选自如下的至少一种物种：O₂，H₂，Cl₂，OCl^-，HOCl，NaOCl，HClO₂，ClO₂，HClO₃，HClO₄，H₂O₂，Na⁺，Cl^-，H⁺，H^-，OH^-，O₃，O₄ ^*-，¹O，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O₃，O₂ ^*-，HO₂ ^*，NaCl，HCl，NaOH，水分子簇或其组合；和

治疗氧化应激相关病症。

22.一种治疗线粒体DNA减少症的方法，其包括：

向经历线粒体DNA减少症的患者施用组合物，所述组合物包含选自如下的至少一种物种：O₂，H₂，Cl₂，OCl^-，HOCl，NaOCl，HClO₂，ClO₂，HClO₃，HClO₄，H₂O₂，Na⁺，Cl^-，H⁺，H^-，OH^-，O₃，O₄ ^*-，¹O，OH^*-，HOCl-O₂ ^*-，HOCl-O₃，O₂ ^*-，HO₂ ^*，NaCl，HCl，NaOH，水分子簇或其组合；

增加线粒体DNA密度；和

治疗线粒体DNA减少症。

23.权利要求22的方法，其中线粒体DNA减少症是肌肉减少症、糖尿病、阿尔兹海默症、帕金森病、神经***疾病、老化引起的肌肉损失、肥胖症或心血管障碍。