CN104922669A - 用于通过调整bmp-6来调节铁稳态的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过调整BMP-6活性来调节铁稳态。提供了使用BMP-6和BMP-6蛋白特异性试剂诸如抗体用于改变人血清铁水平的方法。此类抗体可用于预防和治疗血色素沉着病和炎症性贫血的药物组合物中。

Description

用于通过调整BMP-6来调节铁稳态的方法和组合物
本申请是申请日为2009年11月13日、发明名称为“用于通过调整BMP-6来调节铁稳态的方法和组合物”的中国专利申请号200980145449.4的分案申请。
相关申请
本申请要求于2008年11月13日申请的美国临时专利申请61/114,290以及于2008年12月29日申请的61/141,155的优先权，这些申请的全部内容通过引用结合入本文中。
技术领域
本发明总体上涉及铁稳态失调的治疗、预防和改善。本发明更具体地涉及使用BMP-6和BMP-6蛋白特异性试剂诸如抗体用于改变人的血清铁、血清血红蛋白和/或血细胞比容水平的方法。此类抗体可用于预防和治疗血色素沉着病和炎症性贫血的药物组合物中。
背景技术
铁是几乎每一种生物体生长和生存所需要的必需元素。红细胞(RBC)含有血红蛋白(Hb)，其是一种红色的富铁蛋白，将氧从肺携带至身体的所有肌肉和器官，在此其反应而为身体提供其正常活动的能量需求。当红细胞的数目或它们含有的血红蛋白的量降低至正常水平以下时，身体接收到的氧和产生的能量小于其正常发挥功能所需要的氧和能量。这种状况通常称为贫血。在婴儿和儿童中贫血的常见病因是铁缺乏。在美国中多达20％的儿童和发展中国家中多达80％的儿童在18岁前的某个时候将发生贫血。Martin,P.L.等，The Anemias,Principles and Practices of Pediatrics(贫血，儿科学原理和实践),1657(第二版，Lippincott 1994)。
在哺乳动物中，铁平衡主要在十二指肠吸收膳食铁的水平上进行调节。在人类中，遗传性血色素沉着病(HH)是由过多吸收膳食铁引起血浆和多个器官(包括特别地胰腺、肝脏和皮肤)中的铁过载并且由于铁沉积引起这些器官和组织损害而导致的一种常见的常染色体隐性遗传性疾病。
青少年血色素沉着病是由编码主要的铁调节激素铁调素(hepcidin)(HAMP)和血幼素(hemojuvelin)(HFE2)的基因中的突变导致的一种铁过载失调(Roetto,A.,等.2003.Nut.Genet.33:21-22；Papanikolaou,G.,等2004.Nut.Genet.36:77-82.)。已经显示血幼素是一种骨形态发生蛋白(BMP)共同受体，且血幼素-介导的BMP信号调节铁调素表达和铁代谢(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Babitt,J.L.,等2007.J ClinInvest.117:1933-1939.)。然而，铁调素的体内内源性BMP调节物还未知。
BMP是TGF-β超家族的成员，该超家族由超过40种配体组成(Shi,Y.和Massague,J.2003.Cell 113:685-700.)。这些生长因子介导多种多样的生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡和图形化(patterning)。BMP/TGF-β超家族配体通过与I型和II型丝氨酸-苏氨酸激酶受体的复合物结合而启动细胞内信号级联放大。活化的受体复合物磷酸化细胞内Smad蛋白，然后后者转位至核中以调整基因表达。
近年来，已经发现了BMP信号传导途径在主要的铁调节激素铁调素的调节中的作用(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Babitt,J.L.,H等J Clin Invest.117:1933-1939；Wang,R.H.,等2005.Cell Metab.2:399-409.)。被肝脏分泌后，铁调素通过减少铁运输因子(exporter)膜铁转运蛋白(ferroportin)的细胞表面表达来抑制肠的铁吸收和巨噬细胞的铁释放(Nemeth,E.,等2004.Science.306:2090-2093)。通过施用铁使铁调素上调(Pigeon,C,等2001.J.Biol.Chem.276:7811-7819,Nicolas,G.,等2002.J.Clin.Invest.110:1037-1044；Nemeth,E.,等2004.J.Clin.Invest.113:1271-1276.)，而贫血抑制铁调素(Nicolas,G.,等2002.J.Clin.Invest.110:1037-1044)。铁调素缺乏和不受抑制的膜铁转运蛋白活性是遗传性铁过载失调遗传性血色素沉着病的常见发病机制，其原因是HAMP本身、HFE2、HFE、TFR2(编码2型转铁蛋白受体)的突变以及罕见的SCLAOA1(编码膜铁转运蛋白)突变(Pietrangelo,A.2006.Biochim Biophys Acta1763:700-710)。铁调素还被炎性细胞因子诸如IL-6上调，并且铁调素过量与炎症性贫血的发病机制有关(Pigeon,C,等2001.J.Biol.Chem.276:7811-7819,Nicolas,G.,等2002.J.Clin.Invest.110:1037-1044；Nemeth,E.,等2004.J.Clin.Invest.113:1271-1276；Nemeth,E.,等2003.Blood.101:2461-2463；Weiss,G.和Goodnough,L.T.2005.N.Engl.J.Med.352:1011-1023；Andrews NC.2008.Blood.112219-30.)。
通过肝脏特异性条件性敲除共用的BMP/TGF-β细胞内介质Smad4(Wang,R.H.,等2005.Cell Metab.2:399-409.),或通过HFE2(其编码BMP共同受体血幼素)的突变(Papanikolaou,G.,等2004.Nut.Genet.36:77-82；Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Huang,F.W.,等J.Clin.Invest.115:2187-2191；Niederkofler,V.,Salie,R.,Arber,S.2005.J ClinInvest.115:2180-6)，减少肝脏BMP信号传导与不适宜的低铁调素表达和铁过载相关。BMP信号在体外转录水平上正向地增加铁调素表达(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Babitt,J.L.,H等J Clin Invest.117:1933-1939；Wang,R.H.,等2005.Cell Metab.2:399-409；Truksa,J.,等2006.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103:10289-10293；Verga Falzacappa,M.V.,等2008.J Mol Med.86:531-40.)。在体内施用铁增加肝脏BMP信号传导(Yu,P.B.,等2008.Nut Chem Biol.4:33-41)。在体内施用BMP增加铁调素表达并减少血清铁(Babitt,J.L.,H等J Clin Invest.117:1933-1939)。相反，在体内施用与人免疫球蛋白Fc的Fc部分融合的可溶性血幼素(HJV.Fc)(其选择性地抑制BMP-2、BMP-4、BMP-5和BMP-6,但不抑制BMP-7或BMP-9)，在体内抑制铁调素表达，增加膜铁转运蛋白表达，动员网状内皮细胞铁储备，和增加血清铁(Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-1939.)。施用非选择性小分子BMP抑制剂Dorsomorphin也在体内抑制铁调素表达和增加血清铁(Yu,P.B.,等2008.Nut Chem Biol.4:33-41)。
血幼素(也称为RGMc)是蛋白质的排斥导向分子(Repulsive GuidanceMolecule)家族的成员，包括RGMa和DRAGON(RGMb)，它们共享50-60％氨基酸同一性(Samad,T.A.,等2004.J.Neurosci.24:2027-2036.)。象血幼素一样，RGMa(Babitt,J.L.,等2005.J.Biol.Chem.280:29820-29827)和DRAGON(Samad,T.A.,等2005.J.Biol.Chem.280:14122-14129)也起BMP信号传导途径的共同受体的作用。
存在着对用于调节铁调素表达和铁代谢的低成本的有效方法的需求。
发明内容
本发明提供了调整BMP-6的新方法，所述方法用于治疗由于铁调素缺乏引起的铁过载失调或由于铁调素过量引起的炎症性贫血。
本发明涉及BMP信号传导途径的调节物，所述调节物在由于铁调素缺乏引起的铁过载失调或由于铁调素过量引起的炎症性贫血的治疗中发挥作用。
本发明涉及一种用于调节受试者中铁稳态的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述有效量以足以改变所述受试者中的铁稳态、血红蛋白水平和/或血细胞比容水平的水平来调整BMP-6信号传导。在一些方面，所述组合物的施用减少BMP-6信号传导。在一些方面，所述组合物包含能够结合BMP-6的试剂。在一些实施方案中，所述试剂在残基TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO:3)处结合BMP-6。在一些方面，所述试剂是抗体。在一些方面，所述抗体竞争性地抑制BMP-6与可溶性人血幼素蛋白的结合。在某些具体实施方案中，可溶性人血幼素蛋白为HJV.Fc或HJV.His。在其他方面，所述抗体通过在与可溶性人血幼素蛋白结合BMP-6的结构域无关的结构域处结合BMP-6来抑制BMP-6活性。在某些具体的实施方案中，可溶性人血幼素蛋白为HJV.Fc或HJV.His。
本发明涉及其中化合物的施用减少血幼素-介导的对铁调素表达的诱导的方法。在一些方面，所述试剂以足以抑制血幼素和BMP-6之间的相互作用的量施用。在一些方面，所述试剂优选地对人BMP-6的表达或活性的抑制超过对BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或BMP-9的抑制。在一些方面，所述试剂结合BMP-6的亲和性比结合BMP-7的亲和性大至少5倍。
本发明提供了施用本发明的组合物的方法，其导致受试者中的血清铁水平增加或血清转铁蛋白饱和度增加。本发明还提供了施用本发明的组合物的方法，其导致血红蛋白或血细胞比容水平增加。
本发明提供了施用本发明的组合物的方法，其导致BMP-6信号传导的增加。在一些方面，所述组合物包含能够增加血清BMP-6水平的试剂。在一些方面，所述试剂增加BMP-6表达水平。
本发明提供了治疗受试者的方法，所述受试者具有遗传性血色素沉着病的一种或多种症状，所述症状选自：增加的血清铁水平、增加的血清转铁蛋白饱和度、减少的铁调素表达、减少的脾铁储备、增加的膜铁转运蛋白表达和组织铁过载。
本发明提供了施用该组合物的方法，其减小BMP-6的表达水平。在一些方面，所述组合物包含能够抑制BMP-6基因表达的试剂，其中所述试剂为反义DNA、siRNA、干扰RNA、微小RNA(miRNA)或反义RNA，且其中BMP-6表达的减少足以增加所述受试者中的血清铁水平或血清转铁蛋白饱和度。
本发明提供了一种分离的单克隆抗体，其特异性地结合人BMP-6，其中所述人BMP-6由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成，并且所述结合抑制BMP-6的铁调节活性，并且提供了包含所述分离的单克隆抗体的组合物，所述组合物包含足以增加受试者中的血清铁水平或血清转铁蛋白饱和度的量的抗体。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体竞争性地抑制可溶性人血幼素蛋白与BMP-6的结合，从而将与BMP-6的结合减少25％-100％。在某些具体实施方案中，可溶性人血幼素蛋白为HJV.Fc或HJV.His。在更具体的实施方案中，分离的单克隆抗体竞争性地抑制BMP-6与抗BMP-6抗体的结合达25％-100％，所述抗BMP-6抗体选自R&DSystems的针对人BMP-6的单克隆抗体,MAB507(克隆74219)；R&Dsystems的针对BMP-6的多克隆抗体,AF507(lot CXL04A)；和Santa Cruz多克隆抗体。在其他实施方案中，分离的单克隆抗体在与结合HJV.Fc的结构域不同的结构域处结合BMP-6。
本发明还提供了抗BMP-6抗体诸如人抗体，由嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、单链Fv片段、F(ab')2片段、Fd、结构域抗体(dAb)、双抗体、maxibody和纳米抗体。在一些方面，分离的单克隆抗体结合人BMP-6和鼠BMP-6两者。
本发明还提供了分离的核酸分子和表达载体，所述核酸分子包含编码抗BMP-6抗体的核苷酸序列，所述表达载体包含与调控序列可操作地连接的所述核酸分子。
本发明还提供了一种使用包含要求保护的载体或核酸分子的宿主细胞产生抗体的方法，所述方法包括在合适的条件下培养要求保护的宿主细胞使得表达所述核酸以产生所述抗体。
本发明还提供了通过施用治疗有效量的(a)足够以足以改变铁稳态、血红蛋白水平和/或血细胞比容水平的水平调整BMP-6信号传导的药物组合物和(b)红细胞生成刺激物来治疗受试者的方法，所述受试者具有遗传性血色素沉着病的一种或多种症状。示例性的红细胞生成刺激物包括***、***激动剂变体、以及结合和活化***受体的肽或抗体。红细胞生成刺激物包括，但不限于，α依伯汀(epoetinalfa)，β依泊汀(epoetin beta)，δ依泊汀(epoetin delta),ω依泊汀(epoetinomega),ι依泊汀(epoetin iota),ζ依泊汀(epoetin zeta)和它们的类似物，模拟肽(mimetic peptide)、模拟抗体(mimetic antibody)和HIF抑制剂(参见美国专利公布号2005/0020487,其全部公开内容通过引用合并)。具体地，***包括，但不限于，如下列专利或专利申请中公开的***分子或其变体或类似物：美国专利号4,703,008；5,441,868；5,547,933；5,618,698；5,621,080；5,756,349；5,955,422和5,856,298；和WO 91/05867；WO 95/05465；WO 00/24893和WO 01/81405，每一篇专利或专利申请的全部内容通过引用合并入本文中。在某些示例性实施方案中，红细胞生成刺激物选自由人***和α达贝泊汀(darbepoetin)组成的组。
本发明还提供了一种诊断与BMP-6相关的失调的方法，所述方法包括：(a)使来自怀疑患有所述失调的人的生物样品与特异性结合BMP-6的抗体在适合于所述抗体与人BMP-6结合的条件下接触；和(b)定量与所述抗体结合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的在所述样品中BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在与BMP-6相关的失调。
本发明还提供了一种监测其中施用BMP-6拮抗剂的治疗的方法，所述方法包括：(a)使来自已经施用了BMP-6拮抗剂的人的生物样品与特异性结合BMP-6的抗体在适合于所述抗体与人BMP-6结合的条件下接触；和(b)定量与所述抗体结合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的血清BMP-6水平的量的变化指示BMP-6拮抗剂的功效。在一些方面，所述拮抗剂是抗体或小分子。
本发明还提供了一种治疗具有升高的铁水平或患有贫血的哺乳动物的方法，所述方法通过施用调整BMP-6信号传导的药物组合物进行。
本发明还提供了一种用于治疗与铁稳态相关的失调的试剂盒，所述试剂盒包含制品，所述制品包括包含抗BMP-6抗体的小瓶或预充式注射器。
本发明还提供了一种筛选与人BMP-6结合的化合物的方法，该方法包括使候选化合物与包含生物活性BMP-6的组合物接触，和检测所述候选化合物和所述组合物中的人BMP-6之间的复合物，其中检测到复合物指示所述候选化合物与人BMP-6的结合，并且进一步其中所述候选化合物将BMP-6与HJV.Fc的结合抑制至少25％。
本发明还提供了一种生成针对人BMP-6的抗体的方法，该方法包括将免疫球蛋白生成细胞与包含SEQ ID NO:1的BMP-6序列或其变体的多肽接触，并分离由所述细胞产生的免疫球蛋白。
本发明还提供了一种用于治疗缺铁性失调的组合物，其包含特异性结合BMP-6和HJV.Fc的抗体。在一个实施方案中，抗体竞争性地抑制可溶性人血幼素缀合物(HJV.Fc)蛋白与BMP-6的结合。在另一个实施方案中，抗体竞争性地抑制可溶性人血幼素缀合物(HJV.Fc)蛋白与BMP-6的结合。在另一个实施方案中，抗体结合BMP-6上的与结合HJV.Fc的结构域不同的结构域。
在另一个具体实施方案中，抗体的量足以将HJV.Fc与BMP-6的结合减小25％-100％。优选地，抗体选自由RandD***单克隆抗体、RandD***多克隆抗体和Santa Cruz多克隆抗体组成的组。在另一个具体实施方案中，抗体是人抗体。在其他实施方案中，所述抗体选自由嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、单链Fv片段、F(ab')2片段、Fd、结构域抗体(dAb)、双抗体(diabody)、maxibody和纳米抗体组成的组。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码特异性结合BMP-6的抗体的核苷酸序列。本发明还提供了一种包含与调控序列可操作地连接的此核酸分子的表达载体。本发明还提供了包含权利要求31所述的载体或权利要求30所述的核酸分子的宿主细胞。
本发明还提供了一种使用权利要求32所述的宿主细胞产生抗体的方法，其包括在合适的条件下培养该权利要求所述的宿主细胞使得所述核酸表达以产生所述抗体。
本发明还提供了一种诊断与BMP-6相关的失调的方法，所述方法包括：使来自怀疑患有所述失调的人的生物样品与特异性结合BMP-6的抗体在适合于所述抗体与人BMP-6结合的条件下接触；和定量与所述抗体结合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的所述样品中BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在与BMP-6相关的失调。
本发明还提供了一种监测其中施用BMP-6拮抗剂的治疗的方法，所述方法包括：使来自已经施用了BMP-6拮抗剂的人的生物样品与特异性结合BMP-6的抗体在适合于所述抗体与人BMP-6结合的条件下接触；和定量与所述抗体结合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的血清BMP-6水平的量的变化指示BMP-6拮抗剂的功效。在具体的实施方案中，所述拮抗剂是抗体。在另一个具体实施方案中，所述拮抗剂是小分子。
本发明还提供了特异性结合人BMP-6的抗体，其中在一定浓度的包含TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的肽的存在下，所述抗体被竞争不与人BMP-6特异性结合。
本发明还提供了一种特异性结合TQSQDVARVSSASDY(SEQ IDNO:3)的任何5个连续氨基酸的抗体。在具体的实施方案中，所述抗体特异性地结合TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO:3)的6、7、8、9或10个连续氨基酸。
在下面的发明详述和附图以及实施方案中，本发明和本发明的其他目的、特征和优势将变得进一步显而易见。
附图说明
图1A-1D显示DRAGON.Fc选择性地抑制BMP对铁调素表达的诱导的证据；
图2A-2G显示在小鼠中施用DRAGON.Fc不影响铁调素表达或铁代谢的证据；
图3A-3D显示特异性中和BMP-6的抗体在体内抑制肝脏铁调素表达和增加血清铁和转铁蛋白饱和度的证据；
图4A-4H显示Bmp6敲除小鼠显示减少的肝脏铁调素表达、增加的脾膜铁转运蛋白表达、增加的血清铁和转铁蛋白饱和度、增加的肝脏铁含量和减少的脾铁含量的证据；
图5A-5C显示在小鼠中施用BMP-6增加铁调素mRNA表达和减少血清铁的证据；
图6是对BMP-6的Western印迹；
图7是对HJV的Western印迹；
图8是对hBMP-6的Western印迹。
具体实施方式
本发明人已经出人意料地发现BMP-6是铁调素表达和铁代谢的重要调节物。与可溶性血幼素(HJV.Fc)相比，同源的DRAGON.Fc融合蛋白在体外是对BMP-2和BMP-4产生的铁调素启动子活化的较为有效的抑制剂，但是为BMP-6的不太有效的抑制剂。在体内，DRAGON.Fc对铁调素表达和铁代谢没有作用，而HJV.Fc或特异性中和BMP-6的抗体抑制铁调素表达并增加血清铁。此外，Bmp6敲除小鼠具有类似遗传性血色素沉着病的表型，其具有减少的铁调素表达、增加的膜铁转运蛋白表达、增加的血清铁和转铁蛋白饱和度、减少的脾铁储备和组织铁过载。本发明人显示在小鼠中施用BMP-6增加铁调素表达并减少血清铁。总之，这些数据支持了BMP-6作为体内铁调素表达和铁代谢的内源性调节物的关键作用。
特异性中和BMP-6的抗体的施用导致增加的血清铁和转铁蛋白饱和度，表明对铁调素表达和铁代谢的作用。通过siRNA或中和抗体抑制内源性BMP-6抑制血幼素-介导的对铁调素表达的诱导。BMP-6可能是血幼素的配体。
此外，发现添加外源性BMP-6增加铁调素表达并导致血清铁和血清转铁蛋白饱和度的剂量依赖性减少。
pro-BMP-6的氨基酸序列显示在下表1中：
BMP-6由表1中显示的pro-BMP-6序列的氨基酸297-428构成。BMP-6显示在下表2中。
除非另外定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域中普通技术人员所普遍理解的含义。此外，除非另外上下文需要，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数术语。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关采用的命名法和技术是本领域中所公知和普遍使用的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔，脂质转染)。根据生产厂商的说明书或如本领域中普遍实现的那样或如本文所述进行酶反应和纯化技术。除非相反地具体指明，本发明的实施将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，为了说明的目的下面描述它们中的许多。参见，例如，Sambrook,等Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)(第二版，1989)；Maniatis等Molecular Cloning:A LaboratoryManual(分子克隆：实验室指南)(1982)；DNA Cloning:A PracticalApproach(DNA克隆：实践方法),vol.I&II(D.Glover,编辑)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(N.Gait,编辑，1984)；NucleicAcid Hybridization(核酸杂交)(B.Hames&S.Higgins,编辑,1985)；Transcription and Translation(转录和翻译)(B.Hames&S.Higgins,编辑,1984)；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.Freshney,编辑,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实践指导)(1984)。
与本文所述的分析化学、合成有机化学，以及医学和药物化学相关采用的命名法，和实验室步骤和技术是本领域中所公知和普遍使用的那些。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制备，配制和递送，以及患者的治疗。
下面的定义可用于理解本发明：
如本文使用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体),和抗体片段,只要它们显示所需的生物活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”互换使用。
“分离的抗体”是已经与其天然环境的组分分开和/或从其天然环境的组分中回收的一种抗体。其天然环境的污染组分是将干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体：(1)如通过Lowry法测定，被纯化至大于95重量％抗体，和最优选大于99重量％；(2)通过利用自旋杯序列分析仪(spinning cup sequenator)被纯化至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染通过SDS-PAGE被纯化至均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不存在抗体的天然环境的至少一个组分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
基本的四链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元以及称为J链的附加多肽组成，并且因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成多价集合体，所述集合体包含2-5个基本的4链单元以及J链。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接，取决于H链的同种型。每个H和L链还具有规则地间隔开的链内二硫桥。每个H链在N末端处具有可变结构域(VH)，紧接着对于每个α和γ链是三个恒定结构域(CH)，对于μ和ε同种型是4个CH结构域。每个L链在N末端处具有可变结构域(VL)，紧接着在其另一端是恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，且CL与重链的第一个恒定结构域(CH1)对齐。认为特定氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类型抗体的结构和性质，参见，例如，Basic and Clinical Immunology(基础和临床免疫学),第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,71页，和第6章。
基于其恒定结构域(CL)的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可以被指定为两种显然不同的类型中的一种，称为kappa(κ)和lambda(λ)。取决于其重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被指定为不同的类型或同种型。存在5种类型的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被指定为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的重链。基于CH序列和功能的相对微小差异，γ和α类进一步分成为亚类，例如，人表达下列的亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”是指在抗体之间V结构域的某些区段的序列广泛地不同的事实。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸范围内并不均匀地分布。事实上，V区由相对不变的称为构架区(FR)的15-30个氨基酸的序列段(stretch)构成，所述序列段被称为“超变区”的具有高可变性的较短区域分隔，每个超变区的长度为9-12个氨基酸。天然重链和轻链的每个可变结构域包含4个FR，主要采取β-折叠构型，它们通过三个超变区连接，形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的超变区通过FR相互靠近地结合在一起，并且和来自其他链的超变区一起，对抗体的抗原结合位点的形成作出贡献(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列),第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但显示多种效应器功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
当在本文中使用时术语“超变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中大约残基24-34(L1),50-56(L2)和89-97(L3)周围，和VH中大约1-35(H1),50-65(H2)和95-102(H3)周围；Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列),第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“超变环”的那些残基(例如，VL中残基26-32(L1),50-52(L2)和91-96(L3)，和VH中26-32(H1),53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体的群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体除了可以微量存在的可能天然存在的突变以外是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们可以合成而不会被其他抗体污染。修饰语“单克隆”不应被解释为需要通过任何特定的方法来制备抗体。例如，可用于本发明中的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等,Nature,256:495(1975)所述的杂交瘤方法学来制备，或可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol,222:581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
本文中的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的剩余部分与来源于另一种物种或属于另一种抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示所需的生物活性(参见美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本发明提供了来源于人抗体的可变结构域抗原结合序列。因此，本文中主要感兴趣的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(例如，CDR)且含有来源于非人抗体的一个或多个序列(例如，FR或C区序列)的抗体。另外，本文主要感兴趣的嵌合抗体包括包含一种抗体类型或亚类的人可变结构域抗原结合序列和来源于另一抗体类型或亚类的另一序列(例如，FR或C区序列)的那些。本文感兴趣的嵌合抗体还包括含有与本文所述的那些相关的或来自不同物种(诸如非人灵长类动物(例如，旧大陆猴(Old World Monkey),猿等))的可变结构域抗原结合序列的那些。嵌合抗体还包括灵长类动物源化抗体和人源化抗体。
此外，嵌合抗体可以包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。可以作出这些修饰作用以进一步改善抗体性能。对于更多的细节，参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
"人源化抗体"通常被认为是人抗体，其具有一个或多个引入其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化传统地根据Winter及其同事(Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988))的方法进行，该方法通过用输入超变区序列代替人抗体的相应序列来进行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列替代。
“人抗体”是仅含有存在于由人天然产生的抗体中的序列的抗体。然而，如本文所使用，人抗体可以包含不存在于天然存在的人抗体中的残基或修饰作用，包括本文所述的那些修饰作用和变体序列。典型地作出这些以进一步改善或增强抗体性能。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH 2和CH 3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应器功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab,Fab',F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
短语抗体的“功能性片段或类似物”是具有在性质上与全长抗体一样的生物活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能性片段或类似物可以以下列的方式结合IgE免疫球蛋白，从而防止或基本上减少此类分子具有结合高亲和性受体FcεRI的能力的能力。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段,和残留的“Fc”片段，该名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)，和一条重链的第一个恒定结构域(CH 1)组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即，其具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab')2片段，其大概对应于两个二硫键连接的Fab片段，其具有二价抗原结合活性，并且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的区别在于其在CH1结构域的羧基末端处具有额外的几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。在本文中Fab'-SH是Fab'的名称，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离的硫醇基。F(ab')2抗体片段初始地作为成对的Fab'片段产生，在它们之间具有铰链半胱氨酸。还已知有抗体片段的其他化学偶合。
“Fc”片段包含通过二硫键结合在一起的两个H链的羧基末端。抗体的效应器功能由Fc区中的序列决定，该区也是被在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别和抗原结合位点。此片段由一个重链和一个轻链可变区结构域以紧密、非共价方式缔合的二聚体组成。由这两种结构域的折叠产生6个超变环(各3个环来自H链和L链)，它们贡献用于抗原结合的氨基酸残基并且赋予抗体以抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含对抗原特异的三个CDR)就具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和性比整个结合位点低。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，其是包含连接至单条多肽链中的VH和VL抗体结构域。优选地，sFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，使sFv能够形成用于结合抗原的所需结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学),第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,269-315页(1994)；Borrebaeck 1995,见下。
术语“双抗体(diabody)”是指通过如下方法制备的小抗体片段，即用VH和VL结构域之间的短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(参见前面的段落)，使得实现V结构域的链间而非链内配对，产生二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交换(crossover)”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更充分地描述在，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
如本文所使用，“内化”的抗体是在与哺乳动物细胞上的抗原(例如，细胞表面多肽或受体)结合后被细胞摄取(即，进入细胞)的抗体。内化的抗体当然包括抗体片段、人抗体或嵌合抗体、和抗体缀合物。对于某些治疗应用，考虑体内内化。被内化的抗体分子的数目将足以或适于杀死细胞或抑制细胞生长，尤其是感染的细胞。取决于抗体或抗体缀合物的效力，在一些情况下，单个抗体分子被摄入至细胞中足以杀死所述抗体结合的靶细胞。例如，某些毒素具有高度有效的杀死作用，使得与抗体缀合的毒素的一个分子的内化就足以杀死感染的细胞。
如本文所使用，如果抗体以可检测到的水平(优选地具有大于或等于约104M-1、或大于或等于约105M-1、大于或等于约106M-1、大于或等于约107M-1、或大于或等于108M-1的亲合常数Ka)与抗原反应，则该抗体被称为对该抗原是“免疫特异的”，“特异的”或“特异性结合”该抗原。抗体对其关联抗原的亲和性也普遍地表示为离解常数KD，并且在某些实施方案中，如果抗BMP-6抗体以小于或等于10-4M，小于或等于约10-5M，小于或等于约10-6M，小于或等于10-7M，或者小于或等于10-8M的KD结合BMP-6，则抗BMP-6抗体特异性地结合BMP-6。抗体的亲和性可以容易地使用常规技术，例如由Scatchard等(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949))所述的那些技术来确定。
抗体与抗原、细胞或其组织的结合特性通常可以使用免疫检测方法来确定和评估，所述方法包括，例如，基于免疫荧光的测定，诸如免疫组织化学(IHC)和/或荧光激活细胞分选(FACS)。
具有指定抗体的“生物特性”的抗体是拥有该抗体的使其区别于其他抗体的一种或多种生物特性的抗体。例如，在某些实施方案中，具有指定抗体的生物特性的抗体将结合与该指定抗体结合的相同表位和/或具有与该指定抗体共用的效应器功能。
术语“拮抗剂”抗体以广义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制、或中和其特异性结合的表位、多肽或细胞的生物活性的抗体。用于鉴定拮抗剂抗体的方法可以包括使被候选拮抗剂抗体特异性结合的多肽或细胞与候选拮抗剂抗体接触，并测量通常与所述多肽或细胞相关的一种或多种生物活性的可检测变化。
抗体“效应器功能”是指归因于抗体的Fc区(Fc区的天然序列或Fc区的氨基酸序列变体)并且随着抗体同种型而变化的那些生物活性。抗体效应器功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。在某些实施方案中，FcR是人FcR的天然序列。而且，优选的FcR是结合IgG抗体(一种γ受体)的一种受体，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FCγRII受体包括FcγRIIA(一种“激活受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列，它们的区别主要在其细胞质结构域中。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见综述M.in Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcRs的综述参见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。其他FcR，包括未来将被鉴定的那些，包括在本文的术语“FcR”内。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责母体IgGs至胎儿的转移(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。
“人效应器细胞”是表达一个或多个FcR并且执行效应器功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应器细胞可以从天然来源中分离，例如，从血液中分离。
用于治疗感染目的的“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人、家畜和耕畜，和动物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选地，哺乳动物是人。
“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”指治疗性治疗和预防的(prophylactic)或预防性(preventative)措施两者；其中目标是防止或延缓(减轻)靶向的病理状况或失调。需要治疗的那些包括已经患有所述失调的那些以及易于患有所述失调的那些或要防止所述失调的那些。如果在根据本发明的方法接受治疗量的抗体后患者显示可观察到的和/或可测量到的下列一种或多种情况的减少或不存在下列一种或多种情况，则受试者或哺乳动物的感染被成功地“治疗”：感染细胞数目的减少或不存在感染细胞；被感染的全部细胞的百分比减少；和/或与具体感染相关的一种或多种症状减轻至一定程度；发病率和死亡率减小；和生活质量问题改善。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可容易地通过医生熟悉的常规程序来测量。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或失调的抗体或药物的量。参见前面对“治疗”的定义。
“长期(chronic)”施用是指与短期(acute)方式相反，一种或多种药剂以连续的方式施用，从而将初始的治疗作用(活性)维持延长的时间段。“间断”施用是在不中断的条件下不连续地完成的治疗，但其本质不是周期性的。
与一种或多种另外的治疗剂“联合”施用包括以任何顺序同时的(共同的)和连续的施用。在本发明的一个实施方案中，使用联合疗法，该疗法使用足以用于以足以改变铁稳态、血红蛋白水平和/或血细胞比容水平的水平调整BMP-6信号传导的药物组合物，以及红细胞生成刺激物。此组合可用于治疗具有遗传性血色素沉着病的一种或多种症状的受试者。在多个实施方案中，红细胞生成刺激物可以用来改善贫血患者的治疗。特别地，对红细胞生成刺激物疗法(诸如***或其类似物(α依泊汀、β依泊汀、α达贝泊汀))低反应、包括无反应的患者将受益于与铁调素活性拮抗剂或铁调素表达抑制剂的共同治疗。
如本文所使用，“红细胞生成刺激物”是指直接地或间接地导致***受体激活的化学化合物，例如，通过结合该受体和导致该受体二聚化，或通过刺激内源性***表达。红细胞生成刺激物包括***和其结合并激活***受体的变体、类似物或衍生物；结合***受体并激活该受体的抗体；或结合并激活***受体的肽；或结合并激活***受体的小的有机化学化合物，其分子量任选地小于约1000道尔顿。红细胞生成刺激物包括，但不限于，α依伯汀、β依泊汀、δ依泊汀、ω依泊汀、ι依泊汀、ζ依泊汀和它们的类似物、聚乙二醇化***、氨甲酰化***、模拟肽(包括EMP1/hematide)、模拟抗体和HIF抑制剂(参见美国专利公开号2005/0020487,其全部公开内容通过引用合并)。示例性的红细胞生成刺激物包括***、达贝泊汀、***激动剂变体，和结合并激活***受体的肽或抗体(并且包括美国专利申请公开号2003/0215444和2006/0040858中报道的化合物，其全部公开内容通过引用合并入本文中)以及如下列专利或专利申请中公开的***分子或其变体或类似物，这些专利或专利申请的全部公开内容通过引用合并入本文中：美国专利号4,703,008；5,441,868；5,547,933；5,618,698；5,621,080；5,756,349；5,767,078；5,773,569；5,955,422；5,830,851；5,856,298；5,986,047；6,030,086；6,310,078；6,391,633；6,583,272；6,586,398；6,900,292；6,750,369；7,030,226；7,084,245；7,217,689；PCT公开号WO 91/05867；WO95/05465；WO 99/66054；WO 00/24893；WO 01/81405；WO 00/61637；WO01/36489；WO 02/014356；WO 02/19963；WO 02/20034；WO 02/49673；WO02/085940；WO 03/029291；WO 2003/055526；WO 2003/084477；WO2003/094858；WO 2004/002417；WO 2004/002424；WO 2004/009627；WO2004/024761；WO 2004/033651；WO 2004/035603；WO 2004/043382；WO2004/101600；WO 2004/101606；WO 2004/101611；WO 2004/106373；WO2004/018667；WO 2005/001025；WO 2005/001136；WO 2005/021579；WO2005/025606；WO 2005/032460；WO 2005/051327；WO 2005/063808；WO2005/063809；WO 2005/070451；WO 2005/081687；WO 2005/084711；WO2005/103076；WO 2005/100403；WO 2005/092369；WO 2006/50959；WO2006/02646；WO 2006/29094；以及美国公开号US 2002/0155998；US2003/0077753；US 2003/0082749；US 2003/0143202；US 2004/0009902；US2004/0071694；US 2004/0091961；US 2004/0143857；US 2004/0157293；US2004/0175379；US 2004/0175824；US 2004/0229318；US 2004/0248815；US2004/0266690；US 2005/0019914；US 2005/0026834；US 2005/0096461；US2005/0107297；US 2005/0107591；US 2005/0124045；US 2005/0124564；US2005/0137329；US 2005/0142642；US 2005/0143292；US 2005/0153879；US2005/0158822；US 2005/0158832；US 2005/0170457；US 2005/0181359；US2005/0181482；US 2005/0192211；US 2005/0202538；US 2005/0227289；US2005/0244409；US 2006/0088906；US 2006/0111279。
重组人***的示例性序列、制备、纯化和用途描述在大量的专利公开书中，包括但不限于Lin的美国专利号4,703,008和Lai等的美国专利号4,667,016,它们每一篇的全部公开内容通过引用合并入本文中。达贝泊汀是一种高糖基化***类似物，其在rHuEPO的氨基酸序列中具有5处变化。提供两个附加的碳水化合物链。更具体地，α达贝泊汀在氨基酸残基30和88处包含两个附加的N-连接的碳水化合物链。达贝泊汀和其他***类似物的示例性序列、制备、纯化和用途描述在大量的专利公开书中，包括Strickland等,91/05867,Elliott等,WO95/05465,Egrie等,WO 00/24893,和Egrie等WO 01/81405,它们每一篇的全部公开内容通过引用合并入本文中。天然存在的多肽或多肽类似物的衍生物包括已经被化学修饰，例如从而连接水溶性聚合物(例如，聚乙二醇化)、放射性核素或其他诊断或靶向或治疗用结构部分的那些。
术语“红细胞生成活性”是指如在体内测定，例如小鼠脱水性红细胞增多测定(exhypoxic polycythemic mouse assay)中所证明的刺激红细胞生成的活性。参见，例如，Cotes和Bangham,Nature 191:1065(1961)。
如本文所使用的“载体”包括药学可接受的载体、赋形剂、或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒性的。生理学可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理学可接受的载体的实例包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂诸如TWEENTM聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文使用的“标记”是指可检测到的化合物或组合物，其与抗体直接或间接缀合以便生成“标记的”抗体。该标记可以本身是可检测到的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者，在酶标记的情况下，可以催化底物化合物或组合物的化学改变，该改变是可检测到的。
如本文所使用的术语“带标签的表位”是指一种嵌合多肽，其包含与“标签多肽”融合的多肽。所述标签多肽具有足够的残基从而提供这样的表位，针对所述表位可以制备抗体，然而其又足够短使得其不会干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽也优选是相当独特的使得该抗体基本上不会与其他表位交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，并且通常具有约8-50个氨基酸残基(优选地，约10-20个氨基酸残基)。
“小分子”在本文中被定义为具有低于约500道尔顿的分子量。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，其指单链或双链RNA、DNA、PNA或混合的聚合物。多核苷酸可以包括基因组序列、基因组外和质粒序列，和较小的改造的基因区段，它们表达或可以适于表达多肽。
“分离的核酸”是基本上与其他基因组DNA序列以及天然地伴随天然序列的蛋白质或复合物诸如核糖体和聚合酶分开的核酸。该术语包涵已经从其天然存在的环境中移除的核酸序列，并且包括重组的或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源***生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括所述核酸的分离形式。当然，这指初步分离的核酸并且不排除后来被人工地添加至所述分离的核酸中的基因或序列。
术语“多肽”以其常规含义使用，即，用作氨基酸的序列。多肽不限于具体长度的产物。肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义内，并且这些术语在本文中可以互换使用，除非另外具体指明。此术语也不指或不包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的其他修饰作用，无论天然存在的和非天然存在的。多肽可以是整个蛋白，或其子序列。在本发明的背景下感兴趣的特定多肽是包含CDRs并且能够结合抗原或甲型流感感染的细胞的氨基酸子序列。
“分离的多肽”是已经被鉴定和与其天然环境的组分分开和/或从其天然环境的组分中回收的多肽。在优选的实施方案中，分离的多肽将(1)如通过Lowry法测定，被纯化至大于95重量％多肽，和最优选大于99重量％；(2)通过利用自旋杯序列分析仪被纯化至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染通过SDS-PAGE被纯化至均质。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为不存在该多肽的天然环境的至少一个组分。然而，通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。
“天然序列”多核苷酸是具有与来源于自然界的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是具有与来源于自然界(例如，来自任何物种)的多肽(例如，抗体)相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列多核苷酸和多肽可以从自然界中分离，或可以通过重组或合成手段制备。
作为本文中使用的术语，多核苷酸“变体”是典型地与本文具体公开的多核苷酸的不同之处在于一个或多个置换、缺失、添加和/或***的多核苷酸。这种变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰本发明的多核苷酸序列中的一个或多个并且如本文所述和/或使用本领域中公知的多种技术评价所编码的多肽的一种或多种生物活性。
作为本文中使用的术语，多肽“变体”是典型地与本文具体公开的多肽的不同之处在于一个或多个置换、缺失、添加和/或***的多肽。这种变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰本发明的上述多肽序列中的一个或多个并且如本文所述和/或使用本领域中公知的多种技术评价多肽的一种或多种生物活性。
可以在本发明的多核苷酸和多肽的结构中作出修饰作用，并且仍然获得功能分子，所述功能分子编码具有所需特性的变体或衍生物多肽。当需要改变多肽的氨基酸序列以建立本发明的多肽的等效的、或甚至改进的变体或一部分时，本领域技术人员将典型地改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
例如，在其结合其他多肽(例如，抗原)或细胞的能力没有显著的损失的条件下，蛋白质结构中的某些氨基酸可以替代为其他的氨基酸。由于是蛋白质的结合能力和特性确定该蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白序列中并且当然可以在其基础的DNA编码序列中作出某些氨基酸序列置换，并且仍然获得了具有类似特性的蛋白质。因此考虑在其生物效用或活性没有明显的损失的条件下可以在公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中作出多种改变。
在许多情况下，多肽变体将含有一个或多个保守置换。“保守置换”是其中一个氨基酸被置换为具有类似特性的另一个氨基酸，使得肽化学领域中的技术人员能够预期基本上不会改变多肽的二级结构和亲水(hydropathic)性质。
本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数(hydropathicindex)或评分的其他氨基酸置换并且仍然产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍然获得生物功能等效的蛋白质。在作出这些改变时，优选其亲水指数在±2内的氨基酸的置换，特别优选在±1内的那些，并且甚至更优选在±0.5内的那些。在本领域中还能够理解，可以基于亲水性有效地作出类似氨基酸的置换。美国专利4,554,101描述，蛋白质的最大局部平均亲水性受其邻近氨基酸的亲水性支配，其与蛋白质的生物特性相关。
如上所概述，因此氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等等。考虑到多种前述特征的示例性置换作用是本领域技术人员所公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
氨基酸置换可以进一步基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质来作出。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含有不带电荷的极性头基——具有相似亲水性值——的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守改变的其他组氨基酸包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还可以，或备选地，包含非保守改变。在优选的实施方案中，变体多肽与天然序列的不同之处在于5个氨基酸或更少的置换、缺失或添加。变体还可以(或备选地)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸的缺失或添加来修饰。
多肽可以包含蛋白质的N末端处的信号(或前导)序列，其在共同被翻译时或在翻译后引导蛋白质的迁移。多肽还可以与接头或利于多肽的合成、纯化或鉴定的其他序列(例如，聚-His)或增强多肽与固相载体的结合的其他序列缀合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区缀合。
序列比较的最优比对可以使用生物信息学软件的Lasergene套件(Lasergene suite of bioinformatics software)(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中的Megalign程序使用缺省参数来进行。此程序体现了下列参考文献中所述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionarychange in proteins-Matrices for detecting distant relationships(蛋白进化变化模型－用于检测疏远关系的矩阵).于Dayhoff,M.O.(编辑)Atlas ofProtein Sequence and Structure(蛋白序列和结构图集),National BiomedicalResearch Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,345-358页；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes(比对和种系发生的统一方法)626-645页Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principlesand Practice of Numerical Taxonomy(数值分类学－数值分类学的原理和实践),Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730。
备选地，序列比较的最优比对可以通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同一性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件包,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI中的GAP,BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)，或通过目测来进行。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别记载在Altschul等(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。可以使用BLAST和BLAST 2.0，例如采用本文所述的参数，来确定本发明的多核苷酸和多肽的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件可以公共地通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)获得。
“同源性”是指在比对序列和引入空位(如果需要)来达到最大百分比同源性后，多核苷酸或多肽序列变体中与非变体序列相同的残基百分比。在具体的实施方案中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的多核苷酸或多肽同源性。
“载体”包括穿梭和表达载体。典型地，质粒构建体也包括分别用于细菌中质粒的复制和选择的复制起始点(例如，ColE1复制起始点)和选择标志物(例如，氨苄青霉素或四环素抗性)。“表达载体”是指含有用于在细菌或真核细胞中表达抗体(包括本发明的抗体片段)的必需控制序列或调控元件。合适的载体公开在下面。
本发明包括包含本发明的多肽的人BMP-6抗体，包括由对应于Bmp6的多核苷酸序列编码的那些多肽，和它们的片段和变体。在具体的实施方案中，本发明的抗体结合BMP-6蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了结合BMP-6内的表位的BMP-6抗体，所述表位仅存在于天然构象中，即，在细胞中表达。
本领域技术人员要理解的是，对本文的抗体和其制备方法和其使用方法的一般描述也适用于单个抗体多肽组成成分和抗体片段。
本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。然而，在优选的实施方案中，它们是单克隆的。在具体实施方案中，本发明的抗体是全人抗体。制备多克隆和单克隆抗体的方法是本领域中已知的，并且通常记载在，例如，美国专利号6,824,780中。典型地，本发明的抗体使用本领域中可获得的载体和方法通过重组方法制备，如下面进一步描述的那样。人抗体也可以通过体外激活的B细胞生成(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。
人抗体也可以在转基因动物(例如，小鼠)中制备，所述转基因动物能够在不产生内源性免疫球蛋白的条件下产生人抗体的所有组成成分(repertoire)。例如，已经记载，在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。人种系免疫球蛋白基因阵列转移至此种系突变小鼠中导致在抗原激发后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year inImmuno.,7:33(1993)；美国专利号5,545,806,5,569,825,5,591,669(均属于GenPharm)；美国专利号5,545,807；和WO 97/17852。这样的动物可以被遗传改造从而产生包含本发明的多肽的人抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体是嵌合抗体，其包含来源于人和非人来源两者的序列。在具体实施方案中，这些嵌合抗体是人源化的或PRIMATIZEDTM。在实践中，人源化抗体典型地是人抗体，其中一些超变区残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基代替。
在本发明的背景下，嵌合抗体还包括完全的人抗体，其中保留了人超变区或一个或多个CDR，但序列的一个或多个其他区域已经被来自非人动物的相应序列代替。
对要用于制备嵌合抗体的非人序列(包括轻链和重链两者)的选择是很重要的，使得当该抗体预期用于人治疗用途时减小抗原性和人抗非人抗体应答。进一步重要的是嵌合抗体保留了对抗原的高结合亲和力和其他有利的生物特性。为了达到此目标，根据优选的方法，通过使用亲代人和非人序列的三维模型对亲代序列和各种概念嵌合产物的分析方法制备嵌合抗体。三维免疫球蛋白模型可普遍地获得，并且对于本领域技术人员是熟知的。可获得说明和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的机能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从受体(recipient)和输入序列中选择和组合FR残基使得实现所需的抗体特性，诸如对一种或多种靶抗原的增加的亲和性。通常，超变区残基直接和最实质上地参与影响抗原结合。
如上所述，抗体(或免疫球蛋白)可以基于重链的恒定区中的氨基酸序列差异分成5种不同的类型。指定类型内的所有免疫球蛋白具有非常类似的重链恒定区。这些差异可以通过序列研究或更普遍地通过血清学手段(即，利用针对这些差异的抗体)来检测。本发明的抗体或其片段可以是任何类型，并且因此可以具有γ、μ、α、δ、或ε重链。γ链可以是γ1、γ2、γ3或γ4；且α链可以是α1或α2。
在优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是IgG。IgG被认为是最通用的免疫球蛋白，因为其能够执行免疫球蛋白分子的所有功能。IgG是血清中主要的Ig，并且是能穿越胎盘的唯一类型的Ig。IgG也固定补体，尽管IgG4亚类不能固定。巨噬细胞、单核细胞、PMN和一些淋巴细胞具有针对IgG的Fc区的Fc受体。并非所有亚类都同样良好地结合；IgG2和IgG4不结合Fc受体。与PMN、单核细胞和巨噬细胞上Fc受体的结合的结果是细胞现在可以更好地内化抗原。IgG是增强吞噬作用的一种调理素。IgG与其他类型细胞上Fc受体的结合导致其他功能的激活。本发明的抗体可以是任何IgG亚类。
在另一优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是IgE。IgE是最不常见的血清Ig，因为其与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的Fc受体非常紧密地结合，甚至在与抗原相互作用之前。作为其与嗜碱性粒细胞和肥大细胞结合的结果，IgE参与***反应。变应原与细胞上的IgE结合导致多种药理学介质的释放，引起***反应症状。IgE还在寄生虫蠕虫疾病中发挥作用。嗜酸性粒细胞具有针对IgE的Fc受体，并且嗜酸性粒细胞与IgE包被的蠕虫结合导致杀死寄生虫。IgE不固定补体。
在多种实施方案中，本发明的抗体及其片段包含可变轻链，所述可变轻链是κ或λ。λ链可以是任何亚型，包括，例如，λ1、λ2、λ3和λ4。
如上所述，本发明进一步提供了包含本发明的多肽的抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而非整个抗体是有利的。例如，较小尺寸的片段能够被快速清除，并且可以改善对某些组织，诸如实体瘤的可达性。抗体片段的实例包括：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
对于抗体片段的制备已经开发了许多技术。传统地，这些片段经完整抗体的蛋白水解消化来获得(参见。例如，Morimoto等,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)；和Brennan等,Science,229:81(1985))。然而，这些片段现在可以通过重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段所有均可以在大肠杆菌中表达并被分泌，由此能够轻易地制备大量的这些片段。Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收并被化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一方式，F(ab')2片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。具有增加的体内半衰期的包含补救受体(salvagereceptor)结合表位残基的Fab和F(ab')2片段记载在美国专利号5,869,046中。用于制备抗体片段的其他技术对专业技术人员来说是显而易见的。
在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。Fv和sFv是仅有的具有完整的结合位点(combining sites)的物种，它们不含有恒定区。因此，它们适合于在体内应用期间减少非特异性结合。sFv融合蛋白可以被构建为产生效应器蛋白在sFv的氨基或羧基末端处融合。参见Antibody Engineering(抗体工程)，编辑，Borrebaeck,见上。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如美国专利号5,641,870中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。本发明的抗体还包括单链抗体。
本文所述的抗体考虑进行一个或多个氨基酸序列修饰作用。例如，其可能期望用来改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适宜的核苷酸变化引入至编码抗体的多核苷酸或其链中，或通过肽合成来制备。这样的修饰作用包括，例如，抗体的氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或置换。可以作出缺失、***和置换的任何组合以获得最终的抗体，条件是最终的构建体拥有所需的特性。氨基酸改变也可以改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。对本发明的多肽的上述任一种变化和修饰均可以包含在本发明的抗体中。一种用于鉴定抗体中为优选的诱变位置的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells在Science,244:1081-1085(1989)中所述。
还提供了鉴定与BMP-6结合和/或交叉阻断可溶性HJV.Fc或本文所述的示例性抗体和/或抑制BMP-6活性的抗体或特异性结合剂的方法。这样的方法可以利用本文提供的高度纯化的生物活性的人BMP-6(通过化学合成或在细菌或非哺乳动物细胞中制备)的组合物。
抗体或特异性结合剂可以通过本领域中已知的方法筛选结合亲和力。例如，可以使用凝胶迁移测定(gel-shift assay)、Western印迹、放射性标记竞争测定、通过色谱法共分级(co-fractionation)、共沉淀、交联、ELISA等，它们记载在，例如，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术)(1999)John Wiley&Sons,NY中，其全部内容通过引用合并入本文中。
为了初步地筛选与靶抗原上的期望表位结合的抗体或特异性结合剂，可以进行常规的交叉阻断测定诸如Antibodies,A Laboratory Manual(抗体，实验室指南),Cold Spring Harbor Laboratory,编辑，Harlow和David Lane(1988)中所描述的测定。也可以使用常规的竞争结合测定，其中未知抗体通过其抑制靶标与本发明的靶标特异性抗体的结合的能力来表征。可以使用完整抗原，其片段诸如细胞外结构域，或线性表位。表位作图记载在Champe等,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)中。
在体外结合测定的一种变化形式中，本发明提供了一种方法，包括(a)使固定化的BMP-6与候选抗体或特异性结合剂接触，和(b)检测所述候选抗体或特异性结合剂与BMP-6的结合。在备选的实施方案中，候选抗体或特异性结合剂被固定并且检测BMP-6的结合。使用本领域中公知的任一种方法来实现固定化，包括与载体、珠子或色谱用树脂的共价结合，以及非共价的高亲和性相互作用诸如抗体结合，或利用链霉抗生物素蛋白/生物素结合，其中固定化的化合物包括生物素部分。结合的检测可以如下实现：(i)利用未被固定化的化合物上的放射性标记，(ii)利用非被固定化的化合物上的荧光标记，(iii)利用对未被固定化的化合物免疫特异的抗体，(iv)利用未被固定化的化合物上的标记，所述标记激发结合固定化化合物的荧光载体，以及本领域中熟知的和常规采用的其他技术。
在一些实施方案中，抑制或中和人BMP-6活性的抗体或特异性结合剂可以通过如下来鉴定：使BMP-6与抗体(或特异性结合剂)接触，比较在存在和缺少测试抗体(或特异性结合剂)的条件下的BMP-6活性，并测定抗体(或特异性结合剂)的存在是否降低BMP-6的活性。特定抗体，或特异性结合剂，或者抗体或特异性结合剂的组合的生物活性可以使用合适的动物模型在体内评价，所述动物模型包括本文所述的任一种。
在具体实施方案中，本发明的抗体是拮抗剂抗体，其部分或完全地阻断或抑制其特异性或优先结合的多肽或细胞的生物活性。在其他实施方案中，本发明的抗体是生长抑制性抗体，其部分或完全地阻断或抑制其结合的被感染细胞的生长。在另一个实施方案中，本发明的抗体诱导凋亡。还在另一个实施方案中，本发明的抗体诱导或促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性。
血幼素(也称为RGMc)是蛋白质的排斥导向分子(Repulsive GuidanceMolecule)家族的成员，包括RGMa和DRAGON(RGMb),它们共享50-60％氨基酸同一性(Samad,T.A.,等2004.J.Neurosci.24:2027-2036)。象血幼素一样，RGMa(Babitt,J.L.,等2005.J.Biol.Chem.280:29820-29827)和DRAGON(Samad,T.A.,等2005.J.Biol.Chem.280:14122-14129)也起BMP信号传导途径的共同受体的作用。
其他BMP抑制剂可以作为由于铁调素过量引起的贫血的潜在疗法起作用。测试纯化的与人免疫球蛋白Fc的Fc部分融合的可溶性DRAGON(DRAGON.Fc)是否以类似于HJV.Fc的方式抑制BMP对铁调素表达的诱导(Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-1939)。Hep3B细胞用铁调素启动子萤火虫荧光素酶报告分子和对照Renilla荧光素酶载体转染。细胞用多种BMP配体刺激，单独地或与增加浓度的DRAGON.Fc组合。如图1A中所示，DRAGON.Fc显著地抑制响应于BMP-2和BMP-4的铁调素启动子诱导，但对BMP-5、BMP-6和BMP-7的抑制不太有效，并且不抑制BMP-9。与HJV.Fc相比较，DRAGON.Fc显著地更有效地针对BMP-2(图1B)和BMP-4(图1C)，但针对BMP-6不太有效(图1D)。DRAGON.Fc还抑制肝细胞瘤来源的HepG2细胞中的内源性铁调素mRNA表达，而基础铁调素表达部分地依赖于内源性BMP-2、BMP-4和BMP-6配体(数据未显示；Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-1939)。
测试DRAGON.Fc在小鼠中的施用是否影响铁调素表达和铁代谢。与假处理的对照小鼠相比，DRAGON.Fc对肝脏铁调素表达(如通过定量实时RT-PCR测量(图2A))、脾膜铁转运蛋白表达(如通过Western印迹测量(图2B))、血清铁(图2C)、血清转铁蛋白饱和度(图2D)、肝脏铁含量(图2E)或脾铁含量(图2F)均没有作用。与假处理的对照小鼠相比，等同剂量的HJV.Fc减少肝脏铁调素表达(图2A)、增加脾膜铁转运蛋白表达(图2B)、增加血清铁(图2C)和转铁蛋白饱和度(图2D)、增加肝脏铁含量(图2E)和减少脾铁含量(图2F)。为了确认在用DRAGON.Fc蛋白注射的小鼠的血清中存在足以抑制BMP-2的活性DRAGON.Fc，我们测试了来自这些小鼠的血清抑制BMP-2对铁调素启动子活性的诱导的能力，如通过荧光素酶测定所测量。来自假处理的对照小鼠的血清抑制BMP-2对铁调素启动子活性的诱导达约30％(图2G,比较柱3和2)，可能的原因是存在已知的分泌的BMP抑制剂诸如Noggin(23)。与来自假处理的对照小鼠的血清相比，来自DRAGON.Fc处理的小鼠的血清显著地更有效，其抑制BMP-2对铁调素启动子活性的诱导超过70％(图2G,柱4)。
由于DRAGON.Fc在体内对铁调素表达和铁代谢没有作用，尽管与HJV.Fc相比其在体外作为BMP-2和BMP-4的抑制剂具有较高的效力，同时与HJV.Fc相比，DRAGON.Fc在抑制BMP-6方面不太有效，因此BMP-6可能是铁调素表达和铁代谢的重要内源性调节物。测试了在小鼠中特异性中和BMP-6的抗体的施用是否影响铁调素表达和铁代谢。如图3A中所示，中和BMP-6的抗体选择性地抑制Hep3B细胞中BMP-6对铁调素启动子荧光素酶报告分子的活化，但对BMP-2、BMP-4、BMP-5或BMP-9没有显著的作用。BMP-6抗体在较高浓度下显示针对BMP-7的一些抑制性活性，但与BMP-6相比显著较小(图3A)。如图3B中所示，与假处理的对照小鼠相比，如通过定量实时RT-PCR测量，用BMP-6抗体处理三天的小鼠的肝脏铁调素表达显著地减少约50％。另外，与假处理的对照相比，BMP-6抗体处理的小鼠具有显著增加的血清铁和转铁蛋白饱和度(图3C和D)。
通过在8周龄Bmp6敲除小鼠(Bmp6null mice)中测试，确认内源性BMP-6在调节铁调素表达和铁代谢中的重要性，Bmp6敲除小鼠以前由Solloway等(Solloway MJ,等1998.Dev Genet.22:321-39)产生。这些Bmp6敲除小鼠被描述为在发育期间在骨骼形成方面有些中度迟缓，但与野生型对照小鼠相比没有其他明显的缺陷，如通过定量实时RTPCR测量，Bmp6敲除小鼠显示肝脏铁调素表达减少大约10倍(图4A)，并且如通过Western印迹测量，脾膜铁转运蛋白表达增加2.3倍(图4B和C)。另外，Bmp6敲除小鼠具有显著增加的血清铁，血清转铁蛋白饱和度接近100％(图4D和E)。与野生型对照相比，在Bmp6敲除小鼠中肝脏铁含量增加超过20倍(图4F和H)，而脾铁含量减少4倍(图4G)。在8周龄Bmp6敲除小鼠的肝脏中铁过载程度似乎与报道的类似年龄的Hfe2-I小鼠中的程度相当(Huang,F.W.,等J.Clin.Invest.115:2187-2191；Niederkofler,V.,Salie,R.,Arber,S.2005.J Clin Invest.115:2180-6)。因此，Bmp6敲除小鼠具有类似于由于BMP共同受体血幼素的丧失引起的青少年血色素沉着病的表型。
下一步，测试外源性BMP-6在体内调节铁调素表达和铁代谢的能力。小鼠以250和1000μg/kg IP注射以单剂量的外源性BMP-6配体。如通过定量实时RT-PCR测量，BMP-6施用显著地增加肝脏铁调素表达。BMP-6施用还导致血清铁(图5B)和血清转铁蛋白饱和度(图5C)的剂量依赖性减小。
这些结果证明外源性BMP-6施用在体内正面调节铁调素表达并且减少血清铁，而Bmp6基因的敲除或使用BMP-6抗体选择性抑制内源性BMP-6抑制铁调素表达、增加血清铁、并且最终导致类似于由于BMP共同受体Hfe2中的突变引起的遗传性血色素沉着病的表型。这些数据支持了BMP-6作为铁调素表达的主要内源性调节物的重要性。
大量BMP配体已经显示在体外调节铁调素，包括BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7和BMP-9(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-1939；Wang,R.H.,等2005.Cell Metab.2:399-409；Truksa,J.,等2006.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103:10289-10293)。除BMP-7以外的所有这些配体的信使RNA在人肝脏中内源性地表达(Xia Y,等2008.Blood.1115195-204)。尽管以前已经显示，血幼素直接结合BMP-2和BMP-4配体(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539)，血幼素的可溶性形式HJV.Fc抑制BMP-6对铁调素活性的活化，甚至比其抑制BMP-2和BMP-4活性的能力更有效(Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-1939)。另外，siRNA或中和抗体对内源性BMP-6的抑制作用抑制了血幼素介导的对铁调素表达的诱导(Xia Y,等2008.Blood.1115195-204)。这些数据表明BMP-6是血幼素的配体。
对于BMP-6在铁代谢中的作用的更多支持证据来自最近的一项研究，该研究报道Bmp6转录物响应于富铁饮食而增加，并且响应于贫铁饮食而减少(Kautz,L.,等2008.Blood.112:1503-9)。在该研究中Bmp2转录物在极端铁过载的条件下轻微上调并且Bmp4没有变化(同前)。尽管血幼素结合BMP-2和BMP-4两者，但在我们的研究中选择性抑制BMP-2和BMP-4的DRAGON.Fc不能抑制铁调素表达和调控全身铁平衡，表明BMP-2和BMP-4配体在此背景下可能是不太重要的。本发明人进行的测试也没有发现在Bmp6敲除小鼠的肝脏中Bmp2和Bmp4转录物水平有任何变化，尽管存在明显的铁过载(数据未显示)。然而，数据并没有明确地排除其他BMP配体(包括BMP-2和BMP-4)在铁代谢中的任何可能的作用。
数据清楚地表明选择性BMP-6抑制剂可能是用于治疗由于铁调素过量引起的炎症性贫血的有效药剂。Bmp6敲除小鼠中缺少任何其他明显的表型表明更有选择性的抑制剂可以被较好的耐受且存在较少的脱靶(off-target)效应。另外，BMP-6样激动剂可能是在当前疗法难以治疗的患者中处理铁过载失调的可替代治疗策略。尽管还没有记载带有BMP-6突变的人类患者，但数据也表明BMP-6突变或BMP-6基因变体可以作为遗传性血色素沉着病的另一病因或疾病外显率的调节剂起作用。
无需进一步详细说明，相信本领域技术人员能够使用前面的描述以其最充分的程度利用本发明。下面的实施例仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余部分。
实施例
实施例1.cDNA的制备
由GenScript Corporation(Piscataway,NJ 08854)基于预测的GPI锚上游的人DRAGON蛋白序列(UniProtKB/Swiss-Prot登记号Q6NW40,氨基酸1-409)和人IgG1Fc序列(来自Signal pIg plus载体(R&D Systems)和GenBank AF150959)生成cDNA编码密码子优化的DRAGON.Fc。
实施例2.DRAGON.Fc和HJV.Fc的制备和纯化
根据生产厂商的说明书，使用293fectin(Invitrogen)将cDNA编码的DRAGON.Fc转染进Freestyle 293-F细胞(Invitrogen)中。转染的细胞培养在GIBCO Freestyle 293表达培养基(Invitrogen)中，以110RPM在增湿的8％CO2培养箱中在37℃下振摇。转染后7天，细胞通过离心而沉淀，并且如中Babbitt,J.L.,等2005.J.Biol.Chem.280:29820-29827所述，从培养基中经一步蛋白A亲合色谱法，使用Hi-Trap rProtein A FF柱(Amersham Biosciences)纯化DRAGON.Fc。如Babitt,J.L.,等2007.J ClinInvest.117:1933-9中所述制备HJV.Fc。为了测定纯度和定量蛋白浓度，将DRAGON.Fc和HJV.Fc进行还原性SDS-PAGE，接着进行Bio-safe考马斯蓝染色(Bio-Rad)以及使用抗HJV抗体(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539)、抗DRAGON抗体(Samad,T.A.,等2004.J.Neurosci.24:2027-2036)、和羊抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)如所述的那样进行Western印迹。(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Samad,T.A.,等2004.J.Neurosci.24:2027-2036)。蛋白浓度还通过牛血清白蛋白蛋白测定(Pierce)进行定量。
实施例3.BMP-6的制备
纯化的重组人BMP-6如以前所述进行制备(Simic,P.,等2006.J BiolChem.281:25509-21)。冻干的BMP-6溶解在20mM乙酸钠、5％甘露醇溶液,pH 4.0中用于动物注射。
实施例4.荧光素酶测定
使用双重荧光素酶报告分子测定***(Dual-Luciferase Reporter AssaySystem)(Promega)如以前所述(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-9)采用下列的改进方案在肝细胞瘤来源的Hep3B细胞中进行铁调素启动子荧光素酶报告分子测定。用铁调素启动子荧光素酶报告分子(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539)和对照Renilla荧光素酶载体(pRL-TK)转染的Hep3B细胞在补充了1％FBS的含有L-谷氨酰胺(Invitrogen)的a-MEM中进行血清饥饿培养6小时，接着用25ng/mL BMP-2(由哈佛牙科医学院(HarvardSchool of Dental Medicine)的Vicki Rosen馈赠)、BMP-4、BMP-6或BMP-7,50ng/mL BMP-5或5ng/mL BMP-9(R&D Systems)单独或与0.2-25μg/mLDRAGON.Fc、HJV.Fc或抗BMP-6抗体一起刺激16小时。选择相对浓度的BMP配体来引起类似程度的铁调素启动子荧光素酶活性，如以前所述的那样(Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-9)。
实施例5.动物
所有动物实验方案均由位于马萨诸塞州总医院的机构内动物照护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)和位于萨格勒布大学医学院(University of Zagreb School of Medicine)处的机构内动物照护和使用委员会和科技部批准。8周龄129S6/SvEvTac小鼠(Taconic)圈养在马萨诸塞州总医院啮齿动物设施中并以含有380ppm铁的Prolab5P75Isopro RMH 3000膳食饲养。由Elizabeth J.Robertson馈赠的具有混杂129Sv/C57背景的Bmp6敲除小鼠(Solloway MJ,等1998.Dev Genet.22:321-39)圈养在萨格勒布大学医学院(University of Zagreb School ofMedicine)处并且以含有180mg/kg铁的标准GLP膳食(4RF21,Mucedola,Italy)饲养。
对于DRAGON.Fc和HJV.Fc实验，8周龄129S6/SvEvTac小鼠(Taconic)接受腹膜内注射5或10mg/kg剂量的DRAGON.Fc，5或7mg/kg剂量的HJV.Fc，或等体积的等渗盐水每周3次持续3周。对于BMP-6抗体注射实验，8周龄129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射10mg/kg单克隆抗人BMP-6抗体(R&D Systems)或等渗盐水每天一次持续3天。最后一次注射后12小时，将小鼠处死并采集血液和肝脏用于测量铁参数和铁调素表达。
对于BMP-6注射实验，8周龄129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射250或1000mcg/kg的BMP-6或仅等体积的载体(20mM乙酸钠，5％甘露醇溶液,pH 4.0)。注射后6小时，将小鼠处死并采集血液、肝脏和脾用于测量铁参数和铁调素表达。
对于Bmp6敲除小鼠实验，5只8周龄Bmp6敲除小鼠和5只野生型对照小鼠被处死并采集血液、肝脏和脾用于测量铁参数和铁调素表达。
实施例6.定量实时RT-PCR.
使用RNeasy试剂盒(QIAGEN)根据生产厂商的说明书从小鼠肝脏中分离总RNA。如以前所述使用2步定量实时RT-PCR进行Hampl mRNA转录物相对于RPLl9的实时定量(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-9；Xia,Y.,等2007.J Biol Chem.282:18129-40)。也使用以前描述的引物对来自Bmp6敲除小鼠的肝脏的Bmp2、Bmp4和Bmp6mRNA相对于野生型小鼠进行实时定量(Kautz,L.,等2008.Blood.112:1503-9)。
实施例7.Western印迹.
对于膜铁转运蛋白测定，如以前所述制备脾膜制剂。蛋白浓度通过BCA测定(Pierce)确定。在室温下在1x Laemmli缓冲液中溶解30分钟后，每个样品20μg蛋白使用预制的NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)通过SDS-PAGE解析并转移至PDVF膜上(液体转移法)。印迹用处于含有0.1％Tween的tris缓冲盐水(TBS)(TBS-T)中的10％脱脂乳饱和并用2.5μg/ml膜铁转运蛋白抗体(稀释在含有5％脱脂乳的TBS-T中)在4℃探测过夜。Knutson,M.D.,等2005.Proc Natl Acad SciUSA.102:1324-8。在用TBS-T洗涤后，印迹与1:5000稀释的过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG(Sigma)温育1小时。使用增强化学发光ECLB法(PerkinElmer)进行检测。剥离印迹并且如Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539中所述重新探测作为内参照(loading control)的β-肌动蛋白表达。化学发光使用IPLab光谱软件3.9.5r2版(Scanalytics)进行定量。
实施例8.血清和组织铁测量.
采集血清并如以前所述分析铁浓度和不饱和铁结合力。如以前所述计算总铁结合力和转铁蛋白饱和度。如以前所述对肝脏和脾组织进行非血红素铁的定量测量(参见Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-9)。
实施例9.组织学
来自Bmp6敲除小鼠和野生型小鼠的肝脏固定在2％多聚甲醛中，然后固定在2％乙醇中，并包埋在石蜡中。5pm切片在二甲苯中脱蜡并在蒸馏水中水化。然后将切片在室温下在含有等体积的2％亚铁***(ElectronMicroscopy Sciences,Hatfield,PA)和2％盐酸的染色溶液中放置60min。然后切片在蒸馏水中漂洗，在0.2％番红精(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)中复染2min,并在1％乙酸中洗涤，然后在95％乙醇、无水乙醇中脱水，在二甲苯中澄清，并在DPX中封片(mount)。
实施例10.统计学.
以P<0.05，采用学生双尾t检验来确定统计学显著性。
实施例11.DRAGON.Fc选择性抑制BMP对铁调素表达的诱导.
图1.Hep3B细胞用铁调素启动子荧光素酶报告分子和对照Renilla荧光素酶载体(pRL-TK)转染。转染后48小时，如显示的那样，细胞在缺少或存在BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7或BMP-9配体的条件下，单独或与0.2-25μg/mL纯化的DRAGON.Fc(Dra.Fc)或HJV.Fc一起温育16小时。测定细胞溶胞产物的荧光素酶活性，并且相对荧光素酶活性计算为萤火虫与Renilla荧光素酶的比率以控制转染效率。对于用BMP配体结合DRAGON.Fc或HJV.Fc处理的细胞与用BMP配体单独处理的细胞相比较，结果报告为相对荧光素酶活性的减少百分比的平均数+/-标准差，每组n＝2-4。显示确切P-值。(1A)DRAGON.Fc对BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7和BMP-9配体的作用。(1B-1D).显示DRAGON.Fc和HJV.Fc抑制BMP-2(1B)、BMP-4(1C)和BMP-6(1D)的头对头比较(Head to head comparison)。
实施例12.在小鼠中施用DRAGON.Fc不影响铁调素表达或铁代谢.
图2.8周龄雄性129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射5(n＝3)或10mg/kg(n＝4)的纯化的可溶性DRAGON.Fc(Dra.Fc)或等体积的等渗盐水(Con,n＝7)每周3次持续3周。作为阳性对照，另一组小鼠接受腹膜内注射5(n＝3)或7mg/kg(n＝4)的等量HJV.Fc或等体积的等渗盐水(Con,n＝7)每周3次持续3周。两种DRAGON.Fc和HJV.Fc剂量的结果是相似的，并且因此合并成一组。(A)分离总肝脏RNA，并且通过定量实时RT-PCR相对于作为内部对照的RPLl9mRNA分析铁调素mRNA。(B)通过Western印迹对脾膜制剂分析膜铁转运蛋白(FPN)表达。剥离印迹并且用作为内参照的抗β-肌动蛋白抗体探测。对于膜铁转运蛋白相对于β-肌动蛋白的表达，化学发光通过通过IPLab光谱软件定量。(C和D)血清铁(C)和转铁蛋白饱和度(D)的测量。(E和F)肝脏(E)和脾(F)组织铁含量的定量。(G)如图1中那样，Hep3B细胞用铁调素启动子荧光素酶报告分子和pRL-TK转染。转染后48小时，细胞在缺少或存在1ng/mL BMP-2的条件下，单独或与来自假处理对照小鼠(Con,n＝4)或来自DRAGON.Fc处理小鼠(Dra.Fc,n＝4)的20％混合血清一起温育16小时。如图1中那样计算相对荧光素酶活性。结果报告为平均数+I-标准差。显示确切P值。
实施例13.特异性中和BMP-6的抗体在体内抑制肝脏铁调素表达并增加血清铁和转铁蛋白饱和度.
图3.(A)如图1中那样，Hep3B细胞用铁调素启动子荧光素酶报告分子和对照pRL-TK转染。转染后48小时，如所示的那样，细胞在缺少或存在BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7或BMP-9配体的条件下，单独或与0.2-25μg/mL中和BMP-6的抗体一起孵育(每组n＝2)。如图1中那样计算相对荧光素酶活性。(B-D)8周龄雄性129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射10mg/kg(a-BMP-6,n＝4)的中和BMP-6的抗体或等体积的等渗盐水(对照,n＝4)每天一次持续3天。(B)分离总肝脏RNA，并且通过定量实时RT-PCR相对于作为内部对照的RPLl9mRNA分析铁调素mRNA。(C和D)血清铁(C)和转铁蛋白饱和度(D)的测量。结果表示为平均数+I-标准差。显示确切P值。
实施例14.Bmp6敲除小鼠显示减少的肝脏铁调素表达、增加的脾膜铁转运蛋白表达、增加的血清铁和转铁蛋白饱和度、增加的肝脏铁含量和减少的脾铁含量.
图4.8周龄雄性Bmp6敲除小鼠(n＝5)和品系匹配的野生型对照小鼠(WT,n＝5)(A)通过定量实时RT-PCR分析相对于RPLl9mRNA表达的铁调素mRNA表达，(B和C)通过Western印迹(C)分析相对于β-肌动蛋白表达的膜铁转运蛋白表达，然后使用IPLab光谱软件定量(B)，(D)分析血清铁，(E)分析血清转铁蛋白饱和度，(F)分析肝脏铁含量，和(G)分析脾铁含量，如图2中所述。(H)在野生型(WT)和Bmp6敲除小鼠肝脏中对组织铁的Perls普鲁士蓝染色。原放大倍数x 10。结果表示为平均数+/-标准差。显示确切P值。
实施例15.在小鼠中施用BMP-6增加铁调素mRNA表达并减少血清铁.
图5.8周龄雄性129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射250μg/kg(n＝6)或1000μg/kg(n＝7)的BMP-6或仅等体积的载体(n＝6)。注射后6小时，采集血液和肝脏。(A)分离总肝脏RNA，并且通过定量实时RT PCR相对于作为内部对照的RPLl9mRNA分析铁调素mRNA。(B和C)血清铁(B)和转铁蛋白饱和度(C)的测量。结果表示为平均数+/-标准差。显示确切P值。
实施例16.制备用于在小鼠贫血模型中使用的腹膜内注射液的流产布鲁氏菌(Brucella abortus)
当经腹膜内(IP)注射至小鼠体内时流产布鲁氏菌(BA)用来诱导炎症性贫血。通常在7天内产生建立贫血，其特征为2-3g/dL滴的血红蛋白水平。注射后贫血典型地持续28天。28天后，小鼠开始复原并且看到血红蛋白水平开始升高。此实验方案描述了如何1)从苯酚处理的缓冲液洗涤和分离BA颗粒和2)为10只小鼠制备BA从而以200μl的体积IP递送5x108颗粒/小鼠。
以下列的方式洗涤和制备5x109储备液。首先，从冰箱中取出60mL瓶子并充分混合。然后将500ml BA转移至500mL离心瓶中。然后使用超速离心机(Ultracentrifuge)将这些以10,000rpm离心15分钟。去除上清液并且重新悬浮在100mL PBS中。悬浮液现在为5x109颗粒/mL。将试样等分并在-80℃冷冻，典型地为1mL等分试样。
以下列的方式制备用于注射的5x108颗粒(例如用于10只小鼠)。起始浓度必需为2.5x109颗粒/mL，因为将注射200μL/小鼠。使用PBS将储备液稀释2倍。例如，需要10只小鼠x 0.200μL＝2mL+20％剩余物(overage)＝2.2mL 2.5x109颗粒/mL。1.1mL BA储备液+1.1mL PBS。
材料
BA:在60mL瓶中的流产布鲁氏菌环状试验抗原(Ring Test Antigen)(1119-3株)购自美国农业部动植物卫生检验局国家兽医服务实验室(U.S.Department of Agriculture,Animal and Plant Health Inspection Service,National Veterinary Services Laboratories),Ames,Iowa。布鲁杆菌病环状试验抗原含有死亡的染色的流产布鲁氏菌1119-3株细胞在苯酚处理的缓冲液中的悬浮液。每个60mL瓶子的浓度为大约109颗粒/mL。抗原保存在4℃。
稀释剂：DPBS(Gibco)使用的洗涤剂、载体和对照。
结果
对接受腹膜内注射流产布鲁氏菌的小鼠施用特异性结合BMP-6的抗体。在腹膜内注射流产布鲁氏菌的小鼠中减少或消除炎症性贫血症状的抗体适合用于治疗哺乳动物贫血。
实施例17.在BMP-6上的多个位点的结合抑制肝脏铁调素表达并增加血清铁和转铁蛋白饱和度.
进行捕获测定(pulldown assay)以明确上面实施例13中使用的HJV和BMP-6抗体是否在相同位点上结合BMP-6。
hBMP6(1μg)+/-hHJV.His(对于相对于mAb的5x摩尔比为7.1μg或相对于25x摩尔比为35.5μg)在500μl盐水溶液中在4℃下温育过夜。然后在用蛋白A珠子捕获之前加入2.5μg mAb(mAb507,R&D Systems)持续1hr。
然后样品在SDS-PAGE凝胶4-12％上跑样，并且转移至PVDF膜。使用兔多克隆抗BMP6抗体作为一抗，山羊抗兔IgG-HRP作为二抗进行图6中所示的Western印迹分析。印迹用ECL试剂显影，曝光3分钟。箭头指示BMP6蛋白条带，并且该条带仅存在于含有BMP6的样品中(泳道2、3、4、5、8和9)，但不存在于不含BMP6的样品中(泳道6、7和10)。
泳道:
1.可见Blue Plus 2预染MW梯
2.hBMP6+mAb混合物的腹膜内注射前等分试样(Pre-IP aliquot)
3.腹膜内注射hBMP6+mAb
4.腹膜内注射hBMP6+mAb+5x hHJV.His
5.腹膜内注射hBMP6+mAb+25x hHJV.His
6.仅腹膜内注射mAb
7.空白
8.hBMP6+mAb+5x hHJV.His的腹膜内注射前等分试样
9.hBMP6+mAb+25x hHJV.His的腹膜内注射前等分试样
10.mAb的腹膜内注射前等分试样
结果:
抗BMP6mAb(R&D Systems)捕获hBMP6，如图6中所示，泳道3。添加摩尔过量的hHJV.His不抑制捕获，如图6中所示，泳道4和5。基于此，我们认识到hHJV.His和抗BMP6可能与hBMP6上不同的位点结合。下一步检查印迹中hHJV.his的存在，观察是否其也被捕获。
图7显示与图6中所示相同的剥离后的印迹，并且用mAb 24C8-C10(对HJV特异)再探测以使hHJV.His显影。如图7中所示，在hBMP6的存在下，抗BMP6mAb(R&D Systems)捕获hHJV.His蛋白(泳道4和5)。因此，我们得出结论，hHJV.his和抗BMP6与hBMP6上不重叠的位点结合，这是一个非显而易见的结果。
实施例18.hBMP-6肽用于产生针对BMP-6的抗体.
已经制备了针对hBMP6肽TQSQDVARVSSASDY的抗体。
进行Western印迹分析测定以证明有可能产生针对被定义为TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO:3)的成熟hBMP6中的特殊肽结构域的抗体。
山羊多克隆抗hBMP6抗体(R and D Systems AF507)特异性地检测通过半胱氨酸残基与hBMP6肽缀合的牛血清白蛋白(BSA)(BSA-C-TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO:4))(图8,泳道1)。
用500x摩尔过量的未缀合的hBMP6肽竞争，阻断了多克隆抗体与BSA-C-TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO:4)的结合(图8,泳道2)。
这表明有可能产生针对被定义为TQSQDVARVSSASDY(SEQ IDNO:3)的成熟hBMP6中的特殊肽结构域的抗体。
参考文献
下列参考文献的每一篇均通过引用合并入本文中如同其全部内容在本文中给出一样：
1.Roetto,A.,等2003.Nat.Genet.33:21-22.
2.Papanikolaou,G.,等.2004.Nat.Genet.36:77-82.
3.Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539.
4.Babitt,J.L.,等2007.J Clin Invest.117:1933-1939.
5.Shi,Y.,和Massague,J.2003.Cell.113,685-700.
6.Wang,R.H.,等2005.Cell Metab.2:399-409.
7.Pigeon,C,等2001.J.Biol.Chem.276:7811-7819.
8.Nemeth,E.,等2004.Science.306:2090-2093.
9.Nicolas,G.,等2002.J.Clin.Invest.110:1037-1044
10.Nemeth,E.,等2004.J.Clin.Invest.113:1271-1276.
11.Pietrangelo,A.2006.1763:700-710.
12.Nemeth,E.,等2003.Blood.101:2461-2463.
13.Weiss,G.和Goodnough,L.T.2005.N.Engl.J.Med.352:1011-1023.
14.Andrews NC.2008.Blood.112219-30.
15.Huang,F.W.,等J.Clin.Invest.115:2187-2191.
16.Niederkofler,V.,Salie,R.,Arber,S.2005.J Clin Invest.115:2180-6.
17.Truksa,J.,等2006.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103:10289-10293.
18.Verga Falzacappa,M.V.,等2008.J Mol Med.86:531-40.
19.Yu,P.B.,等2008.Nat Chem Biol.4:33-41.
20.Samad,T.A.,等2004.J.Neurosci.24:2027-2036.
21.Babitt,J.L.,等2005.J.Biol.Chem.280:29820-29827.
22.Samad,T.A.,等2005.J.Biol.Chem.280:14122-14129.
23.Balemans,W.,Van Hul,W.2002.Dev Biol.250:231-50.
24.Solloway MJ,等1998.Dev Genet.22:321-39.
25.Xia Y,等2008.Blood.1115195-204.
26.Kautz,L.,等2008.Blood.112:1503-9.
27.Simic,P.,等2006.J Biol Chem.281:25509-21.
28.Xia,Y.,等2007.J Biol Chem.282:18129-40.
29.Knutson,M.D.,等,2005.Proc Natl Acad Sci U.S.A.102:1324-8.
30.Andriopoulos,B.等,2009.Nat Genet.41(4):482-7.
下列专利文献中的每一篇的全部内容均通过引用合并入本文中：PCT申请号PCT1/US08/059753(2008年4月9日提交)；美国专利申请号11/884,509(2007年8月16日提交)；美国专利申请号11/195,205(2005年8月2日提交)；和美国专利申请号10/419,296(2003年4月17日提交)。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用合并入本文中如同单个的出版物或专利申请各自被具体地和单独地指出通过引用而合并。
尽管前面为了便于理解的目的已经通过举例说明和实施例一定程度地详细描述了本发明，但对于本领域普通技术人员来说，鉴于本发明的教导，在不背离附带的权利要求的精神或范围的前提下可以对其作出某些改变和修改是显而易见的。

Claims (25)

1.一种药物组合物，其包含特异性结合成熟BMP-6蛋白质的单克隆抗体或其片段。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述成熟BMP-6包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。
3.权利要求1或2所述的药物组合物，其中相对于人BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或BMP-9，所述单克隆抗体优先抑制人BMP-6。
4.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述组合物结合BMP-6的亲和性比结合BMP-7的亲和性大至少5倍。
5.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体选自由嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、全人单克隆抗体、单链Fv片段、F(ab')2片段、Fd、结构域抗体(dAb)、双抗体、maxibody和纳米抗体组成的组。
6.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体减少受试者中铁调素表达或活性。
7.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体减少BMP-6信号传导。
8.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体增加受试者中的血清铁水平。
9.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体增加受试者中的血细胞比容。
10.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体增加受试者中的血清血红蛋白水平。
11.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体导致受试者中的血清转铁蛋白饱和度增加。
12.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体结合的人BMP-6的表位与R&D Systems的MAB507单克隆抗体结合的人BMP-6的表位相同。
13.包含特异性结合成熟BMP-6蛋白质的单克隆抗体或其片段的药物组合物在制备用于治疗受试者中缺铁性失调的药物中的用途。
14.根据权利要求13的用途，其中所述缺铁性失调是贫血。
15.根据权利要求13或14的用途，其中所述成熟BMP-6包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。
16.根据权利要求13或14的用途，其中相对于人BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或BMP-9，所述单克隆抗体优先抑制人BMP-6。
17.根据权利要求13或14的用途，其中所述组合物结合BMP-6的亲和性比结合BMP-7的亲和性大至少5倍。
18.根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体选自由嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、全人单克隆抗体、单链Fv片段、F(ab')2片段、Fd、结构域抗体(dAb)、双抗体、maxibody和纳米抗体组成的组。
19.根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体减少所述受试者中铁调素表达或活性。
20.根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体减少BMP-6信号传导。
21.根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体增加所述受试者中的血清铁水平。
22.根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体增加所述受试者中的血细胞比容。
23.根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体增加所述受试者中的血清血红蛋白水平。
24.根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体导致所述受试者中的血清转铁蛋白饱和度增加。
25.根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体结合的人BMP-6的表位与R&D Systems的MAB507单克隆抗体结合的人BMP-6的表位相同。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111344306A (zh) * 2017-11-02 2020-06-26 拜耳股份公司 结合alk-1和bmpr-2的双特异性抗体

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110070242A1 (en) * 2009-09-01 2011-03-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods for Diagnosing and Treating Iron Dysregulation
WO2011085361A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 Inotek Pharmaceuticals Corporation Combination, kit and method of reducing intraocular pressure
CN102933593A (zh) 2010-03-26 2013-02-13 伊诺泰克制药公司 使用n6-环戊基腺苷（cpa）、cpa衍生物或其前药降低人眼内压的方法
US9708379B2 (en) * 2011-01-19 2017-07-18 The General Hospital Corporation Compositions for regulating iron homeostasis and methods of using same
EP3450568A3 (en) 2011-03-04 2019-04-24 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
CA3204283A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
WO2013090633A2 (en) * 2011-12-14 2013-06-20 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
EP2807178B9 (en) 2012-01-26 2017-11-29 Inotek Pharmaceuticals Corporation Anhydrous polymorphs of (2r,3s,4r,5r)-5-(6-(cyclopentylamino)-9h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl) } methyl nitrate and processes of preparation thereof
AR093620A1 (es) 2012-12-17 2015-06-10 Lilly Co Eli Anticuerpos bmp-6
CN103255143A (zh) * 2013-01-24 2013-08-21 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心 一个抑制BMPR-lB基因表达合成的shRNA分子
RU2668391C2 (ru) 2013-03-15 2018-09-28 ИНТРИНСИК ЛАЙФСАЙЕНСИС ЭлЭлСи Антитела к гепсидину и их применения
JP2016513706A (ja) 2013-03-15 2016-05-16 イノテック ファーマシューティカルズ コーポレイション 点眼用製剤
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
NZ730186A (en) 2014-09-22 2020-04-24 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
WO2016071701A1 (en) * 2014-11-07 2016-05-12 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
UY36449A (es) * 2014-12-19 2016-07-29 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6
EA039579B1 (ru) * 2014-12-19 2022-02-14 Новартис Аг Способы и композиции антител, направленных против bmp6
GB2550114A (en) * 2016-05-03 2017-11-15 Kymab Ltd Methods, regimens, combinations & antagonists
KR102492057B1 (ko) 2016-06-15 2023-01-26 노파르티스 아게 골 형태형성 단백질 6(ｂｍｐ6)의 억제제를 사용한 질병의 치료 방법
EP3415527A1 (de) 2017-06-14 2018-12-19 Technische Universität Dresden Verwendung der extrazellulären domäne des transferrinrezeptor 2 zur diagnostik und behandlung von primär und sekundär sklerosierenden erkrankungen
JP2021535078A (ja) * 2018-06-13 2021-12-16 カイマブ・リミテッド 骨の疾患の治療に用いるためのトランスフェリン受容体２のアンタゴニスト及びアゴニスト

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
US7217689B1 (en) 1989-10-13 2007-05-15 Amgen Inc. Glycosylation analogs of erythropoietin
KR100263845B1 (ko) 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
IL110669A (en) 1993-08-17 2008-11-26 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5773569A (en) 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5830851A (en) 1993-11-19 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5885574A (en) 1994-07-26 1999-03-23 Amgen Inc. Antibodies which activate an erythropoietin receptor
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5767078A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
DK1019490T3 (da) * 1997-02-10 2010-03-15 Harvard College Fremgangsmåder til modulering af hæmatopoese og vaskulær vækst
AU751898B2 (en) 1997-07-14 2002-08-29 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6753165B1 (en) 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US6391633B1 (en) 1997-07-23 2002-05-21 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
US7078500B1 (en) 1998-01-30 2006-07-18 The General Hospital Corporation Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus
US6030086A (en) 1998-03-02 2000-02-29 Becton, Dickinson And Company Flash tube reflector with arc guide
US6310078B1 (en) 1998-04-20 2001-10-30 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Substituted amino acids as erythropoietin mimetics
US20050181482A1 (en) 2004-02-12 2005-08-18 Meade Harry M. Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk
CA2330527A1 (en) 1998-06-15 1999-12-23 Genzyme Transgenics Corporation Erythropoietin analog-human serum albumin fusion
JP4809977B2 (ja) 1998-10-23 2011-11-09 アムジエン・インコーポレーテツド 貧血の予防および治療用の方法および組成物
EP1169352A4 (en) 1999-04-14 2005-05-04 Smithkline Beecham Corp ANTIBODY AGAINST THE ERYTHROPOIETIN RECEPTOR
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
JP2003514552A (ja) 1999-11-12 2003-04-22 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態
US20050202538A1 (en) 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
US20030224501A1 (en) * 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
EP2292651A1 (en) 2000-04-21 2011-03-09 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
US7078376B1 (en) 2000-08-11 2006-07-18 Baxter Healthcare S.A. Therapeutic methods for treating subjects with a recombinant erythropoietin having high activity and reduced side effects
JP2004508338A (ja) 2000-09-08 2004-03-18 グリフォン　セラピューティクス，インコーポレーテッド ポリマー修飾合成タンパク質
ATE505204T1 (de) 2000-12-20 2011-04-15 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
EP1383927B1 (en) 2001-04-04 2009-07-08 GenOdyssee New polynucleotides and polypeptides of the erythropoietin gene
ES2326469T5 (es) 2001-05-25 2018-05-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Uso de hepcidina para preparar un medicamento para tratar trastornos de la homeostasis del hierro
US6900292B2 (en) 2001-08-17 2005-05-31 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
AU2002351746A1 (en) 2001-12-21 2003-07-15 Maxygen Aps Erythropoietin conjugates
GB0202252D0 (en) 2002-01-31 2002-03-20 Oxford Biomedica Ltd Anemia
EP1470232A1 (en) 2002-01-31 2004-10-27 Oxford Biomedica (UK) Limited Physiologically regulated erythropoietin-expressing vector for the treatment of anaemia
JP4109204B2 (ja) 2002-03-26 2008-07-02 レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー 所望エリスロポエチングリコアイソフォームプロフィールの製造方法
WO2003084477A2 (en) 2002-03-29 2003-10-16 Centocor, Inc. Mammalian cdr mimetibodies, compositions, methods and uses
WO2003089608A2 (en) 2002-04-18 2003-10-30 The General Hospital Corporation Drg11-responsive (dragon) gene family
CA2485365A1 (en) 2002-05-13 2003-11-20 Modigenetech Ltd. Ctp-extended erythropoietin
AU2003280420A1 (en) 2002-06-26 2004-01-19 Yale University Modulators and modulation of the interacton between rgm and neogenin
CA2490411A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Centocor, Inc. Mammalian epo mimetic ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses
JP2006504406A (ja) 2002-06-28 2006-02-09 セントカー・インコーポレーテツド 哺乳動物のｃｈ１欠失ミメティボディ、組成物、方法および使用
DE10230381A1 (de) 2002-07-05 2004-01-22 Institut für Medizintechnologie Magdeburg GmbH, IMTM Verwendung von Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidasen und diese umfassende pharmazeutischen Zubereitungen
AU2003246486A1 (en) 2002-07-19 2004-02-09 Cangene Corporation Pegylated erythropoietic compounds
GB0217786D0 (en) 2002-07-31 2002-09-11 Glaxo Group Ltd Compounds
WO2004018667A1 (ja) 2002-08-26 2004-03-04 Kirin Beer Kabushiki Kaisha ペプチド及びこれを含む医薬
WO2005025606A1 (en) 2003-09-09 2005-03-24 Warren Pharmaceuticals, Inc. Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
MXPA05002591A (es) 2002-09-11 2005-09-20 Fresenius Kabi Gmbh Derivados de almidon de hidroxialquilo.
TWI320716B (en) 2002-10-14 2010-02-21 Abbott Lab Erythropoietin receptor binding antibodies
US7396913B2 (en) 2002-10-14 2008-07-08 Abbott Laboratories Erythropoietin receptor binding antibodies
US20040071694A1 (en) 2002-10-14 2004-04-15 Devries Peter J. Erythropoietin receptor binding antibodies
US20040091961A1 (en) 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
US7226902B2 (en) * 2003-03-14 2007-06-05 Celltech R&D, Inc. Ligands for TGF-beta binding proteins and uses thereof
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005028517A2 (en) 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
BRPI0411160A (pt) 2003-05-12 2006-07-11 Affymax Inc novos compostos modificados com poli(glicol etilênico) e usos dos mesmos
JP4949844B2 (ja) 2003-05-12 2012-06-13 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチン受容体に結合する新規ペプチド
PT1629007E (pt) 2003-05-12 2009-05-06 Affymax Inc Péptidos novos que se ligam ao receptor da eritropoietina
US7074755B2 (en) 2003-05-17 2006-07-11 Centocor, Inc. Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
KR20060032140A (ko) 2003-05-30 2006-04-14 센토코 인코포레이티드 트랜스글루타미나아제를 이용한 신규 에리트로포이에틴접합체의 형성
WO2005001136A1 (en) 2003-06-04 2005-01-06 Irm Llc Methods and compositions for modulating erythropoietin expression
US8614204B2 (en) 2003-06-06 2013-12-24 Fibrogen, Inc. Enhanced erythropoiesis and iron metabolism
US20050019914A1 (en) 2003-07-24 2005-01-27 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Perfusion process for producing erythropoietin
EP1663278A4 (en) 2003-08-28 2009-07-29 Biorexis Pharmaceutical Corp EPO MIMETIC PEPTIDES AND FUSION PROTEINS
AU2004316266A1 (en) 2003-09-30 2005-09-09 Centocor, Inc. Human hinge core mimetibodies, compositions, methods and uses
UA89481C2 (uk) 2003-09-30 2010-02-10 Центокор, Инк. Еритропоетинові міметичні шарнірно-серцевинні міметитіла людини, композиції, способи та застосування
WO2005051327A2 (en) 2003-11-24 2005-06-09 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
EP1548031A1 (en) 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Nature-identical erythropoietin
JP2008504008A (ja) 2003-12-31 2008-02-14 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 改良された薬物動態を有するＦｃ−エリスロポエチン融合タンパク質
CA2551131A1 (en) 2003-12-31 2005-07-21 Centocor, Inc. Novel recombinant proteins with n-terminal free thiol
US7423139B2 (en) 2004-01-20 2008-09-09 Insight Biopharmaceuticals Ltd. High level expression of recombinant human erythropoietin having a modified 5′-UTR
WO2005070451A1 (en) 2004-01-22 2005-08-04 Zafena Aktiebolag Pharmaceutical composition comprising non-glycosylated erythropoietin
WO2005084711A1 (fr) 2004-03-02 2005-09-15 Chengdu Institute Of Biological Products Erythropoietine recombinante pegylee a activite in vivo
TW200603818A (en) 2004-03-11 2006-02-01 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
US20050227289A1 (en) 2004-04-09 2005-10-13 Reilly Edward B Antibodies to erythropoietin receptor and uses thereof
US20080194475A1 (en) 2004-04-23 2008-08-14 Andrew Buchanan Erythropoietin Protein Variants
PL1781697T3 (pl) 2004-07-07 2009-10-30 H Lundbeck As Nowa karbamylowana EPO i sposób jej wytwarzania
US20060063208A1 (en) 2004-08-02 2006-03-23 Woolf Clifford J DRG11-responsive (DRAGON) gene and uses thereof
WO2006029094A2 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Xencor, Inc. Erythropoietin derivatives with altered immunogenicity
KR20070092706A (ko) 2004-11-10 2007-09-13 아플라겐 게엠베하 조혈을 촉진하는 분자
JP5063366B2 (ja) 2005-02-16 2012-10-31 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ヘプシジンによる鉄代謝を制御するためのＴＧＦ−βスーパーファミリーの化合物の調節因子の使用
US20060239951A1 (en) * 2005-03-30 2006-10-26 Alexandre Valentin Methods for stimulating hair growth by administering BMPs
US8895002B2 (en) 2007-04-09 2014-11-25 The General Hospital Corporation Hemojuvelin fusion proteins and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON, GREGORY J., AND DAVID M. FRAZER.: "Iron metabolism meets signal transduction", 《NATURE GENETICS》 *
LE´ON KAUTZ ET AL.: "Iron regulates phosphorylation of Smad1/5/8 and gene expression of Bmp6,Smad7, Id1, and Atoh8 in the mouse liver", 《BLOOD》 *
YIN XIA. ET AL.: "Hemojuvelin regulates hepcidin expression via a selective subset of BMP ligands and receptors independently of neogenin", 《BLOOD》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111344306A (zh) * 2017-11-02 2020-06-26 拜耳股份公司 结合alk-1和bmpr-2的双特异性抗体

Also Published As

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