CN104911248A - 一种用于ii、iii期结直肠癌诊断及预后的微小核糖核酸组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于II、III期结直肠癌诊断及预后的微小核糖核酸组合及其应用。所述miRNA组合包括：miR-17-3p、miR-106a和miR-145中的任意二到三种。所述试剂盒包括上述miRNA的TaqMan探针组合。在本发明中，血清较易获得，无需其它组织，属于无创性检查；血清miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况，以其作为诊断标志物可以提高检测的准确性；所述试剂盒简化了TaqMan探针库，减少制作成本和生产时间，增加了针对性和实用性，提高了检测的灵敏度和特异性；所述组合、方法、试剂盒不仅能够用于结直肠癌的早期检测，还能用于II、III期结直肠癌生存期和化疗效益的预测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于II、III期结直肠癌诊断及预后的微小核糖核酸组合及其应用。
背景技术
在我国，结直肠癌作为第三大肿瘤，其发病率及死亡率近年来逐年上升。目前在结直肠癌临床工作中尚有许多亟待解决的问题。第一，尚缺乏有效的用于疾病早期诊断的非侵入性生物标志物。大便潜血试验及结肠镜检查是目前较为公认的早期诊断方法，多项大样本临床研究资料显示，在50岁以上的人群中进行筛查可降低结直肠癌发病率及死亡率。大便潜血检查因操作方便、成本低廉得到广泛应用，但低灵敏度和特异度使其临床价值有限。结肠镜检查是目前早期诊断结直肠癌的金标准，但操作难度大、花费高及并发症风险导致病人依从性差，难以成为人群筛查的常规手段。第二，尚缺乏有效的预后判断及化疗疗效评价指标。目前临床上主要依据基于临床病理指标(如肿瘤大小、***转移数目、远处转移、组织分级等)的TNM分期作为疾病预后的判断及指导临床治疗，但根据此分期判断患者预后存在较大的异质性，亦不能预测肿瘤患者对化疗的反应。
诊断技术的不断提高使新发结直肠癌病例中非转移性疾病的比例大大增加，一项来自美国的统计显示每年新发结直肠癌患者中Ⅱ、Ⅲ期病人比例超过一半，对于这部分患者，外科手术及辅助化疗是主要治疗手段。对于***阳性的局部进展期病人(AJCCⅢ期)，有多项大样本临床试验证明根治性手术以及辅助化疗可显著提高生存，已成为标准治疗。一般认为，Ⅱ期患者根治性手术后是治愈的，术后是否进行辅助化疗仍存在争议，目前认为患者存在高危因素(如T4，脉管侵犯，组织学分化差，梗阻，穿孔等)预示较差的预后并且可能从化疗中获益，但是这些临床病理指标的明确意义尚未得到大样本资料验证。研究表明Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者经过标准治疗后仍有20％‐30％出现复发,其中40‐50％复发发生在原发灶切除后一年内，80％复发发生在原发灶切除三年内，复发后5年生存率低于1％。因此，对于这部分病人，寻找有效的预后以及复发预测指标显得尤为重要。
微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子,其主要功能是参与基因转录后水平调控。miRNA通过与靶mRNA 3’端非翻译序列完全或部分互补结合,导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制从而调控靶基因的表达。miRNA参与1/3人类蛋白编码基因调控，它与多种生理活动有关，如生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等；也与许多疾病的发生发展密切相关，如糖尿病、心血管疾病、肿瘤等。最近的研究显示[1-3]，miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥抑癌基因或癌基因样作用。已证实，肿瘤组织和肿瘤细胞中的某些miRNA表达水平发生了变化，相对于正常组织，一些miRNA表达量显著上升或下降。许多癌组织如肺癌、乳腺癌和食管癌等组织都有若干组织特异性miRNA的表达，提示miRNA有肿瘤组织特异性。另外，miRNA的表达也与肿瘤分化程度以及预后有关。大量的研究结果揭示，miRNA可作为新的肿瘤标志物，且为肿瘤的基因治疗提供新靶点。但组织标本取材属创伤性检出，且无法实现肿瘤的早期诊断和预后判断。最近报道显示，人血清/血浆中也存在丰富、稳定的miRNA,一些肿瘤包括非小细胞肺癌、结直肠癌、***癌、卵巢癌和胰腺癌患者血清中miRNA表达谱与正常人有显著差异，均有各自特异的表达谱。
目前尚没有利用无创伤性、取材方便的血液标本检测判断与结直肠癌分期相关和预后相关的特异性miRNA组合及检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的就在于通过研究Ⅱ、Ⅲ结直肠癌患者血清miRNA的特异性变化，筛选出一组与正常人群差异表达并且与肿瘤负荷密切相关的血清miRNA，并利用这些miRNA的TaqMan探针制备出适用于临床诊疗用途的试剂盒，为结直肠癌分期诊断及术后预后提供特异性的中间结果以及迅速的无创伤性检测手段。
以下是对本发明的发明内容与技术方案的详细描述：
一种用于检测II、III期结直肠癌的miRNA组合，该miRNA组合包括下列miRNA：miR‐17、miR‐106a、miR‐145中的一种或多种；优选由miR‐17、miR‐106a和miR‐145中的任意两种或三种组成；进一步优选由miR‐17和miR‐106a组成。
上述miRNA组合的筛选方法包括以下步骤(见图1)：
(1)分别收集20例手术前Ⅱ、Ⅲ结直肠癌患者混合血清，20例手术后Ⅱ、Ⅲ结直肠癌患者混合血清，20例年龄与性别匹配的正常人混合血清，提取总RNA；
(2)采用低密度芯片技术(TaqMan low density Array technology)，对上述总RNA中成熟miRNA进行检测，筛选出3组样本间表达差异的miRNA；
(3)用实时荧光定量PCR方法(TaqMan探针法)对上述标本进行逐个检测，从低密度芯片方法初筛出的miRNA中复筛出表达差异显著miRNA；
(4)进一步用定量PCR方法对大批量标本进行逐个验证，筛选出稳定的表达差异显著的一组miRNA。
具体来说，上述筛选方法包括以下步骤：(1)分别收集正常人及Ⅱ、Ⅲ结直肠癌患者手术前后的混合血清，提取总RNA；(2)运用低密度芯片技术对上述RNA进行检测，初筛出手术前后及与非癌对照组表达差异显著的一些miRNA；(3)将抽提的RNA逆转录为cDNA，采用荧光定量PCR(TaqMan探针法)对初筛出的miRNA进行复筛和验证，挑选出手术前后及与非癌对照组稳定、特异表达的一组miRNA。
本发明使用的检测方法可以选自：RT‐PCR方法、低密度芯片技术(TaqMan low densityArray technology)、Real‐time PCR方法中的一种或几种。例如，血清中miRNA分子的检测方法包括以下步骤：
(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA；
(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA；
(3)利用TaqMan探针法进行PCR反应；
(4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
(5)EB染色后在紫外灯下观察结果。
本发明还提供了一种用于结直肠癌早期诊断和/或预后诊断的miRNA TaqMan探针组合物，其包括miR‐17、miR‐106a和miR‐145中的任意两种或三种miRNA的TaqMan探针，优选由miR‐17和miR‐106a两种miRNA的TaqMan探针组成，或由miR‐17、miR‐106a和miR‐145三种miRNA的TaqMan探针组成，各探针序列进一步优选如下表所示：
此外，本发明还提供一种用于结直肠癌诊断和/或预后的试剂盒。
在本发明的一个具体实施方案中，上述试剂盒包括Taq酶和dNTP,氯化镁、10×PCR缓冲液(不含Mg2+)和包括miR‐17、miR‐106a和miR‐145中任意一种或多种miRNA的TaqMan探针(ABI公司提供，专用于miRNA荧光定量)。
上述试剂盒可以优选包括以下TaqMan探针中的一种或多种，进一步优选包括miR‐17和miR‐106a两种miRNA的TaqMan，或包括miR‐17、miR‐106a和miR‐145三种miRNA的TaqMan。
本发明所述结直肠癌包括Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌。
本发明所述的miRNA组合或其对应的TaqMan探针组合，以及含有所述TaqMan探针组合的试剂盒可用于结直肠癌分期检测和预后判断之中。通过检测本发明所述的miRNA在患者血清和健康人群血清中的表达量，如果二者具有显著性的差异表达，则说明患者患有Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌。通过对患者患病时血清中上述miRNA的定量检测可判断患者的预后情况。
本发明的有益效果：
首先，血清相对其它组织较易获得，与结肠组织活检相比，属于无创性检查，极大地方便了医疗人员的使用，更减轻了患者的痛苦；
其次，血清中的miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况，其检测结果具有精确而详细的指导意义；
第三，所筛选出的miRNA组合对结直肠癌诊断的特异性和灵敏度显著高于目前临床上使用的肿瘤标志物CEA(癌胚抗原)，大大提高了诊断的准确性。此外，血清miRNA检测能在分子水平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态，并为结直肠癌的治疗提供了潜在靶点。
第四，本发明所筛选出的结直肠癌血清miRNA组合与至今已报道的其他几种肿瘤患者血清中特异变化的miRNA不尽相同，提示本发明的miRNA组合不仅可以将结直肠癌与非癌正常人区分开来，同时也与其他肿瘤区分开来。
第五，本发明所筛选出的结直肠癌血清miRNA组合与不仅可以将结直肠癌与非癌正常人区分开来，同时也为结直肠癌术后复发的判断提供帮助。
第六，本发明的试剂盒所包含的TaqMan探针同样是基于低密度芯片技术、定量PCR技术筛选出的在结直肠癌与正常状态下表达差异显著的一组血清miRNA TaqMan探针，这样可以增加检测的灵敏度和特异性，提高检测水平。
综上所述，本发明提供的特异的miRNA组合的检测结果作为诊断结直肠癌的中间结果，有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息进行结直肠癌的诊断。同时，此血清学指标用于Ⅱ、Ⅲ期患者术后肿瘤复发预后因素具有重要意义，目前临床一些术后复发预测指标多为组织病理学，取材困难，并且这些指标与疾病复发之间的关系并未得到大样本验证，缺乏有力证据。我们通过对两个中心的患者血清样本miRNA进行筛选出有效的预测疾病复发的血清学分子标志物，解决临床目前面临的重要问题，通过在疾病初期筛选出易复发人群，从而进行更加密切的随访以及给与更强化的治疗。另外，这些miRNAs的发现对于进一步研究miRNA与结直肠癌术后复发之间分子了机制研究、分析miRNA在复发中的作用、实现靶向miRNA的结直肠癌治疗与实现肿瘤的分子诊断及靶向治疗具有极重要的临床应用潜力和价值。
附图说明
图1为本发明的主要流程图。
图2肿瘤负荷的miRNAs诊断指标。
A图.miR‐145在非癌、术前结直肠癌和术后结直肠癌患者血清中的表达情况；B图.miR‐17‐3p在非癌、术前结直肠癌和术后结直肠癌患者血清中的表达情况；C图.miR‐106a在非癌、术前结直肠癌和术后结直肠癌患者血清中的表达情况。
图3II、III期结直肠癌相关miRNAs的ROC曲线分析。
A图.术前结直肠癌患者和正常人之间的诊断性分析；B.结直肠癌患者术前和术后的诊断性分析。
图4miR-17-3p和miR-106a的表达水平在两个中心样本中的生存相关性分析。
A图.miR‐17‐3p在天津肿瘤医院样本中的生存相关性分析；B图.miR‐106a在天津样本中的生存相关性分析；C图.miR‐17‐3p在湘雅医院样本中的生存相关性分析；D图.miR‐106a在湘雅医院样本中的生存相关性分析；E图.miR‐17‐3p在两个医院混合样本中的生存相关性分析；F图.miR‐106a在两个医院混合样本中的生存相关性分析。
图5miR-17-3p和miR-106a与结直肠癌化疗收益的相关性分析。
A图.miR‐17‐3p和miR‐106a与Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者化疗受益的相关性分析；B图.miR‐17‐3p和miR‐106a与Ⅱ期结直肠癌患者化疗受益的相关性分析；C图.miR‐17‐3p和miR‐106a与Ⅲ期结直肠癌患者化疗受益的相关性分析。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1 标本的收集
我们从天津肿瘤医院，湘雅医院共收集了100例II期、75例III期结直肠癌肿瘤患者的血清，具体信息见下：
表1样本信息表
实施例2 II、III期异miRNA表达谱初筛
最初筛选阶段，通过分别对20例Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌手术前、手术后混合血清(样本来自天津医科大学附属肿瘤医院)及20例正常对照的混合血清(样本来自***总医院)进行低密度芯片检测，初筛出一组差异表达的miRNA。结果发现，共有126种存在表达差异的miRNAs(详见表2、3、4)。
表2低密度芯片初筛出的正常人与II、III期结直肠癌患者手术前之间表达差异的miRNAs
表3低密度芯片初筛出的II、III期结直肠癌患者手术前、后表达差异的miRNAs
表4低密度芯片初筛出的正常人与II、III期结直肠癌患者手术前、后之间表达差异的miRNAs
实施例3：血清中miRNA的实时荧光定量PCR实验(TaqMan探针法)
采用定量PCR方法对批量标本逐个验证，从低密度芯片测序方法初筛出的miRNA中筛选出表达差异显著miRNA。
定量PCR(real‐time PCR)的实验原理及实验步骤同RT‐PCR一样。仪器使用的是ABI Prism7300荧光定量PCR仪。
(1)酚/氯仿法提取血清总RNA
a)取100ul样品加入到300ul水中，充分混匀后加入200ul(PH＝4.7‐5.5)酸性酚，剧烈震荡混匀，室温静置2min后加入200ul氯仿，再次充分震荡，室温静置5min后12000g室温离心15min
b)小心吸取上清液(约400ul)加入到800ul异丙醇中，再加入PH＝5.2的3M醋酸钠40ul,充分混匀后‐20℃静置30min，16000g，4℃离心20min
c)充分弃上清后，加入75％DEPC‐乙醇1ml，轻柔颠倒数次，16000g，4℃离心10min
d)充分弃上清，室温干燥后，加入40ul DEPC水溶解沉淀，得到RNA样品
(2)制备cDNA样品：将上一步得到的RNA样品通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括2μl 5×AMV buffer、1μl 10mM each dNTP mixture(Takara公司)、0.5μlAMV(Takara公司)、4ulDEPC水、0.5μl反向引物(ABI公司)以及2ul RNA样品。反应步骤为16℃孵育30min，42℃反应30min，85℃孵育5分钟
(3)qRT‐PCR：用20ul体系进行qRT‐PCR，体系包括14.77ul H2O，2μl 10×PCR buffer(Takara公司)，1.2μl 25mM MgCl2(Takara公司)，0.4μl 10mM each dNTP mixture(Takara公司)，0.3ulTaq酶(Takara公司)，0.33ul TaqMan探针(ABI公司)，1ul cDNA。所用的仪器是ABI Prism7300荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。
(4)标准曲线的制备：将合成的10nM miR‐16的成熟体RNA(Takara公司)按(2)中相同的逆转录体系逆转录成cDNA。将所得miR‐16的cDNA用水按10倍梯度稀释100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍，得到一组cDNA。将这组cDNA按(3)中相同的qRT‐PCR体系并且与(3)中的cDNA在同一块PCR板上进行荧光定量PCR
(5)数据分析与处理：扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，然后根据标准品miR‐16的浓度及每个浓度对应的CT值绘制标准曲线，并根据此标准曲线及待测样本的CT值计算出该样本所需测定的miRNA的绝对含量。
实施例4：定量PCR方法对初筛出的血清miRNA复筛
用定量PCR方法(TaqMan探针法)对一组受试者标本进行逐个检测，从低密度芯片方法初筛出的22种miRNA中筛选出20例正常对照组与20例手术前后II、III期结直肠癌患者之间表达差异显著的miRNA(具体步骤参见实施例2)。结果发现，初筛出的22种miRNA中有3种miRNA在3组样本间存在差异(绝对含量表示方法为均值±标准差，p<0.001)，这3种miRNA是miR‐106a、miR‐17‐3p和miR‐145(见表5)。
表5定量PCR方法复筛出的miRNA
1结直肠癌患者手术前后差异表达
2结直肠癌患者与正常对照间差异表达
实施例5：定量PCR方法对复筛出的血清miRNA的临床验证
将复筛出的3种miRNA进一步用定量PCR方法在大批量临床标本中进行验证，筛选出稳定的、表达差异显著的miRNA。我们选取了65例来自天津肿瘤医院的手术前后的II、III期结直肠癌病人血清及40例非癌对照血清、90例来自湘雅医院的II、III期结直肠癌病人血清及70例非癌对照血清。验证结果如图2所示，复筛出的3种miRNA中的miR‐17‐3p和miR‐106a在大批量II、III期术前结直肠癌患者血清中的表达量要显著高于正常人和对应的术后患者，而miR‐145则显著低于正常人和术后患者。
实施例6：筛选出的miRNA临床价值评估
绘制ROC曲线和计算曲线下面积(AUC)评估筛选出的miRNA对结直肠癌诊断的准确性，并与目前临床上使用的肿瘤标志物CEA进行比较。结果如图3所示，miRNA‐145,miRNA‐106a及miRNA‐17‐3p 3种miRNA用于结直肠癌的诊断，诊断的灵敏度为83％，特异度为80％，AUC为0.85，明显优于血清CEA的检测(灵敏性60‐70％)。利用血清学miRNA表达谱系，有望用于结直肠癌早期诊断，较传统诊断方法优势显著。此外联系患者生存资料发现，miR‐17‐3p及106a的水平与疾病复发相关，高水平miR‐17‐3p和miR‐106a患者提示高水平预示不良预后，更易发生疾病复发(图4和图5)。
实施例7：用于检测血清miRNA的试剂盒
用于检测食管癌的血清miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程是基于低密度芯片技术和定量PCR技术所测结果，将下述TaqMan探针组合：SEQ ID NO：1～3分别收集到PCR试剂盒(RT‐PCR或Real‐time PCR)中制备特定TaqMan探针组合的结直肠癌检测试剂盒。
所述试剂盒的具体组成(每份标本)如下：
所制备试剂盒的具体操作流程如下：
(1)收集受试者的血清样本，提取RNA后逆转录制备cDNA样品；
(2)按照上述配方加样；
(3)进行PCR反应，条件为95℃5min，95℃15s，60℃1min，40个循环。
首先通过低密度芯片技术初筛，然后通过定量PCR技术进一步筛选在疾病及正常生理状态下表达量差异程度大的一组血清miRNA，作为检测结直肠癌的TaqMan探针。该试剂盒包括本发明所提供的血清miRNA TaqMan探针，Taq酶以及dNTP等试剂。所述试剂盒的价值在于以特定的TaqMan探针组合检测血清miRNA表达量，不仅可提高结直肠癌检测的特异性、准确性，有助于该病的早期发现，还可以用于结直肠癌生存期和治疗预后的判断。因此，该试剂盒投入实践使用可以把疾病的诊断和治疗推上一个新高度。
Claims (9)
1.一种用于检测II、III期结直肠癌的miRNA组合，其特征在于该miRNA组合包括下列miRNA：miR‐17、miR‐106a、miR‐145中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的miRNA组合，其特征在于该miRNA组合由miR‐17、miR‐106a和miR‐145中的任意两种或三种组成。
3.根据权利要求2所述的miRNA组合，其特征在于该miRNA组合由miR‐17和miR‐106a组成。
4.一种用于检测II、III期结直肠癌的miRNATaqMan探针组合物，其特征在于该探针组合包括权利要求1～3中任一项所述miRNA的TaqMan探针。
5.根据权利要求4所述的TaqMan探针组合物，其特征在于所述TaqMan探针组合物由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的任意两种或三种TaqMan探针组成。
6.权利要求1～3中任一项所述的miRNA组合在制备II、III期结直肠癌诊断和/或预后试剂或工具中的应用。
7.权利要求4或5中任一项所述的TaqMan探针组合物在制备II、III期结直肠癌诊断和/或预后试剂或工具中的应用。
8.一种用于II、III期结直肠癌诊断和/或预后的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求4或5中所述的TaqMan探针组合物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP、氯化镁和不含Mg2+的10×PCR缓冲液。
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