CN103074430B

CN103074430B - 检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN103074430B
Application number: CN2013100121694A
Authority: CN
Inventors: 王传新; 张欣; 刘益民
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2013-01-14
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-01-14
Also published as: CN103074430A

Abstract

本发明公开了一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及检测方法，能够快速、简便、准确的检测膀胱癌尿液中miRNA-155的表达量。该专用试剂盒包括检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用逆转录引物和检测引物以及RNA分离液；RNA分离液由2.5%吐温20、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、1mmol/L乙二胺四乙酸和1%牛血清白蛋白组成。本发明为膀胱癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。

Description

检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒，以及检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

膀胱癌是泌尿生殖***中最常见的恶性肿瘤，在我国的发病率和死亡率均占男性泌尿生殖***肿瘤的首位，且呈逐年上升趋势。膀胱癌患者初诊时30％已发生肌层浸润，而在非肌层浸润性膀胱癌患者中，仍有30%会复发为浸润性膀胱癌。早期诊断和早期治疗是预防和控制膀胱癌的关键。目前临床上诊断膀胱癌主要依赖于膀胱镜、尿脱落细胞学和影像学检查等。膀胱镜是膀胱癌诊断的常用方法，可造成不同程度的尿道和膀胱损伤以及感染等并发症；尿脱落细胞学检查具有非侵入性、特异性高等优点，其敏感性低于50%，对早期患者仅为30%，易受检测者主观因素的影响；CT和超声检查是目前诊断膀胱癌及术前分期最常用的影像学检查方法，但对膀胱内较小病变不易发现，对膀胱癌分期预测受到一定限制。寻找敏感性、特异性高的早期诊断生物标志物，建立一种经济准确、安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是目前关注的焦点。

miRNAs是在真核生物中发现的一类具有调控功能的内源性非编码小分子RNA，其通过对mRNA的完全和部分配对结合，降解mRNA或干扰mRNA的翻译，在转录后水平调控特定基因的表达，从而对细胞增殖、分化与凋亡起到精细调节的作用。近年来研究发现，尿液中存在丰富稳定的miRNAs，其与泌尿***恶性肿瘤的发生、发展密切相关，为肿瘤的无创性诊断开辟了一条新的途径。并且，随着分子生物学技术的发展，通过实时荧光定量PCR方法检测尿液中微量的miRNAs已成为可能。所谓实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时监测PCR的进程，最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析。由于该技术操作简便、敏感性高、重复性好，目前已在核苷酸检测领域得到广泛应用。

miRNA-155为癌基因BIC的表达产物，其在造血细胞分化、免疫、肿瘤及心血管等疾病各种生理或病理过程中起着重要的调控作用。2005年Iorio应用微阵列芯片技术首次筛选出乳腺癌异常表达的miRNAs谱，发现miRNA-155是上调最明显的miRNAs之一。Zhu等发现miRNA-155的表达水平较正常乳腺组织显著上调，并且其与乳腺癌的TNM分期、***转移、***受体、孕激素受体呈明显相关。近年来，随着研究的不断深入，发现miRNA-155在肺癌、胰腺癌、肾癌以及头颈部肿瘤中表达均明显升高，并且与肿瘤细胞的增殖、浸润及转移具有密切关系，表明miRNA有可能成为一种良好的肿瘤标志物分子。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒及检测方法，能够快速、简便、准确的检测膀胱癌尿液中miRNA-155的表达量。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，包括：

（1）miRNA-155的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示：

miRNA-155-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’；

miRNA-155-F：5’-CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’；

miRNA-155-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

（2）miRNA-191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示：

miRNA-191-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’；

miRNA-191-F：5’-GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’；

miRNA-191-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

（3）miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示：

miRNA-16-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’；

miRNA-16-F：5’-CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’；

miRNA-16-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，包括上述引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下：吐温20：2.5%（体积百分数），三羟甲基氨基甲烷：50mmol/L，乙二胺四乙酸：1mmol/L，牛血清白蛋白：1%（质量百分数）。

所述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由1×Syber Green Ⅰ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。

优选的，各物质的浓度如下：DNA聚合酶：100U/mL；dNTPs：0.2mM；氯化镁：6mM；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16.5mM；氯化钾：89.3mM。

上述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。

上述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。

一种检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法，步骤如下：

（1）分离尿液标本上清液，与等体积的RNA分离液混合，1600g离心5分钟，之后16000g离心10分钟，分离上清；

（2）RT-PCR扩增：将上述分离的上清液进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加入引物和PCR反应液，进行PCR反应，检测样本阈值Cq（Test sample）；同时以人膀胱癌细胞株T24细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心）中提取miRNAs，逆转录成cDNA作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参基因miRNA-191、miRNA-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法相同；

（3）制作标准曲线：上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=10^（-1/S）-1，计算扩增效率E；

（4）计算：选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq（T）和校对样本阈值Cq（C），根据公式Q=（E+1）^-△Cq，△Cq=[Cq（T）-Cq（C）]，得出基因的校正起始拷贝数Q；将miRNA-155的Q值与内参基因miRNA-191、miRNA-16的Q值的几何平均数相比，得到miRNA-155的相对表达量。

本发明的有益效果是，本发明建立的膀胱癌尿液miRNA-155检测方法，为膀胱癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。

本发明利用RNA分离液对尿液样本进行处理，得到的混合液直接用于逆转录反应，省略了对尿液样本RNA的提取过程，不仅简化了操作步骤，降低了检测成本，还避免了传统方法提取RNA降解的问题。

本发明使用了表达相对稳定的miRNA-191、miRNA-16作为内参基因，对标本中的miRNA-155进行相对定量分析，避免了单一内参基因表达不稳定对结果产生的影响。

本发明根据公式E=10^（-1/S）-1，计算扩增效率（E），根据公式Q=（E+1）^-△Cq计算miRNA-155基因相对miRNA-191、miRNA-16的表达量，避免了传统2^-△△Cq法必须要求PCR扩增效率为100%的限制，使结果分析更加可靠。

附图说明

图1（A）为miRNA-16的标准曲线；图1（B）为miRNA-191的标准曲线；图1（C）为miRNA-155的标准曲线；

图2为尿液miRNA-155在26例膀胱癌患者和20例健康对照者中的相对表达水平；

图3为血清miRNA-155检测对膀胱癌诊断的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

（1）试剂盒的组成及配制：

根据microRNA数据库（http://www.mirbase.org/）上报的核苷酸序列miRNA-155（MIMAT0000646）、miRNA-191（MIMAT0000440）、miRNA-16（MIMAT0000069）为模板，自主设计的检测目标基因（miRNA-155）和内参基因（miRNA-191和miRNA-16）的引物，其引物序列、Tm值见表1。

表1引物序列、Tm值

所述专用试剂盒还包括RNA分离液；RNA分离液由2.5%（体积百分数）吐温20、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、1mmol/L乙二胺四乙酸、1%（质量百分数）牛血清白蛋白和水组成。

所述专用试剂盒还包括PCR反应液：由1×Syber GreenⅠ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。

各物质的浓度如下：DNA聚合酶：100U/mL；dNTPs：0.2mM；氯化镁：6mM；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16.5mM；氯化钾：89.3mM。

（2）标本采集

采集26例膀胱癌患者和20例健康对照者尿液2mL，1600g离心5分钟，进一步16000g离心10分钟，分离上清，保存于-80℃待测。所有样本均在取得受试者同意的情况下进行。将分离上清液3μL与RNA分离液3μL混合，16000g离心10分钟，分离上清，将上清1:10稀释用于逆转录模板。

（3）RT-PCR扩增

采用Takara公司的

miRNA cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒、本发明的逆转录引物对上述mRNA进行反转录成cDNA，取5μLcDNA为模板，进行PCR反应。

PCR反应体系：

模板DNA：5μL

PCR反应液：12.5μL

上游引物（10μM）：1μL

下游引物（10μM）：1μL

无菌水：5.5μL

反应条件为：37℃→20分钟，95℃→10分钟；（95℃15秒，60℃1分钟）→40个循环。

内参基因miRNA-191、miRNA-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法同上。

（4）标准曲线制作

将从人膀胱癌细胞株T24细胞中提取的miRNAs，逆转录成cDNA，然后10倍梯度稀释成5个浓度，作为标准品，同待测样本一同进行RT-PCR扩增，制作标准曲线。

（5）结果判断

1）拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=10^（-1/S）-1，计算扩增效率E；

2）选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq（T）和校对样本阈值Cq（C），根据公式Q=（E+1）^-△Cq，△Cq=[Cq（T）-Cq（C）]，得出基因的校正起始拷贝数Q；将miRNA-155的Q值与内参基因miRNA-191、miRNA-16的Q值的几何平均数相比，得到miRNA-155的相对表达量。

（6）检测结果

1）、标准曲线见图1。

2）、26例膀胱癌患者、20例健康对照者尿液miRNA-155检测结果见图2。膀胱癌、健康对照者尿液miRNA-155中位水平分别为1.332（0.643～2.942）、-0.115（-0.933～0.723）。膀胱癌患者尿液miRNA-155水平明显高于健康对照者，差异具有统计学意义（P<0.05）。

3）、膀胱癌尿液miRNA-155检测方法对膀胱癌的诊断价值分析

以26例膀胱癌患者作为膀胱癌组，20例健康对照者作为非膀胱癌组，采用SPSS13.0统计学软件中的受试者工作曲线分析，得出尿液miRNA-155检测膀胱癌的临界值为0.481，敏感性为84.62%，特异性为85.00%，诊断效能为0.896（见图3），说明尿液miRNA-155对膀胱癌具有较大的诊断价值。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，其特征在于，包括检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下：吐温20：2.5%，三羟甲基氨基甲烷：50mmol/L，乙二胺四乙酸：1mmol/L，牛血清白蛋白：1%；还包括PCR反应液，所述PCR反应液由Syber GreenⅠ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成，其中，各物质的浓度如下：DNA聚合酶：100U/mL；dNTPs：0.2mM；氯化镁：6mM；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16.5mM；氯化钾：89.3mM；

其中，所述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，包括：

miRNA-155-RT：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’；

miRNA-155-F：5’-CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’；

miRNA-155-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

（2）miRNA-191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示

miRNA-191-RT：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’；

miRNA-191-F：5’-GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’；

miRNA-191-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

3）miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示：

miRNA-16-RT：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’；

miRNA-16-F：5’-CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’；

miRNA-16-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。