CN106148529B - 与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒与应用 - Google Patents

与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒与应用。该LncRNA标记物命名为LINP1，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1所示，用于检测LINP1的引物，其上游引物(LINP1‑F)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.2所示，其下游引物(LINP1‑R)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.3所示。本发明提出的LINP1是与胃癌特别相关的长链非编码RNA，LINP1表达量可以从组织中被高特异性地检测出，检测操作简便，定量准确，有助于临床判断胃癌患者术后的复发率与预后效果的好坏，还能用于胃癌治疗药物的筛选，对于新药开发提供帮助。

Description

与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试 剂盒与应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种长链非编码RNA(LncRNA)标记物及其应用，特别是涉及一种与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒与应用。
背景技术
胃癌是常见恶性肿瘤之一，全世界每年新发胃癌近一百万例，中国约占一半左右。胃癌的死亡率高居癌症相关死亡率的第三位，我国胃癌的年龄标准化的5年相对生存率只有27.4％，严重威胁人民健康。尽管近年来新辅助化疗等综合治疗模式取得了长足进展，但手术仍是胃癌最主要的治疗手段，但是，术后的复发和转移是影响患者生存的重要因素，是临床难题。因此，如果能尽早预测复发或转移，并采取必要的治疗干预措施，无疑会使患者生存获益。
影响胃癌预后的因素很多，目前判断胃癌预后的主要方法还是传统的国际抗癌联盟(Tumor-Node-Metastasis，TNM)分期方法，以预估无复发生存时间。但在临床工作中，经典的TNM分期无法解释分期相同而预后差异明显的情况，而且不能对术后早期复发进行判断。目前，临床工作者正完善第八版胃癌TNM分期***以评估预后。与此同时，基础研究人员也从肿瘤异质性方面来考虑，寻找新的判断预后的分子指标，作为TNM病理分期***的补充。胃癌的发生、发展涉及癌基因和抑癌基因的突变，也涉及表观遗传等的改变。因此，对于胃癌诊断和预后有关的分子生物学标记物研究已成为研究重点。
目前，胃癌肿瘤分子标记物的研究报告很多，除传统意义的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)等以外，目前研究热点分子标记物HER2等对胃癌预后判断也具有一定的意义，但是以上分子标记物多集中于对不同肿瘤分期的研究，以及***转移、浸润深度的影响，缺乏相同病理分期、同种术式及术后治疗方案而预后不同的分子标记物研究，缺乏特异性和灵敏度高的分子标记物来预测胃癌的发生、发展和预后。
长链非编码RNA(LncRNA)是指长度大于200bp的核苷酸，具有基因表达调节功能的不能编码产生蛋白质的一类RNA。LncRNA参与了胃癌的发生、发展、侵袭和转移等生物学行为，其作用方式有表观遗传调控、转录水平调节和转录后水平调节。如能筛选出胃癌术后早期复发和预后特异或异常表达的LncRNA作为生物标记物，开发出相关试剂与试剂盒，能准确检测该LncRNA生物标记物的表达量，将对胃癌术后早期复发和预后的预测产生有力的推动。另外，异常表达的LncRNA能影响胃癌细胞的迁移与转移，有助于发现具有潜在治疗价值的小分子药物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种提供与胃癌相关的LncRNA标记物。
本发明所提供的与胃癌相关的LncRNA标记物，命名为LINP1，其与胃癌术后复发和预后特别相关，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1所示，或与序列表中SEQ ID NO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与胃癌术后复发和预后相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQ IDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测该LncRNA标记物LINP1的引物。
本发明所提供的用于检测标记物LINP1的引物，其上游引物(LINP1-F)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.2所示，其下游引物(LINP1-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.3所示。
为方便检测，可将GAPDH作为内参，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.4所示，用于检测GAPDH内参的引物，其上游引物(GAPDH-F)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.5所示，其下游引物(GAPDH-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.6所示。
本发明的第三个目的是提供一种检测标记物LINP1表达量的试剂盒。
本发明的所提供的检测标记物LINP1表达量的试剂盒，包括上述标记物LINP1的引物和用于检测GAPDH内参的引物。
具体来讲，所述试剂盒包括以下用于20μL PCR反应体系的试剂：2×聚合酶链反应预混液(包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBRGreen I)11μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL。
本发明的第四个目的是提供一种非诊断用途的检测标记物LINP1表达量的方法。
本发明所提供的检测标记物LINP1表达量的方法，可包括以下步骤：
1)提取待测肿瘤组织和正常组织的总RNA，逆转录合成cDNA；
2)以cDNA为模板，在引物LINP1-F和LINP1-R的引导下进行LncRNA标记物LINP1的实时荧光定量PCR检测，在引物GAPDH-F和GAPDH-R的引导下进行GAPDH内参的实时荧光定量PCR检测；
3)采用相对定量法计算LncRNA标记物LINP1的表达量，计算公式为F＝2-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(肿瘤组织中LINP1的ct平均值-肿瘤组织中GAPDH的ct平均值)-(对照正常组织中LINP1的ct平均值-对照正常组织中GAPDH的ct平均值)。
在上述检测方法中，所述步骤2)的20μL PCR反应体系为：2×聚合酶链反应预混液(包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR GreenI)11μL，cDNA 1μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL；PCR反应条件为：先95℃30秒；然后95℃5秒，60℃30秒，共40个循环。
以上所述引物LINP1-F和LINP1-R、所述引物GAPDH-F和GAPDH-R以及所述试剂盒在检测LncRNA标记物LINP1表达量中的应用也属于本发明内容。
本发明与胃癌相关的LncRNA标记物LINP1和检测LINP1表达量的试剂盒能用于胃癌术后复发率和预后效果的判断，也可以用于胃癌治疗药物的筛选，非诊断目的的应用属于本发明内容。
应用一为所述的LncRNA标记物LINP1在胃癌术后复发率和预后效果判断中的应用，该应用为检测LINP1表达量，以该表达量数值与一界值比较后做出复发率和预后效果判断，若LINP1表达量＜7.65，复发率高，预后差，若LINP1表达量＞7.65，复发率低，预后好。本发明不包括将LINP1的表达量作为是否患胃癌的直接判断指标的限定。
应用二为所述的LncRNA标记物LINP1在筛选胃癌治疗药物中的应用，该应用为检测LINP1表达量，以该表达量数值与一界值比较后做出药物敏感评价，若LINP1表达量＜7.65，表明受体对该药物不敏感，该药物不被推荐；若LINP1表达量＞7.65，表明受体对该药物敏感，该药物被推荐。
综上，本发明提供了一种与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒及应用。本发明具有以下优点：
1)提出的LINP1是与胃癌特别相关的长链非编码RNA，LINP1表达量可以从组织中被高特异性地检测出，有助于临床判断胃癌患者术后的复发率与预后好坏。
2)操作简便，定量准确。
3)LINP1还能用于胃癌治疗药物(特别是小分子药物)的筛选，结合动物模型或临床数据用于评价受体对药物的敏感性，对于新药开发提供帮助。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为与胃癌相关的LncRNA标记物LINP1表达量的检测结果；
图2为LINP1表达量的ROC曲线；
图3为LINP1表达量的病人无复发生存曲线；
图4为实施例5中与胃癌相关的LncRNA标记物LINP1表达量的检测结果；
图5为实施例5中LINP1表达量的ROC曲线。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物由上海生工公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、获得与胃癌相关的LncRNA标记物LINP1、GAPDH内参及其检测引物
一、与胃癌相关的LncRNA标记物LINP1及其检测引物设计
本发明所提供的与胃癌相关的LncRNA标记物，命名为LINP1，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1所示。
LINP1的筛选过程如下：
1.选择相同病理分期、手术方案和术后治疗但预后截然不同患者的肿瘤组织样本，同时选取同一病人癌灶边缘5cm以上正常组织作为对照。
2.提取肿瘤组织和正常对照的RNA。
3.逆转录得到cDNA。
4.将逆转录产物进行实时荧光定量PCR反应，筛选存在明显差异的LncRNA，进行LncRNA表达统计分析，最终优选得到LINP1，参见序列表中SEQ NO.1。
依据LINP1标记物，本发明进一步确定用于检测标记物LINP1的引物，引物序列如下：
上游引物(LINP1-F)：5'-agccggtccagtacaccttt-3'(序列表中SEQ NO.2)
下游引物(LINP1-R)：5'-ggaaagcaccgtctgttgtt-3'(序列表中SEQ NO.3)。
二、GAPDH内参及其检测引物设计
为方便检测，本发明可将GAPDH作为内参，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.4所示。
用于检测GAPDH内参的引物，引物序列如下：
上游引物(GAPDH-F)：5'-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3'(序列表中SEQ NO.5)
下游引物(GAPDH-R)：5'-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3'(序列表中SEQ NO.6)。
实施例2、检测标记物LINP1表达量
本发明所提供的检测标记物LINP1表达量的方法，包括以下步骤：
1)提取待测肿瘤组织和正常组织的总RNA，逆转录合成cDNA，具体步骤如下：
1.1选择样本
选取解放军总医院2005-2006年间收治的病理分期相同、预后生存有明显差异的50例石蜡标本，此50例标本均是原发病灶首次切除肿瘤样本制作的石蜡。50例病例，术前经物理检查及影像学诊断无远处转移，术前未接受放射治疗或化学治疗等，均采用开放根治性手术治疗，术后病理学检查为溃疡型低分化腺癌，侵及肌层，无***转移，根据国际抗癌联盟第七版分期标准，50例均为T2N0M0，临床分期为IB期，但预后存在明显差别，25例5年后健在，25例5年后死亡。
1.2使用Trizol法提取石蜡包埋肿瘤组织和正常组织中的总RNA，操作按照 Reagent试剂盒(购自Life Technologies)的说明书进行。用分光光度计分别测定230,260,280处光吸收度值，确定总RNA的纯度和浓度。
1.3使用逆转录试剂盒(购自Takara公司)进行逆转录反应，操作按照试剂盒说明书进行，10μL反应体系包括：2μL 5×PrimeScript Buffer，0.5μL PrimeScript RT EnzymeMix I，0.5μL 50μM Oligo dT Primer，0.5μL 100μM Random 6mers，1.5μL RNA，补无RNA酶水至10μL，反应条件为：37℃15分钟，然后85℃5秒，最后置于4℃。反应完成后，将逆转录产物放置于冰上备用。
2)以cDNA为模板，在引物LINP1-F和LINP1-R的引导下进行LncRNA标记物LINP1的实时荧光定量PCR检测，在引物GAPDH-F和GAPDH-R的引导下进行GAPDH内参的实时荧光定量PCR检测，20μL PCR反应体系为：2×聚合酶链反应预混液(包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I)11μL，cDNA 1μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL；PCR反应条件为：先95℃30秒；然后95℃5秒，60℃30秒，共40个循环。
3)采用相对定量法计算LncRNA标记物LINP1的表达量，计算公式为F＝2-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(肿瘤组织中LINP1的ct平均值-肿瘤组织中GAPDH的ct平均值)-(对照正常组织中LINP1的ct平均值-对照正常组织中GAPDH的ct平均值)。
检测结果如图1所示，LINP1在胃癌术后5年健在、预后较好的标本上调，其表达量为12.86±2.51，LINP1在胃癌术后早期复发、预后较差的样本中下调，其表达量为4.27±1.26，差异具有统计学意义。
构建ROC曲线，如图2所示(图中带点曲线与方框上界限及左界限重合，带点曲线即为ROC曲线；7.65是曲线弧顶的点，即最靠近正方形左上角的点，在软件中算出)，以7.65为界值，可以很好区分同一分期中预后较好和预后不好的病人，其敏感度达到了100％。
结论：若LINP1表达量＜7.65，复发率高，预后差；若LINP1表达量＞7.65，复发率低，预后好。
实施例3、LINP1表达量与胃癌术后复发的危险度评分方法分析
用SPSS 22.0软件对实施例2的检测结果建立数据库并进行分析，应用Kaplan-Meier分析LINP1表达量的病人无复发生存曲线。
结果如图3所示，以P<0.05作为检验水准，可以看出LINP1表达较高时，病人存活时间更长，相反，LINP1表达较低时，病人存活时间相对较短，表明LINP1表达量与病人无复发生存时间具有显著的相关性(P＝0.017)。
对胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度以及LINP1表达和无复发生存时间进行COX单因素相关性分析。分析结果如表1所示，可以看出肿瘤越大，分化程度越低，LINP1表达低是病人预后不良危险因素，也即有以上因素之一时，患者生存时间更短，表明肿瘤大小、分化程度以及LINP1表达量与患者复发生存时间显著相关。
表1 胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度以及LINP1表达和无复发生存时间的COX单因素相关性分析结果
将上述有统计学意义的指标纳入COX多因素分析模型。分析结果如表2所示，可以看出经过多因素校正后，低分化程度和低LINP1表达时，患者生存时间更短，LINP1低表达是患者无复发生存时间的不良预后因子，其危险度为1.663。
表2 胃癌患者肿瘤大小、分化程度以及LINP1表达和无复发生存时间的COX度因素相关性分析结果
实施例4、制备检测标记物LINP1表达量的试剂盒
本发明的所提供的检测与胃癌相关的LncRNA标记物LINP1表达量的试剂盒，包括上述标记物LINP1的引物和用于检测GAPDH内参的引物。
所述试剂盒还包括以下用于20μL PCR反应体系的试剂：2×聚合酶链反应预混液(包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR GreenI)11μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL。
本发明试剂盒的使用方法参见实施例2。
实施例5、LINP1标记物在胃癌治疗药物筛选中的应用
选择样本：选择2013年至2014年间接受新辅助化疗患者20人，其中10人对化疗药物敏感获得了病理学完全缓解，10人对化疗药物不敏感病理学评价为疾病进展。取两组人群接受化疗前的肿瘤组织，用本试剂盒检测组织中LINP1的表达量，使用方法参见实施例2。
检测结果如图4所示，LINP1在对化疗药物敏感的患者中表达上调，其表达量为9.82±0.89，LINP1在对化疗药物不敏感的患者中表达下调，表达量为4.85±0.67，差异具有统计学意义。
构建ROC曲线，如图5所示(同图2说明)，同样以7.65为界值，可以很好区分对药物敏感和对药物不敏感患者，其敏感度达到了90％。
结论：若LINP1表达量＜7.65，患者对化疗药物不敏感，不推荐使用该化疗药物；若LINP1表达量＞7.65，患者对化疗药物敏感，推荐使用该化疗药物。
利用本实施例的方法，可以结合动物模型对不同的化疗药物进行筛选，检测动物模型(受体)的LINP1表达量，以该表达量数值与一界值比较后做出药物敏感评价，若LINP1表达量＜7.65，表明受体对该药物不敏感，该药物被过滤掉而不被推荐；若LINP1表达量＞7.65，表明受体对该药物敏感，该药物被选中而被推荐。由此可以帮助药物研发人员先期获取有潜在价值的新药。

Claims (7)

1.LncRNA LINP1在制备与胃癌预后相关的LncRNA标记物中的应用，所述LncRNA LINP1的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1所示，所述LncRNA LINP1的表达量采用相对定量法计算，计算公式为F＝2-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(肿瘤组织中LINP1的ct平均值-肿瘤组织中GAPDH的ct平均值)-(对照正常组织中LINP1的ct平均值-对照正常组织中GAPDH的ct平均值)；若LINP1的表达量＜7.65，复发率高，预后差；若LINP1表达量＞7.65，复发率低，预后好。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LncRNA LINP1的表达量通过试剂盒检测，其中所述试剂盒包括用于检测所述LncRNA LINP1的引物，其上游引物LINP1-F的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.2所示，其下游引物LINP1-R的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测所述LncRNALINP1的表达量所用GAPDH内参的引物，其上游引物GAPDH-F的核苷酸序列如序列表中SEQNO.5所示，其下游引物GAPDH-R的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.6所示，所述GAPDH内参的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括以下用于20μL PCR反应体系的试剂：2×聚合酶链反应预混液11μL，10μM的上游引物1μL，10μM的下游引物1μL，无RNA酶水7μL；其中所述2×聚合酶链反应预混液包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测所述LncRNA LINP1的表达量的方法，其中所述方法为非诊断目的的方法，包括以下步骤：
1)提取待测肿瘤组织和正常组织的总RNA，逆转录合成cDNA；
2)以cDNA为模板，在所述引物LINP1-F和LINP1-R的引导下进行LncRNA LINP1的实时荧光定量PCR检测，在所述引物GAPDH-F和GAPDH-R的引导下进行GAPDH内参的实时荧光定量PCR检测；
3)采用相对定量法计算LncRNA LINP1的表达量，计算公式为F＝2-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(肿瘤组织中LINP1的ct平均值-肿瘤组织中GAPDH的ct平均值)-(对照正常组织中LINP1的ct平均值-对照正常组织中GAPDH的ct平均值)。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中PCR反应条件为：先95℃30秒；然后95℃5秒，60℃30秒，共40个循环。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为利用所述LncRNA LINP1的表达量进行筛选胃癌治疗药物的应用，以该表达量数值与一界值比较后做出药物敏感评价，若LncRNA LINP1的表达量＜7.65，表明受体对该药物不敏感，该药物不被推荐；若LncRNALINP1的表达量＞7.65，受体对该药物敏感，该药物被推荐。
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