CN104906581A - 神经浸润抑制剂 - Google Patents

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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
National Cancer Center Japan
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Abstract

本发明人等发现：在胰腺癌的神经浸润模型中，通过抑制IL-6，神经浸润得到抑制，从而完成了本发明。进一步明确了：IL-6受体在人胰腺癌细胞株中表达、以及IL-6使胰腺癌细胞的趋化能力、迁移能力和细胞内信号亢进，发现通过抑制IL-6可以治疗胰腺癌。进一步发现：通过对小鼠神经浸润模型给予IL-6抑制剂，可以抑制人胰腺癌神经浸润。

Description

神经浸润抑制剂
本申请是申请号为200980131148.6、申请日为2009年6月5日、发明名称为“神经浸润抑制剂”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及神经浸润抑制剂。更详细而言，本发明涉及以白介素6(IL-6)抑制剂作为有效成分的神经浸润抑制剂。
背景技术
白介素6(IL-6)是一种也称作B细胞刺激因子2(BSF2)或干扰素β2的细胞因子。IL-6是作为参与B淋巴细胞类细胞的活化的分化因子被发现的(非专利文献1)，之后明确了其是影响各种细胞的功能的多功能细胞因子(非专利文献2)。有报道称：IL-6诱导T淋巴细胞类细胞的成熟(非专利文献3)。
IL-6在细胞上经由两种蛋白来传递其生物学活性。一种蛋白是IL-6所结合的分子量约80kD的配体结合性蛋白的IL-6受体(非专利文献4、5)。IL-6受体除了以跨膜而在细胞膜上表达的膜结合型受体的形式存在以外，还主要以由其胞外区构成的可溶性IL-6受体的形式存在。
另一种蛋白是参与非配体结合性的信号传递的分子量约130kD的膜蛋白gp130。IL-6和IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合体，然后与gp130结合，从而向细胞内传递IL-6的生物学活性(非专利文献6)。
目前，大多数胰腺癌病例仍以不能切除的进展状态被诊断，而在唯一可以期待治愈的切除病例中，大多数病例往往在术后早期又复发。此外，不能切除、且体力状态(PS)或主要脏器功能良好的病例将采用化学疗法，但即使是目前的标准治疗，其疗效也不充分。例如，即使是位于首选药位置的盐酸吉西他滨，其症状缓和效果的有效率为23.8％，存活期间中位数为5.7个月，1年存活率为18％(海外3期临床试验结果)。在日本，每年有20000人被诊断为胰腺癌，死亡人数达22,260人(2004年厚生劳动省的人口动态调查)，在癌症死因中位于第5位。
迄今为止，本发明人等明确了以下事实：神经浸润是胰腺癌的特征性浸润方式之一，在胰腺癌中几乎100％确认到神经浸润；神经浸润是重要的预后因子；神经浸润导致肝细胞功能异常，与贫血、体力状态(PS)下降或营养不良等恶病质症状有关等。另外，神经浸润被认为是癌症性疼痛等的原因，有些报道称通过对神经浸润好发部位进行放射线照射或切除位于其上位的神经可以使症状得到一定程度的控制。但神经浸润的机理以及由神经浸润引起的症状所表现的机理尚不明确，因此，现实状况是：在神经浸润的控制以及神经浸润所引起的症状的控制方面还缺乏经验。另一方面，不论癌症种类如何，普遍确认到神经浸润，在***癌、胃癌、头颈部癌中，神经浸润作为预后因子被报道。
与本申请的发明相关的先行技术文献信息如下所示。
先行技术文献
非专利文献
非专利文献1：Hirano，T.等人，Nature(1986)324，73-76
非专利文献2：Akira，S.等人，Adv.in Immunology(1993)54，1-78
非专利文献3：Lotz，M.等人，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258
非专利文献4：Taga，T.等人，J.Exp.Med.(1987)166，967-981
非专利文献5：Yamasaki，K.等人，Science(1988)241，825-828
非专利文献6：Taga，T.等人，Cell(1989)58，573-581
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明提供新的神经浸润抑制剂。本发明还提供新的胰腺癌治疗药。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现：在胰腺癌的神经浸润模型中，通过抑制IL-6，神经浸润得到抑制，从而完成了本发明。并进一步明确了：IL-6受体在人胰腺癌细胞株中表达、以及IL-6使胰腺癌细胞的趋化能力、迁移能力和细胞内信号亢进，发现通过抑制IL-6可以治疗胰腺癌。进一步发现：通过对小鼠神经浸润模型给予IL-6抑制剂，可以抑制人胰腺癌神经浸润。
即，更具体而言，本发明提供以下[1]～[32]。
[1]胰腺癌治疗药，其以白介素6(IL-6)抑制剂作为有效成分。
[2]细胞的神经浸润抑制剂，其以IL-6抑制剂作为有效成分。
[3][2]所述的抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[4][3]所述的抑制剂，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。
[5][2]～[4]中任一项所述的抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸润。
[6][1]～[5]中任一项所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结合的物质。
[7][6]所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
[8][7]所述的治疗药或抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[9]胰腺癌的治疗方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
[10]细胞的神经浸润抑制方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
[11][10]所述的方法，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[12][11]所述的方法，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。
[13][10]～[12]中任一项所述的方法，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸润。
[14][9]～[13]中任一项所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结合的物质。
[15][14]所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
[16][15]所述的方法，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[17]IL-6抑制剂在制备胰腺癌治疗药中的应用。
[18]IL-6抑制剂在制备细胞的神经浸润抑制剂中的应用。
[19][18]所述的应用，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[20][19]所述的应用，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。
[21][18]～[20]中任一项所述的应用，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸润。
[22][17]～[21]中任一项所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结合的物质。
[23][22]所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
[24][23]所述的应用，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[25]IL-6抑制剂，该IL-6抑制剂在治疗胰腺癌的方法中使用。
[26]IL-6抑制剂，该IL-6抑制剂在用于抑制细胞的神经浸润的方法中使用。
[27][26]所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[28][27]所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。
[29][26]～[28]中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸润。
[30][25]～[29]中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结合的物质。
[31][30]所述的IL-6抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
[32][31]所述的IL-6抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
附图说明
图1是显示人胰腺癌细胞株中IL-6α受体(IL6R)的mRNA表达量(A)和IL-6β受体(gp130)的mRNA表达量(B)的图。
图2是显示使用人重组IL-6，测定IL-6对人胰腺癌细胞株的增殖能力、趋化能力、迁移能力的影响的结果的图。A和B：显示通过经时性计测细胞数来测定细胞增殖能力的结果；C：显示通过趋化性分析来测定趋化能力的结果；D：显示通过伤口愈合分析来测定迁移能力的结果。
图3是显示使用人重组IL-6(rhIL6)，利用蛋白质印迹法评价IL-6对人胰腺癌细胞株Capan-1的细胞内信号的影响的结果的图。A：显示细胞内磷酸化STAT3蛋白表达、B：显示细胞内磷酸化Erk1/2蛋白表达、C：显示细胞内磷酸化Akt蛋白表达。
图4是显示使用人胰腺癌细胞株的、小鼠神经浸润模型的照片和图。A：显示4周后的神经浸润肉眼图像，B：显示经时性浸润距离的图，C：显示4周后的神经浸润组织图像。
图5是显示在神经浸润模型和各种神经损伤模型中小鼠IL-6表达分布的照片和图。A：显示神经浸润模型图像，B和C：显示通过RT-PCR(B)或荧光免疫染色(C)测定的、神经浸润模型及其他神经损伤模型中的小鼠IL-6表达量。
图6是显示在神经浸润部分胰腺癌细胞的磷酸化STAT3蛋白表达的结果的图。
图7是显示由gp130击倒(knockdown)产生的神经浸润距离抑制效果的图。
图8是显示由IL-6R击倒产生的神经浸润距离抑制效果的图。
图9是显示对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂AG490或抗IL-6受体抗体对神经浸润的影响的图。A：显示给予JAK抑制剂AG490时的经时性浸润距离的图。DMSO：显示对照组、AG490：显示AG490给药组。B：显示给予抗IL-6受体抗体时的经时性浸润距离的图。hIgG：显示对照组、MRA：显示抗IL-6受体抗体给药组。
具体实施方式
在本发明中，“IL-6抑制剂”是指阻断IL-6的信号传递、抑制IL-6的生物学活性的物质。IL-6抑制剂的具体例子有：与IL-6结合的物质、与IL-6受体结合的物质、与gp130结合的物质等。作为IL-6抑制剂，可以列举：抑制作为IL-6的细胞内信号重要的STAT3磷酸化的物质、例如AG490等。对IL-6抑制剂没有特别限定，包括抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6修饰体、可溶性IL-6受体修饰体、IL-6部分肽、IL-6受体部分肽、与上述物质显示出同样的活性的低分子化合物等。
作为IL-6抑制剂的优选方案，可以列举：IL-6受体抑制剂、特别是抗IL-6受体抗体。
对本发明中使用的抗体的来源没有特别限定，但优选来自哺乳动物，更优选来源于人的抗体。
本发明中使用的抗体，可以利用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式得到。作为本发明中使用的抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体有：由杂交瘤产生的单克隆抗体；以及利用基因工程学方法，通过携带抗体基因的表达载体转化宿主，在所得宿主中产生的单克隆抗体。通常，该抗体通过与IL-6、IL-6受体、gp130等结合，阻断向细胞内传递IL-6的生物学活性。
产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可以利用公知技术，如下操作来制作。即，使用IL-6受体、IL-6、gp130等作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，再按照通常的细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，利用通常的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，从而可以制作杂交瘤。
具体而言，制作单克隆抗体时可以如下进行。例如，制作抗IL-6受体抗体时，被用作用于取得抗体的致敏抗原的人IL-6受体使用欧州专利申请公开号EP 325474中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列、而小鼠IL-6受体使用日本专利申请公开号特开平3-155795中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列，从而得到抗IL-6受体抗体。
IL-6受体蛋白有以下两种：在细胞膜上表达的IL-6受体蛋白和从细胞膜上脱离的IL-6受体蛋白(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.等人，J.Biochem.(1990)108，673-676)。可溶性IL-6受体实质上由与细胞膜结合的IL-6受体的胞外区构成，跨膜区或跨膜区和胞内区缺失，这一点不同于膜结合型IL-6受体。只要IL-6受体蛋白能够用作制作本发明中使用的抗IL-6受体抗体的致敏抗原，可以使用任一种IL-6受体。
将IL-6受体的基因序列***到公知的表达载体***中，使适当的宿主细胞转化，之后按照公知方法从其宿主细胞中或培养上清中纯化目标IL-6受体蛋白，可以使用该纯化IL-6受体蛋白作为致敏抗原。此外，可以使用表达IL-6受体的细胞或IL-6受体蛋白与其他蛋白的融合蛋白作为致敏抗原。
同样，使用IL-6作为用于取得抗体的致敏抗原时，通过使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列，从而得到人IL-6。作为取得抗gp130抗体的致敏抗原，可以使用欧州专利申请公开号EP 411946中公开的gp130基因/氨基酸序列。
对用致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定，但优选考虑其与用于细胞融合的亲本细胞的适应性后再进行选择，通常使用啮齿类动物、例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
用致敏抗原对动物进行免疫按照公知方法进行。例如，作为一般的方法，通过向哺乳动物的腹腔内或皮下注射致敏抗原来进行。具体而言，用PBS(磷酸缓冲盐)或生理盐水等稀释致敏抗原至适当量并使之悬浮，根据需要，向所得悬浮物中适量混合通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂，乳化后，优选每4～21天对哺乳动物给药数次。进行致敏抗原免疫时，可以使用适当的载体。
如此地对哺乳动物进行免疫，确认血清中所需抗体水平升高后，从哺乳动物中采集免疫细胞用于细胞融合。作为用于细胞融合的优选的免疫细胞，特别优选使用脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的另一方的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞，优选使用已公知的各种细胞株、例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.等人.J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以按照公知的方法、例如Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等来进行。
更具体而言，例如在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施上述细胞融合。作为融合促进剂，例如使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，为了进一步提高融合效率，根据需要，还可以添加使用二甲基亚砜等辅助剂。
关于免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例，例如优选使免疫细胞为骨髓瘤细胞的1～10倍。用于上述细胞融合的培养液例如可以使用：适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于该种细胞培养的常规培养液。还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补充液。
细胞融合可如下进行：将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，通常再以30～60％(w/v)的浓度添加预先加热至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量为1000～6000左右的PEG溶液，混合，从而形成目标融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加适当的培养液，离心以除去上清，重复进行该操作，从而可以除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。
该杂交瘤通过在常规选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培养液)中培养而进行选择。为了使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，使用该HAT培养液继续培养足够的时间、通常为数天～数周。接着，实施常规的极限稀释法，可以进行产生目标抗体的杂交瘤的筛选和克隆。
除了用抗原对人以外的动物进行免疫以得到上述杂交瘤以外，在体外用所需的抗原蛋白或表达抗原的细胞致敏人淋巴细胞，使致敏B淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，也可以得到与所需的抗原或表达抗原的细胞具有结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878)。而且，对具有完全人抗体基因的所有组成成分(repertoire)的转基因动物给予抗原或表达抗原的细胞，按照上述方法可以获得所需的人抗体(参照国际专利申请公开号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
如此制作的产生单克隆抗体的杂交瘤，可以在常规培养液中进行传代培养，还可以在液氮中长期保存。
为了由该杂交瘤获得单克隆抗体，可以采用以下方法：按照常规方法培养该杂交瘤，以其培养上清的形式得到单克隆抗体的方法；或者，将杂交瘤给予与其具有适合性的哺乳动物以使其增殖，以其腹水的形式得到单克隆抗体的方法等。前一种方法适合得到高纯度的抗体，而后一种方法适于大量生产抗体。
例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制作可以通过日本特开平3-139293中公开的方法来进行。可以按照下述方法进行：将产生PM-1抗体的杂交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔内得到腹水，从该腹水中纯化PM-1抗体的方法；或者，在适当的培养基、例如含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)的RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制)等中培养本杂交瘤，从其培养上清中纯化PM-1抗体的方法。
在本发明中，作为单克隆抗体，可以使用下述抗体：由杂交瘤克隆抗体基因，之后将其***适当的载体中，再将其导入宿主中，利用基因重组技术产生的重组型抗体(例如参照Borrebaeck C.A.K.和Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具体而言，从产生目标抗体的细胞、例如杂交瘤中分离编码抗体可变(V)区的mRNA。分离mRNA时，利用公知的方法、例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.等人，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，再使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。另外，通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)，可以直接制备mRNA。
使用逆转录酶由所得的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit)等来进行。进行cDNA的合成和增幅时，可以采用使用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制)和PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919-2932)。从所得的PCR产物中纯化目标DNA片段，将其与载体DNA连接。再由此制作重组载体并导入大肠杆菌等中，选择菌落，制备所需的重组载体。利用公知的方法、例如脱氧法来确认目标DNA的核苷酸序列。
得到编码目标抗体V区的DNA时，将其与编码所需抗体恒定区(C区)的DNA连接，再将其***表达载体中。或者，可以将编码抗体V区的DNA***含有抗体C区的DNA的表达载体中。
制备本发明中使用的抗体时，按照后述的方式将抗体基因***表达载体中，使之在表达调节区、例如增强子、启动子的调节下表达。接下来，利用该表达载体转化宿主细胞，可以使抗体表达。
在本发明中，可以使用进行人为修饰以降低对人的异种抗原性等的基因重组型抗体、例如嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体等。这些修饰抗体可以利用已知的方法进行制备。
关于嵌合抗体，通过连接如上操作得到的编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区的DNA，将其***表达载体中，再导入宿主中，使产生抗体，从而得到嵌合抗体(参照欧州专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO 92-19759)。可以利用该已知方法得到对本发明有用的嵌合抗体。
人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体或人型化抗体，是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)移植到人抗体的互补性决定区中而得到的抗体，其常规基因重组方法也是已知的(参照欧州专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO 92-19759)。
具体而言，利用PCR法由多个制作成在末端部具有重叠部分的寡核苷酸合成设计成连接小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区(FR；framework region)的DNA序列。连接所得的DNA和编码人抗体C区的DNA，接着***到表达载体中，再将其导入宿主中，使之产生抗体，从而得到人源化抗体(参照欧州专利申请公开号EP 239400、国际专利申请公开号WO 92-19759)。
经由CDR连接的人抗体的FR选择互补性决定区形成良好的抗原结合位点的构架区。根据需要，可以取代抗体可变区中的构架区的氨基酸，使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合位点(Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌合抗体、人源化抗体中通常使用人抗体C区。人抗体重链C区的例子有：Cγ等，例如可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。人抗体轻链C区的例子有：例如κ或λ。另外，为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对人抗体C区进行修饰。
嵌合抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来自人抗体的C区构成，而人源化抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的互补性决定区和来自人抗体的构架区和C区构成，由于这些抗体在人体内的抗原性降低，所以作为用作药品的抗体是有效的。
本发明所使用的人源化抗体的优选的具体例子有：人源化PM-1抗体(参照国际专利申请公开号WO 92-19759)。
作为获得人抗体的方法，除之前阐述的方法外，还已知使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术。例如，还可以利用噬菌体展示法使人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面表达，然后可以选择与抗原结合的噬菌体。分析所选择的噬菌体的基因时，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。明确了与抗原结合的scFv的DNA序列后，制作包含该序列的适当的表达载体，可以获得人抗体。这些方法已经众所周知，可以参考WO 92/01047、WO92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388。
按照上述方式构建的抗体基因，可以利用公知的方法使之表达。使用哺乳类细胞时，可以利用使常用的有用启动子、所要表达的抗体基因及其3’侧下游的poly A信号功能性结合的DNA或含有该DNA的载体使之表达。例如，作为启动子/增强子，可以列举：人巨细胞病毒前期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate earlypromoter/enhancer)。
除此之外，作为本发明中使用的、可用于抗体表达的启动子/增强子，可以使用逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子或人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。
例如，当使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法(Mulligan，R.C.等人，Nature(1979)277，108-114)可以容易地实施；而当使用HEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.和Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地实施。
使用原核细胞作为宿主时，有使用细菌细胞的产生***。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
当为大肠杆菌时，可以使常用的有用启动子、用于抗体分泌的信号序列、所要表达的抗体基因功能性结合而使之表达。例如，启动子的例子有：lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可以按照Ward等人的方法(Ward，E.S.等人，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.等人.FASEB J.(1992)6，2422-2427)进行；使用araB启动子时，可以按照Better等人的方法(Better，M.等人.Science(1988)240，1041-1043)进行。
作为用于抗体分泌的信号序列，当其在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分离周质中产生的抗体后，适当地重折叠(refold)抗体的构造后使用(例如参照WO 96/30394)。
作为复制起点，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛***瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，表达载体中可以包含氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志物。
可以使用任意的产生***以制备本发明中使用的抗体。用于制备抗体的产生***有体外(in vitro)和体内(in vivo)产生***。体外产生***的例子有：使用真核细胞的产生***和使用原核细胞的产生***。
使用真核细胞作为宿主时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的产生***。作为动物细胞，已知有：(1)哺乳类细胞、例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero等；(2)两栖类细胞、例如非洲爪蟾***(Xenopus oocytes)；或(3)昆虫细胞、例如sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知有来源于烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可以对其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有：酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)属(例如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae))；以及丝状菌，例如曲霉属(Aspergillus)(例如黑曲霉(Aspergillus niger)等)。
通过转化将目标抗体基因导入这些细胞中，之后在体外培养所转化的细胞，从而得到抗体。可以按照公知方法进行培养。例如，可以使用DMEM、MEM、RPMIl640、IMDM作为培养液，还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补充液。此外，通过将导入有抗体基因的细胞移入动物的腹腔等中，可以在体内产生抗体。
另一方面，作为体内的产生***，可以列举：使用动物的产生***或使用植物的产生***。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生***等。
作为哺乳类动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。作为昆虫，可以使用蚕。使用植物时，例如可以使用烟草。
向这些动物或植物中导入抗体基因，使在动物或植物的体内产生抗体并回收。例如，将抗体基因***编码山羊β-酪素这样的乳汁中固有产生的蛋白的基因的中途，以融合基因的形式进行制备。再将携带***有抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚胎(embryo)中，将该胚胎导入雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊或其后代产生的乳汁中可以得到所需抗体。为了使转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
使用蚕时，使蚕感染***有目标抗体基因的杆状病毒，从该蚕的体液中得到所需抗体(Maeda，S.等人，Nature(1985)315，592-594)。并且，使用烟草时，将目标抗体基因***到植物表达用载体例如pMON530中，再将该载体导入到根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)这样的细菌中。用该细菌感染烟草例如烟草(Nicotianatabacum)，从该烟草的叶中得到所需抗体(Julian，K.-C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
按照上述方式利用体外或体内的产生***产生抗体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别***表达载体中，同时转化宿主；或者，可以将编码H链和L链的DNA***单一的表达载体中，用于转化宿主(参照国际专利申请公开号WO 94-11523)。
本发明中使用的抗体，只要能够适用于本发明，可以是抗体的片段或其修饰物。例如，作为抗体片段，可以列举：Fab、F(ab')2、Fv或用适当的接头连接H链和L链的Fv而形成的单链Fv(scFv)。
具体而言，用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体而生成抗体片段，或者，构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.&Horwitz，A.H.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496；Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，Methods inEnzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods inEnzymology(1989)121，663-66；Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可以通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。在该scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头来连接(Huston，J.S.等人、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自作为上述抗体而记载的任一种抗体。作为连接V区的肽接头，例如使用包含12-19个氨基酸残基的任意的单链肽。
以编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、以及编码L链或L链V区的DNA为模板，使用引物对通过PCR法扩增编码这些序列中的所需氨基酸序列的DNA部分，所述引物对规定该DNA部分的两端，然后，将编码肽接头部分的DNA和规定其两端与各H链、L链连接的引物对组合起来，进一步进行扩增，从而得到编码scFv的DNA。
一旦制作了编码scFv的DNA，就可以按照常规方法得到含有这些DNA的表达载体和通过该表达载体转化的宿主，还可以使用该宿主，按照常规方法得到scFv。
关于这些抗体的片段，可以进行与上述相同的操作，获得其基因并使之表达，利用宿主产生这些抗体的片段。本发明中所说的“抗体”还包含这些抗体的片段。
作为抗体的修饰物，还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本发明中所说的“抗体”还包含这些抗体修饰物。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得抗体施行化学修饰而得到。这些方法在该领域已经确立。
按照上述方式产生、表达的抗体可以从细胞内外、宿主中分离出来，并纯化至均匀。本发明中使用的抗体的分离、纯化可以通过亲和层析来进行。作为亲和层析中使用的柱，例如有蛋白A柱、蛋白G柱。作为蛋白A柱中使用的载体，例如有HyperD、POROS、SepharoseF.F.等。此外，可以使用普通蛋白中使用的分离、纯化方法，对其没有任何限定。
例如，可以适当选择、组合上述亲和层析以外的层析、滤器、超滤、盐析、透析等来分离、纯化本发明中使用的抗体。作为层析，例如有离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。这些层析可适用于HPLC(高效液相色谱法)。此外，可以使用反相HPLC(reverse phase HPLC)。
上述所得抗体的浓度测定可以通过吸光度的测定或ELISA等来进行。即，通过测定吸光度来测定抗体浓度时，用PBS(-)进行适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为1.35OD，算出抗体浓度。通过ELISA来测定抗体浓度时，可如下测定。即，向96孔板(Nunc制)中加入100μl用0.1M的碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制)，在4℃下培养一夜，将抗体固化。封闭后，添加100μl已适当稀释的本发明中使用的抗体或含有抗体的样品、或作为标准品的人IgG(CAPPEL制)，在室温下培养1小时。
清洗后，加入100μl经5000倍稀释的碱性磷酸酶标记抗人IgG(BIO SOURCE制)，在室温下培养1小时。清洗后，加入底物溶液进行培养，之后使用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)测定405nm的吸光度，算出目标抗体的浓度。
对抗IL-6抗体的具体例子没有特别限定，可以列举：MH166(Matsuda，T.等人，Eur.J.Immunol.(1998)18，951-956)或SK2抗体(SatoK等人，第21回日本免疫学会総会(第21次日本免疫学会总会)、学术记录(1991)21，166)等。
对抗IL-6受体抗体的具体例子没有特别限定，可以列举：MR16-1抗体(Tamura，T.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)等。其中，作为对抗人IL-6受体的优选的单克隆抗体，可以例示PM-1抗体，而作为对抗小鼠IL-6受体的优选的单克隆抗体，可以列举MR16-1抗体，但并不限于此。作为人源化抗IL-6受体抗体的优选的例子，可以列举人源化PM-1抗体(Tocilizumab、MRA)。人源化抗IL-6受体抗体的其他优选的例子有：WO 2009/041621中记载的抗体。并且，作为抗IL-6受体抗体的其他优选方案，可以列举：与人源化PM-1抗体(Tocilizumab、MRA)所识别的表位识别相同表位的抗IL-6受体抗体。
对于抗gp130抗体的具体例子没有特别限定，可以列举：AM64抗体(日本公开公报日本特开平3-219894)、4B11抗体、2H4抗体(美国专利公报US5571513)、B-P8抗体(日本公开公报日本特开平8-291199)等。
本发明中使用的IL-6修饰体是与IL-6受体具有结合活性、且不传递IL-6的生物学活性的物质。即，虽然IL-6修饰体和IL-6竞争与IL-6受体结合，但由于IL-6修饰体不传递IL-6的生物学活性，所以其阻断由IL-6介导的信号传递。
通过取代IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基来导入突变，制作IL-6修饰体。用作IL-6修饰体的基础的IL-6，虽然对其来源没有限定，但考虑到抗原性等，优选为人IL-6。具体而言，使用公知的分子模型程序、例如WHATIF(Vriend等人，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)预测IL-6的氨基酸序列的二级结构，再评价被取代的氨基酸残基对整体的影响，由此进行氨基酸取代。确定了适当的取代氨基酸残基后，以包含编码人IL-6基因的核苷酸序列的载体为模板，利用通常进行的PCR法导入突变，使氨基酸被取代，从而得到编码IL-6修饰体的基因。根据需要，将该基因***适当的表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、产生及纯化方法，可以得到IL-6修饰体。
IL-6修饰体的具体例子有：Brakenhoff等人，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93和Savino等人，EMBO J.(1994)13，1357-1367、WO96-18648、WO 96-17869中公开的IL-6修饰体。
IL-6受体部分肽是包含在IL-6受体的氨基酸序列中与IL-6和IL-6受体的结合相关的区的一部分或全部的氨基酸序列的肽。这样的肽通常包含10～80个、优选20～50个、更优选20～40个氨基酸残基。
在IL-6受体的氨基酸序列中，特定与IL-6和IL-6受体的结合相关的区，根据该特定的区的一部分或全部的氨基酸序列，利用通常已知的方法、例如基因工程学方法或肽合成法，可以制作IL-6受体部分肽。
利用基因工程学方法制作IL-6受体部分肽时，将编码所期望的肽的DNA序列***表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、产生及纯化方法可以得到IL-6受体部分肽。
利用肽合成法制作IL-6受体部分肽时，可以采用肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具体而言，可以按照“続医薬品の開発第14巻ペプチド合成(续医药品的开发第14卷肽合成)”监修矢岛治明广川书店1991年中记载的方法来进行。作为固相合成法，采用以下方法：例如使欲合成的肽的C末端所对应的氨基酸与不溶于有机溶剂的支撑体结合，交替重复进行使α-氨基和侧链官能团用适当的保护基保护起来的氨基酸按照C末端→N末端方向依次缩合每1个氨基酸的反应、以及使树脂上结合的氨基酸或肽的α-氨基的该保护基脱离的反应，从而使肽链伸长。根据所用保护基的种类，固相肽合成法大致分为Boc法和Fmoc法。
如此操作合成目标肽后，进行脱保护反应和从支撑体上切断肽链的反应。在肽链的切断反应中，采用Boc法时，可以使用氟化氢或三氟甲磺酸；采用Fmoc法时，通常可以使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氢中、在茴香醚存在下处理上述保护肽树脂。然后，进行保护基的脱离和从支撑体上切断肽链，回收肽。将其冷冻干燥，从而得到粗肽。而在Fmoc法中，例如可以在TFA中、按照与上述相同的操作进行脱保护反应和从支撑体上切断肽链的反应。
通过将得到的粗肽应用于HPLC，可以分离、纯化。洗脱时，可以使用蛋白纯化中通常使用的水-乙腈系溶剂，在最佳条件下进行洗脱。分离收集得到的色谱图的峰所对应的组分，将其冷冻干燥。对如此纯化的肽组分通过利用光谱分析进行的分子量解析、氨基酸组成分析或氨基酸序列解析等进行鉴定。
本发明的IL-6抑制剂可用于神经浸润的抑制。在本发明中，“神经浸润”是指癌细胞及其他细胞侵入神经组织中生长的方式，有时还伴有组织破坏(破坏性生长)等。本发明中，作为优选的神经浸润，可以列举：癌细胞的神经浸润。抑制癌细胞的浸润时，对作为对象的癌症种类没有特别限定，可以是胰腺癌、胃癌、***癌、头颈部癌、乳癌、肺癌、大肠癌、卵巢癌等任何癌症种类，但优选抑制胰腺癌细胞的浸润。神经浸润的抑制可以是抑制向末梢侧进行的神经浸润，也可以是抑制向中枢侧进行的神经浸润，但由于胰腺癌细胞存在对中枢侧进行神经浸润的趋势，所以优选抑制向中枢侧进行的神经浸润(例如，从神经损伤部位向中枢侧进行的神经浸润)。
本发明中，“神经浸润的抑制”是指抑制神经浸润的发生、降低神经浸润的发生率、缩短神经浸润距离、延缓神经浸润速度等。
通过利用本发明的IL-6抑制剂抑制神经浸润，可以治疗、抑制神经浸润所伴随的各种症状(例如癌症性疼痛等疼痛、贫血、体力状态(PS)下降、营养不良等)。因此，本发明还包括含有IL-6抑制剂的神经浸润所伴随的各种症状的治疗药、抑制剂。
本发明的胰腺癌治疗药可以在胰腺癌的治疗和/或预防中使用。
本发明中，“胰腺癌治疗”是指抑制胰腺癌的发生、降低胰腺癌的发生率、抑制胰腺癌细胞的增殖、缩小胰腺癌组织、改善胰腺癌的症状、抑制胰腺癌的转移等。
本发明中使用的IL-6抑制剂的效果例如可以以信号传递抑制活性为指标进行评价，但并不限于此。IL-6抑制剂的信号传递抑制活性可以利用通常使用的方法进行评价。具体而言，培养IL-6依赖性人骨髓瘤株(S6B45，KPMM2)、人Lennert T淋巴瘤细胞株KT3或IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中添加IL-6，同时共存IL-6抑制剂，由此可以测定IL-6依赖性细胞的3H-胸腺嘧啶核苷摄入。另外，培养作为IL-6受体表达细胞的U266，并添加125I标记IL-6，同时加入IL-6抑制剂，由此测定与IL-6受体表达细胞结合的125I标记IL-6。在上述测定***中，除存在IL-6抑制剂的组以外，还设置不含IL-6抑制剂的阴性对照组，比较两者所得的结果，可以评价IL-6抑制剂的IL-6抑制活性。
本发明的治疗药或抑制剂的给药对象为哺乳动物。哺乳动物优选为人。
本发明的治疗药或抑制剂可以以药品形式进行给药，可以通过口服或胃肠外进行全身或局部给药。例如，可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠剂、口服性肠溶剂等，根据患者的年龄、症状来选择适当的给药方法。有效给药量可以在每次、每1kg体重0.01mg～100mg的范围内选择。或者，可以选择每名患者1～1000mg、优选5～50mg的给药量。关于优选的给药量、给药方法，例如当为抗IL-6受体抗体时，血中存在的游离抗体的程度的量为有效给药量，具体例子有下述方法：每1kg体重、1个月(4周)给予0.5mg～40mg、优选1mg～20mg，分1次～数次、例如按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等给药时间表，通过点滴等静脉内注射、皮下注射等方法进行给药等。还可以边观察患者的状态和血液检查值的动向，边由2次/周或1次/周延长给药间隔至1次/2周、1次/3周、1次/4周等，以调整给药时间表。
在本发明的治疗药或抑制剂中，可以添加保存剂或稳定剂等制剂上可接受的载体。制剂上可接受的载体是指可以与上述药物一同给药的材料。作为制剂上可接受的材料，可以列举：例如灭菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。
本发明中，作为表面活性剂，可以列举非离子表面活性剂，典型例子有：例如脱水山梨糖醇单辛酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯等脱水山梨糖醇脂肪酸酯；单辛酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯等脂肪酸甘油酯；单硬脂酸十聚甘油酯、二硬脂酸十聚甘油酯、单亚油酸十聚甘油酯等脂肪酸聚甘油酯；聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等具有HLB 6～18的非离子表面活性剂等。
作为表面活性剂，还可以列举阴离子表面活性剂，典型例子有：例如十六烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、油烯基硫酸钠等具有碳原子数为10～18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯十二烷基硫酸钠等氧化乙烯的平均加成摩尔数为2～4、烷基的碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基磺基琥珀酸酯钠等烷基的碳原子数为8～18的烷基磺基琥珀酸酯盐；天然类的表面活性剂、例如卵磷脂、甘油磷脂；神经鞘磷脂等鞘磷脂；碳原子数为12～18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。
在本发明的药物中，可以组合添加1种或2种以上的上述表面活性剂。本发明的制剂中使用的优选的表面活性剂为聚山梨酯(Polysorbate)20、40、60或80等聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，特别优选聚山梨酯20和80。此外，还优选泊洛沙姆(poloxamer)(PluronicF-68(注册商标)等)所代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。
表面活性剂的添加量根据所用表面活性剂的种类而不同，当为聚山梨酯20或聚山梨酯80时，其添加量通常为0.001～100mg/mL，优选为0.003～50mg/mL，进一步优选为0.005～2mg/mL。
在本发明中，作为缓冲剂，可以列举：磷酸、枸橼酸缓冲液、乙酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、葡萄糖酸、癸酸、脱氧胆酸、水杨酸、三乙醇胺、富马酸等、其他有机酸等、或碳酸缓冲液、Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、咪唑缓冲液等。
通过将本发明的药物溶解于溶液制剂领域中公知的水性缓冲液中，可以制备溶液制剂。缓冲液的浓度通常为1～500mM，优选为5～100mM，进一步优选为10～20mM。
本发明的药物可以含有其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白、氨基酸、多糖和单糖等糖类或碳水化合物、糖醇。
在本发明中，作为氨基酸，可以列举：碱性氨基酸、例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等、或这些氨基酸的无机盐(优选盐酸盐、磷酸盐的形式、即磷酸氨基酸)。使用游离氨基酸时，优选的pH值通过添加适当的生理上可接受的缓冲物质、例如无机酸、特别是盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或它们的盐来调节。此时，使用磷酸盐可以得到特别稳定的冷冻干燥物，因此特别有利。制备物中实质上不含有机酸、例如苹果酸、酒石酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸等时或不存在对应的阴离子(苹果酸离子、酒石酸离子、枸橼酸离子、琥珀酸离子、富马酸离子等)时，特别有利。优选的氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。并且，还可以使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸、及其盐的形式(优选钠盐)；或中性氨基酸、例如异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸或丙氨酸；或芳族氨基酸、例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、或衍生物的N-乙酰色氨酸。
本发明中，作为多糖和单糖等糖类或碳水化合物，可以列举：例如葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、蜜三糖等。
本发明中，作为糖醇，可以列举：例如甘露醇、山梨醇、肌醇等。
将本发明的药物制成注射用水溶液时，可以将其与例如生理盐水、含葡萄糖或其他辅助药(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗溶液混合。该水溶液还可以与适当的助溶剂(例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(聚山梨酯80、HCO-50)等)结合使用。
根据需要，可以进一步含有稀释剂、助溶剂、pH调节剂、缓解剂(soothing agent)、含硫还原剂、抗氧剂等。
本发明中，作为含硫还原剂，可以列举：例如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、以及碳原子数为1～7的硫代链烷酸等具有巯基的含硫还原剂等。
本发明中，作为抗氧剂，可以列举：例如异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。
根据需要，还可以将药物封入微囊(羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等的微囊)中，或者制成胶体药物传递***(脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊等)(参照“Remington'sPharmaceutical Science 16th edition”，Oslo Ed.，1980等)。并且，将药物制成缓释制剂的方法也是公知的，可应用于本发明(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.1981，15：167-277；Langer，Chem.Tech.1982，12：98-105；美国专利第3,773,919号；欧州专利申请公开(EP)第58,481号；Sidman等人，Biopolymers 1983，22：547-556；EP第133,988号)。
所使用的制剂上可接受的载体，根据剂型从上述载体中适当或组合选择，但并不限于这些。
本发明涉及在对象中抑制神经浸润的方法，该方法包括：对发生神经浸润的对象或有可能发病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
本发明还涉及在对象中治疗和/或预防胰腺癌的方法，该方法包括：对患有胰腺癌的对象或有可能患病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
本发明中，“对象”是指给予本发明的治疗药或抑制剂的生物体、该生物体体内的一部分。对生物体没有特别限定，包括动物(例如人、家畜动物种类、野生动物)。
对“生物体体内的一部分”没有特别限定，可以优选列举：疾病部位等。
本发明中，“给药”包括口服给药或胃肠外给药。作为口服给药，可以列举：以口服制剂的形式进行的给药；作为口服制剂，可以选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或悬浮剂等剂型。
作为胃肠外给药，可以列举：以注射剂的形式进行的给药，注射剂的例子有：皮下注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。通过利用基因疗法将应该给予的含有寡核苷酸的基因导入生物体内，可以实现本发明的方法的效果。还可以将本发明的药物对欲实施处置的部位进行局部给药。例如，还可以通过手术中的局部注入、插管的使用、或本发明的编码肽的DNA靶向基因传递进行给药。
实践本发明的方法时，可以将本发明的药物与至少一种其他药物(例如其他神经浸润抑制剂或其他胰腺癌治疗药)一起作为药学组合物的一部分进行给药。在一个方案中，本发明的药物和其他药物实质上可以同时给药。
需要说明的是，本说明书中引用的所有先行技术文献均作为参照而纳入本说明书中。
实施例
利用实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于此。本领域技术人员可以进行各种变更、修饰，这些变更、修饰也包含在本发明中。
<材料和方法>
(细胞)
从American Type Culture Collection(ATCC)购入人胰腺癌细胞株Capan-1、BxPC-3，按照ATCC推荐的操作指南，使用可以维持37度、5％CO2的条件的恒温槽进行培养和传代。
(细胞数计测)
从培养皿中采集细胞，使用台盼蓝和血细胞计测盘计测活细胞。(趋化性分析)
将底面带有8μm的孔的细胞培养小室(BD Falcon)***24个孔中，以细胞培养小室作为上室，以孔作为下室。向下室中注入600μl用非血清培养液和人重组IL-6(hrIL6)(R&D systems)制备的0、1、10、100ng/ml的hrIL6溶媒，向上室中注入100μl2×106个/ml的细胞悬浮液。培养24小时后，计测通过孔的细胞数。各组测定12次，再除以hrIL6为0ng/ml时通过孔的平均细胞数，记录所得的数值，作为校正值。
(伤口愈合分析)
向24个孔中分别注入1 ml 3×105个/ml的细胞悬浮液，培养24小时。换成非血清培养基，再培养24小时，之后用玻璃棒蹭掉孔的中央部分，制作带状的无细胞区，计测其宽度，交换培养基，使hrIL6溶媒达到0、1、10、100ng/ml。培养24小时后，测定无细胞区的宽度变化。各组测定12次，再除以hrIL6为0ng/ml时的平均变化长度，记录所得的数值，作为校正值。
(抗体)
蛋白质印迹法中使用的一次抗体为：抗磷酸化STAT3抗体(SantaCruz)、抗STAT3抗体(Santa Cruz)、抗磷酸化Erk1/2抗体(CellSignaling)、抗Erk1/2抗体(Cell Signaling)、抗磷酸化Akt抗体(CellSignaling)、抗Akt抗体(Cell Signaling)、抗Actin抗体(Santa Cruz)。荧光免疫染色中使用的一次抗体为：抗S100抗体(DAKO)、抗小鼠IL-6抗体(Santa Cruz)，核染色使用DRAQ5(AXXORA)。免疫染色中使用抗磷酸化STAT3抗体(Santa Cruz)。
(蛋白质印迹法)
使用裂解缓冲液(20mM Hepes-NaOH pH7.0、0.5％NP-40、15％甘油、300mM NaCl、1mM EDTA、10mM NaF)制作细胞溶解液。使用BCA蛋白测定试剂盒(PIERCE)测定蛋白浓度后，使含有20mg蛋白的细胞溶解液在7.5％或12％的丙烯酰胺凝胶中进行电泳，之后转移到聚偏二氟乙烯薄膜(Millipore)上。向薄膜上添加抗体，使用增强型化学发光试剂(Enhanced Chemiluminescence Reagent)(AmershamBiosciences)将蛋白表达图像化。
(磷酸化STAT3免疫染色及其评价方法)
使用微波在10mM的枸橼酸缓冲液中进行95℃、10分钟的加热处理以激活抗原，显色时使用DAB。作为检体，使用从经过4周的26只小鼠神经浸润模型中采集的26根坐骨神经。以神经浸润部的中枢侧顶端和末梢侧顶端作为目标区，使用40倍的物镜计测每个视野的癌细胞数和磷酸化STAT3阳性癌细胞数，通过下式算出标记指数：(磷酸化STAT3阳性癌细胞数)/(癌细胞数)。
(神经浸润模型)
所用小鼠为6周龄、雄性重度免疫功能不全小鼠(SCID小鼠)。按50mg/kg向小鼠腹腔内给予巴比妥，进行麻醉，露出左坐骨神经，使用微量注射器和30G针向坐骨神经内直接注入2.5μl1.0×104个/μl的癌细胞悬浮液。采集在评价时期注入了癌细胞的坐骨神经，制作组织标本时，在4％低聚甲醛中、于4℃下静置一昼夜，以固定坐骨神经。将已固定的上述坐骨神经切成3μm的厚度，进行苏木素-伊红染色或免疫染色，以测定神经浸润距离。测定神经浸润距离时，使用沿神经长轴方向薄切的切片和物镜测微计(三啓)，计测全肿瘤范围的长轴。提取组织中的mRNA时，使用立即用Multi-Beads Shocker(安井器械)破碎所采集的组织而得到的检体。
(RNA提取和实时RT-PCR)
使用TRIzol(Life Technologies)，从自培养皿中采集的细胞团块(cell pellet)或破碎的组织断片中采集总RNA。使用ExScript RT试剂试剂盒(Takara-bio)和Takara PCR Thermal Cycler Dice(Takara-bio)，按照Takara-bio社推荐的操作指南，由1×103ng的总RNA合成cDNA。使用Smart Cycler II System(Cepheid)、SYBR RT-PCR试剂盒(Takara-bio)进行实时RT-PCR。引物使用分别特异性扩增人IL-6α受体(IL6R)、人IL-6β受体(gp130)、人GAPDH、小鼠IL-6、小鼠EGF、小鼠GAPDH的cDNA的引物。引物序列如下。人IL6R：正向tgagctcagatatcgggctgaac(SEQ ID NO：1)、反向cgtcgtggatgacacagtgatg(SEQ ID NO：2)；人gp130：正向gaagcaagtgggatcacctatgaa(SEQ ID NO：3)、反向ctgtagccttgagtatgggatgga(SEQ ID NO：4)；人GAPDH：正向gcaccgtcaaggctgagaac(SEQ ID NO：5)、反向atggtggtgaagacgccagt(SEQID NO：6)；小鼠IL-6：正向ccacttcacaagtcggaggctta(SEQ ID NO：7)、反向gcaagtgcatcatcgttgttcatac(SEQ ID NO：8)；小鼠EGF：正向catcatggtggtggctgtctg(SEQ ID NO：9)、反向cacttccgcttggctcatca(SEQ IDNO：10)；小鼠GAPDH：正向aaatggtgaaggtcggtgtg(SEQ ID NO：11)、反向tgaaggggtcgttgatgg(SEQ ID NO：12)。利用Takara-bio社推荐的方法进行定量。
(mRNA击倒)
在mRNA表达的击倒中，使用Ambion社制作的siRNA。所用siRNA为人IL6R siRNA、人gp 130siRNA、NegatiVe Control#1siRNA。在3.5cm的培养皿中播撒2×105个癌细胞，培养48小时后，加入20μM的siRNA和8μl DharmaFECT转染试剂4(Dharmacon)。24小时后采集细胞，将其用于mRNA表达分析或神经浸润模型。
(统计分析)
分析软件使用STATVIEW 5.0。平均值之差的检验使用student-t双侧检验。图中的误差棒按照显示标准偏差的方式制作。
[实施例1]
利用实时RT-PCR研究人胰腺癌细胞株中的IL-6α受体(IL6R)和IL-6β受体(gp130)的细胞内mRNA表达。在人胰腺癌细胞株中，确认到IL6R mRNA(图1A)和gp130mRNA(图1B)的明确表达。
[实施例2]
使用人重组IL-6，通过细胞数的经时性计测(图2A和B)、趋化性分析(图2C)、伤口愈合分析(图2D)研究IL-6对人胰腺癌细胞株的增殖能力、趋化能力、迁移能力的影响。明确了：IL-6虽然对胰腺癌细胞株的细胞增殖没有影响，但使趋化能力和迁移能力亢进。
[实施例3]
使用人重组IL-6(rhIL6)，对于磷酸化STAT3(pSTAT3)(图3A)、磷酸化Erk1/2(pErk1/2)(图3B)、磷酸化Akt(pAkt)(图3C)，利用蛋白质印迹法评价IL-6对人胰腺癌细胞株Capan-1的细胞内信号的影响。在添加rhIL615分钟后，确认到细胞内的磷酸化STAT3蛋白表达明显亢进，而在添加rhIL6 1小时后，确认到磷酸化Erk1/2蛋白表达明显亢进。没有确认到对磷酸化Akt表达的影响。
[实施例4]
胰腺癌的重要浸润方式为神经浸润距离。制作可以重现神经浸润、并且可以计测神经浸润距离的小鼠神经浸润模型，这在研究控制胰腺癌的重要的肿瘤浸润方式的治疗方法上至关重要。通过向免疫功能不全小鼠的坐骨神经内直接注入人胰腺癌细胞株Capan-1，制作神经浸润模型。肉眼可见神经浸润部的表面不平整、且明显大于正常神经(图4A)。1周后，组织学的神经浸润距离明显长于注入时Capan-1神经内扩散距离，该距离随时间而增大(图4B)。另外，神经浸润从注入部向中枢侧进展(图4C)，这与人胰腺癌神经浸润是相同的特征。
[实施例5]
据报道，人胰腺癌神经浸润损伤肿瘤周围的神经组织。已经明确：神经损伤使IL-6表达在损伤部位的末梢侧的神经组织中亢进。为了研究神经浸润引起的神经组织的IL-6表达动态，使用神经浸润模型，通过实时RT-PCR法分别评价在神经浸润中枢侧和末梢侧的神经组织内(图5B)表达的小鼠IL-6(mIL6)mRNA。虽然mIL6在神经浸润中枢侧高度表达，但在其他神经损伤模型中没有确认到该趋势(图5B)。通过荧光免疫染色确认mIL6蛋白表达时，与作为Schwann细胞的标志物的S100阳性细胞区一致，确认到IL6阳性颗粒(图5C)。明确了：在神经浸润模型中，mIL6分泌细胞之一是Schwann细胞。虽然EGF是在神经损伤中高度表达的分子，但小鼠EGF(mEGF)mRNA表达动态不同于mIL6，没有确认到其在中枢侧高度表达的趋势。该结果暗示：IL-6与神经浸润部位的肿瘤-神经相互作用密切相关。
[实施例6]
利用免疫染色研究IL-6的重要的细胞内信号即磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白在胰腺癌细胞内表达时，磷酸化STAT3表达在神经浸润中枢方向亢进(图6)。该结果是：与在神经浸润中枢侧的神经组织中IL-6表达的亢进分布一致。
[实施例7]
在IL-6的细胞内信号中，必需有gp130的介在。使用用siRNA击倒了胰腺癌细胞的gp130mRNA表达的胰腺癌细胞株制作神经浸润模型时，神经浸润距离得到抑制(图7)。该结果表明：由gp130介导的信号对于神经浸润是重要的，所述gp130包含来自IL-6的gp130。
[实施例8]
在IL-6的细胞内信号中，必需有IL-6受体(IL6R)的介在。使用用siRNA击倒了胰腺癌细胞的IL6R mRNA表达的胰腺癌细胞株制作神经浸润模型时，神经浸润距离得到抑制(图8)。该结果表明：由IL-6介导的信号对于神经浸润是重要的。
[实施例9]
接下来，对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂或抗IL-6受体抗体，确认这些抑制剂对神经浸润的影响。
(对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂的实验)
将抑制STAT3磷酸化的JAK抑制剂AG490(CALBIOCHEM)溶于DMSO中，之后用生理盐水进行稀释，制备1％DMSO的AG490液。从制作神经浸润模型2天后起，向小鼠腹腔内连日给予0.5mgAG490，从制作模型起2周后采集注入有癌细胞的坐骨神经，测定神经浸润距离。对照组则按照同样的方法给予1％DMSO液。AG490组和DMSO组中所用小鼠数均为7只。
(对小鼠神经浸润模型给予抗IL-6受体抗体的实验)
将抑制人IL-6受体的抗IL-6受体抗体(中外制药、tocilizumab)溶于生理盐水中，从制作模型1周后起，按5μg/g、每周2次对小鼠神经浸润模型给予抗IL-6抗体抑制抗体。从制作模型起3周后采集注入有癌细胞的坐骨神经，测定神经浸润距离。对照组则按照同样的方法以5μg/g给予溶解在生理盐水中的人IgG(Sigma)。抗IL-6受体抗体组中所用小鼠数为6只，对照组中所用小鼠数为4只。
(统计分析)
分析软件使用STATVIEW 5.0。平均值之差的检验使用student-t双侧检验。图中的误差棒按照显示标准偏差的方式制作。
从注入癌细胞2天后起连续12天腹腔内给予对于IL-6的细胞内信号重要的STAT3磷酸化的JAK(Janus Kinase)抑制剂AG490时，明确了神经浸润得到抑制(图9A)。该结果表明：IL-6下游的细胞内信号即JAK-STAT对神经浸润是重要的。
另外，为了发挥人IL-6的抑制作用，从注入癌细胞1周后起每周2次、连续2周给予抗人IL-6受体抗体时，明确了神经浸润得到抑制(图9B)。由该结果认为：人胰腺癌神经浸润被抗人IL-6受体抗体抑制。
产业实用性
本发明显示：通过给予抗IL-6受体抗体，在胰腺癌中可以抑制神经浸润。进一步显示：通过给予抗IL-6受体抗体，可以治疗胰腺癌。

Claims (32)

1.胰腺癌治疗药，其以白介素6抑制剂、即IL-6抑制剂作为有效成分。
2.细胞的神经浸润抑制剂，其以IL-6抑制剂作为有效成分。
3.权利要求2所述的抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
4.权利要求3所述的抑制剂，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。
5.权利要求2～4中任一项所述的抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸润。
6.权利要求1～5中任一项所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结合的物质。
7.权利要求6所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
8.权利要求7所述的治疗药或抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
9.胰腺癌的治疗方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
10.细胞的神经浸润抑制方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
11.权利要求10所述的方法，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
12.权利要求11所述的方法，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。
13.权利要求10～12中任一项所述的方法，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸润。
14.权利要求9～13中任一项所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结合的物质。
15.权利要求14所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
16.权利要求15所述的方法，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
17.IL-6抑制剂在制备胰腺癌治疗药中的应用。
18.IL-6抑制剂在制备细胞的神经浸润抑制剂中的应用。
19.权利要求18所述的应用，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
20.权利要求19所述的应用，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。
21.权利要求18～20中任一项所述的应用，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸润。
22.权利要求17～21中任一项所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结合的物质。
23.权利要求22所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
24.权利要求23所述的应用，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
25.IL-6抑制剂，该IL-6抑制剂在治疗胰腺癌的方法中使用。
26.IL-6抑制剂，该IL-6抑制剂在用于抑制细胞的神经浸润的方法中使用。
27.权利要求26所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
28.权利要求27所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。
29.权利要求26～28中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸润。
30.权利要求25～29中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结合的物质。
31.权利要求30所述的IL-6抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
32.权利要求31所述的IL-6抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
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