CN106435007A - 一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法，所述引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针如SEQ ID NO:3所示，所述方法为以待检测样品的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应，收集荧光信号，绘制曲线。本发明的检测猪丹毒杆菌的引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，能够检测出猪丹毒杆菌，可以对各种临床样品进行检测，从而可以快捷的对临床中猪丹毒杆菌感染情况进行监测，操作简单、实用。

Description

一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
猪丹毒是由猪丹毒杆菌引起的一种急性、热性传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块(亚急性)、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。本病曾经被称为我国“三大传染病”之一，近年来，随着养猪集约化发展猪丹毒逐渐淡出人们的视野，但该病并没有完全被净化，在全国各地区一直都有零星出现，给养猪户造成了严重的经济损失。
养猪生产上常用猪丹毒弱毒疫苗株对猪丹毒进行免疫防控，效果显著。近年来，中牧、广东永顺等疫苗厂家相继推出猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联活苗，一次注射可以预防3种传染病，效果与3种单苗相近，简便有效。然而，由于猪丹毒和猪肺疫巴氏杆菌营养需求相似，两种细菌在同一培养皿中培养相互干扰，这将造成三联苗成品疫苗抗原含量检测不准确，而弱毒疫苗对抗原含量要求较高，抗原含量低了会造成免疫效力低，抗原含量高则会影响疫苗的安全性。
现有技术中通常采用活菌培养计数法对疫苗中含有的菌数进行测定，具体方法为：用生理盐水将疫苗稀释至1头份/毫升后，取1毫升做10倍系列稀释，每个稀释度换一支稀释管，根据经验将疫苗稀释至相应的倍数，选择适宜的稀释度的菌液接种鲜血琼脂培养基平板3个，每个板0.1毫升，培养24～48小时，肉眼观察菌落，并在平板地面点数，算出3个平板的平均菌落数，乘以稀释倍数再乘以10，即为每头份疫苗所含的总菌数。
活菌培养计数法的方法主要缺点是检测用时较长，同种疫苗有两种营养需求相似的抗原，则会相互干扰。检测用时长是因为需要做细菌培养，需要24～48小时；疫苗稀释后接种平板培养基，不能确定接种位置，两个菌落相互重合或覆盖，则不能准确计数。另外，细菌培养存在潜在危险性。
综上所述，迫切需要一种简单准确，不受其它细菌干扰的检测猪丹毒杆菌含量的检测方法。荧光定量PCR以特异性强、灵敏度高、重复性好、速度快的诸多优点成为分子生物学研究中的重要工具，因其检测特异性核酸，因此检测结果不会受其它病原影响，可应用于猪丹毒杆菌的含量检测。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明通过对猪丹毒杆菌16S核糖体RNA基因的分析，设计了引物和报告基团标记的探针，并建立了荧光定量PCR方法，可以对猪丹毒杆菌进行快捷的检测。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的引物，所述引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
本发明还公开了一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的探针，所述探针如SEQ IDNO:3所示。
所述探针的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ1。
上述引物和探针在制备荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的试剂盒中的应用。
一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。
所述试剂盒还包括PCR预混液、质粒标准样品和无菌蒸馏水。
一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的方法，采用上述引物和探针，包括以下步骤：以待检测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应，收集荧光信号，绘制曲线。
所述荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：PCR预混液12.5μL(2倍定量PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶6U/μL，引物SEQ ID NO:1所示1pm、SEQ ID NO:2所示1pm)，荧光探针0.5μL(10pm)，无菌蒸馏水10μL，再加入提取好的DNA模板2μL。
所述荧光定量PCR扩增反应的反应程序为：95℃,1分钟；95℃5秒，60℃30秒，40个循环，其中60℃收集荧光。
与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：
本发明针对猪丹毒杆菌16S核糖体基因序列设计了一对引物，一条标记探针，并制备了质粒标准样品，作为内部参照，建立了荧光定量PCR方法，引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，能够定量检测出猪丹毒杆菌，可以对各种疫苗和临床样品进行检测、鉴别，检测时间短，一般2～3小时可获得结果，从而可以快捷的对猪丹毒杆菌进行区分，操作简单、实用。
附图说明
图1为本发明外参标准品的荧光定量PCR的实验结果，其中，曲线1、2、3、4、5分别代表的每毫升质粒拷贝数为：1.56×108、1.56×107、1.56×106、1.56×105、1.56×104；
图2为本发明实施例1的方法对厂家A和B各3个批次猪丹毒、猪肺疫、猪瘟三联活疫苗检测结果，其中，曲线1、2、3、4、5分别代表的每毫升质粒拷贝数为1.56×108、1.56×107、1.56×106、1.56×105、1.56×104(标准曲线)；曲线6、7、8分别是厂家A的3个批次疫苗扩增曲线，计算出疫苗抗原含量拷贝数分别为2.52×1010、7.04×109、6.87×109，抗原含量均合格；曲线9、10、11分别是厂家B的3个批次疫苗扩增曲线，计算出疫苗抗原含量拷贝数分别为5.27×109、4.95×109、1.36×106，其中前两批抗原含量合格，后一批不合格。
图3为本发明试验例1的特异性检验结果，其中曲线1为猪丹毒，曲线2-5分别为链球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、葡萄球菌。
图4为本发明试验例2的灵敏度检验结果，其中曲线1、2、3、4、5、6、7、8代表的质粒拷贝数分别为4.26×108、4.26×107、4.26×106、4.26×105、4.26×104、4.26×103、4.26×102、4.26；曲线9为阴性对照；
图5为本发明试验例3的重复性实验结果，其中曲线1，曲线2和3为同一样品3次重复性试验。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
实施例1荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的引物、探针和方法
1、引物、探针设计
根据NCBI登陆的7个猪丹毒菌株16S核糖体基因序列(登录号分别为：AB055908.1、AB055907.1、AB055905.1、NR_040837.1、KP063151.1、KP063150.1和KJ660062.1)提供的信息，经过比对分析，设计了定量PCR的引物F、R和探针P，核苷酸序列如下：
上游引物F：AGGGAATTTTCGGCAATGG(SEQ ID NO:1)；
下游引物R：CCCGAAGGCCKTCTTCA(SEQ ID NO:2)；其K代表T或者G；
探针P：AAGACTACCGACAAGCCCACTCACAAC(SEQ ID NO:3)
其中，探针P的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ1。
使用上述引物和探针进行荧光定量PCR扩增，可以通过扩增曲线检测猪丹毒杆菌。
2、质粒标准样品制备
根据NCBI登陆的猪丹毒菌株16S核糖体基因序列设计了引物F1和R1，核苷酸序列如下：
F1：GAATTCCACTAACCTCTCCTG(SEQ ID NO:4)；
R1：CACAAYGAGATGGGCTTA(SEQ ID NO:5)；其中Y代表C或者T。
中牧股份公司的猪丹毒疫苗稀释后用AxyGen体液病毒DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒(也可用其他核酸提取方法)提取核酸，保存备用；用引物F1和R1扩增提取的核酸，反应体系为：PCR预混液12.5μL(2倍PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶6U/μL，引物SEQ ID NO:4所示1pm、SEQ ID NO:5所示1pm)，无菌蒸馏水10μL，提取的核酸3μL，反应程序为：98℃，15秒；53℃，30秒；72，45秒；72℃，45秒；30个循环；72℃，2分钟；将PCR产物纯化后克隆入PMD-18T质粒载体，再转化至DH5α大肠杆菌后增殖，提纯后进行10倍系列稀释，选取其中5个稀释度作为标准样品，经过测量质粒浓度，可换算出质粒的拷贝数，每毫升拷贝数分别为：1.56×108、1.56×107、1.56×106、1.56×105、1.56×104。
3、检测方法
包括以下步骤：
(1)、待检样品DNA提取
选取厂家A和厂家B的猪瘟、猪丹毒和猪肺疫三联活疫苗，各取3瓶，用无菌生理盐水稀释至1毫升/头份，各取200μL，用AxyGen体液DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒提取核酸(最后用20μL水洗脱)，保存备用。
(2)、荧光定量PCR
各吸取2μL提取的核酸和质粒标准样品加入到定量PCR反应体系中，反应体系配制为(每份)：PCR预混液12.5μL(2倍定量PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶6U/μL，引物SEQ ID NO:1所示1pm、SEQ ID NO:2所示1pm)，荧光探针0.5μL(10pm)，无菌蒸馏水10μL。
反应体系混合均匀后，在定量PCR仪上进行扩增，反应程序为：95℃,1分钟；95℃，5秒；60℃，30秒；40个循环，其中60℃收集荧光。
(3)、结果判定
扩增结束后，依据质粒标准样品和疫苗样品荧光PCR的CT值，计算出样品含量，再乘以50，即为1头份疫苗中猪丹毒杆菌含量。计算出每头份疫苗猪丹毒含量≥2.5×109，疫苗抗原含量合格；计算出每头份疫苗猪丹毒含量＜2.5×109，疫苗抗原含量不合格(疫苗质量标准是每头份疫苗猪丹毒含量大于5×108，上述方法检测计算出的2.5×109与细菌计数法检测的5×108相对应)。
本实施例的样品的检测结果见图1和表1。
表1待检样品检测结果
试验例1特异性检验
取已知含有猪丹毒疫苗株，巴氏杆菌疫苗株，大肠杆菌和猪链球菌的样品，处理后取各200μL用AxyGen体液病毒DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒提取核酸，然后进行荧光定量PCR操作，得出结果如图3所示，含有猪丹毒疫苗株的样品扩增出图1中A曲线，Ct值为9.76，结果判定为阳性；含有巴氏杆菌疫苗株、大肠杆菌和猪链球菌的样品未扩增出特定的曲线，判定为阴性。由此结果可知本发明方案有很好的特异性。
试验例2灵敏度检验
将已知浓度为1.75×1011拷贝/mL的PMD-18T质粒(已克隆入序列5-AGGGAATTTTCGGCAATGGGGGAAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGG-3)进行10倍系列稀释，稀释至1.75×103拷贝/mL，每个稀释度取1μL，连同阴性对照，加入定量PCR反应体系中，混匀后在荧光定量PCR仪上进行定量PCR反应，其中反应体系为：预混液12.5μL，双蒸水11μL，荧光探针0.5μL；反应程序为：95℃,1分钟；95℃，5秒；60℃，30秒；40个循环，其中60℃收集荧光。结果如附图4所示，曲线1、2、3、4、5、6、7、8和9的Ct值分别是9.54、12.17、14.68、19.21、22.08、25.01、28.32、31.36和35.19，对应的质粒拷贝数分别为1.75×108、1.75×107、1.75×106、1.75×105、1.75×104、1.75×103、1.75×102、1.75×10、1.75，曲线10为阴性，由此结果可知，本发明的方案有很高额灵敏度。
试验例3重复性检验
取已知含有猪丹毒疫苗株的样品分成3份，处理后取200μL用AxyGen体液DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒提取核酸，然后进行荧光定量PCR检测，得出结果如附图5所示，图5中曲线1、2、3，对应的Ct值分别是为14.35、14.19和14.27，结果判定为阳性；由此结果可知本发明有很好的重复性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agggaatttt cggcaatgg 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccgaaggcc ktcttca 17
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagactaccg acaagcccac tcacaac 27
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaattccact aacctctcct g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cacaaygaga tgggctta 18

Claims (7)

1.一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的探针，其特征在于，所述探针如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的探针，其特征在于，所述探针的5’端和3’端分别标记有FAM和BHQ1。
4.权利要求1所述的荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的引物、或权利要求2或3所述的检测猪丹毒杆菌的探针在制备检测猪丹毒杆菌的试剂盒中的应用。
5.一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测猪丹毒杆菌的引物、以及权利要求2或3所述的检测猪丹毒杆菌的探针。
6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR预混液、质粒标准品和无菌蒸馏水。
7.一种荧光定量PCR检测猪丹毒杆菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的检测猪丹毒杆菌的引物、以及权利要求2或3所述的检测猪丹毒杆菌的探针，包括以下步骤：以待检测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应，收集荧光信号，绘制曲线；
其中，所述荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：PCR预混液12.5μL(2倍定量PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶6U/μL，引物SEQ ID NO:1所示1pm、SEQ ID NO:2所示1pm)，荧光探针0.5μL(10pm)，无菌蒸馏水10μL，再加入提取好的DNA 2μL。
所述荧光定量PCR扩增反应的反应程序为：95℃,1分钟；95℃5秒，60℃30秒，40个循环，其中60℃收集荧光。
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