CN104887738A - 一种菜用大豆提取物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种菜用大豆提取物的制备方法，及其检测方法。菜用大豆水提取物含有脱落酸，脱落酸具有提高果糖诱导的小鼠胰岛素的敏感性的作用，可有效地防止胰岛素抵抗；脱落酸能够很好地改善高脂饲料饲养的小鼠血清中的TC、TG、HDL-C水平，明显降低肝脏中MDA含量，升高SOD含量，脱落酸可以降低肥胖小鼠的体重，减少小鼠腹部脂肪，脱落酸具有抗肥胖效果。毛豆水提取物明显降低糖尿病小鼠空腹血糖，明显改善2型糖尿病小鼠口服糖耐量，明显降低2型糖尿病小鼠肝脏中MDA的含量，和提高SOD的含量；毛豆水提取物对糖尿病小鼠的肝脏具有保护作用，对糖尿病小鼠的脾脏、肾脏、胸腺和胰腺等均有积极保护作用。菜用大豆水提取物可以应用于糖尿病预防及治疗药品的开发，也可应用于相关领域的食品及保健品的开发。
Description
技术领域
本发明涉及菜用大豆（又名毛豆）的提取方法及其在医疗保健方面的应用。
背景技术
菜用大豆是高营养并含有丰富的有益的植物化学物质，因此，被认为是营养药物或功能性食品作物。毛豆富含蛋白质且氨基酸种类齐全、人体必需的各种矿物质、维生素(VA、VC、VE)、不饱和脂肪酸、植物粗纤维以及近年来备受关注的大豆异黄酮等一类天然有益的植物次生产物, 其中染料木黄酮含量较高[1]。这一系列物质确定了毛豆的营养价值和医疗作用。毛豆对一些疾病有预防和辅助治疗作用，如肥胖、高血脂、高血压、糖尿病、心血管疾病等，并因其独特的风味与口感，被誉为最美味、最富营养的绿色保健蔬菜[2]。
O. H. Aziz[3]报告，大豆含有复杂碳水化合物和丰富的膳食纤维，有利于糖尿病人降低血糖并减少患糖尿病的风险。据专利（菜用大豆在预防治疗糖尿病中的医用用途 CN103349675A）指出，菜用大豆对2型糖尿病具有预防治疗作用，对于2型糖尿病患者具有降低空腹血糖和改善糖耐量的作用，并具有降低血脂、总胆固醇，提高高密度脂蛋白等作用。Khushk, M.U.等[4]研究报告，大豆氯仿和酒精提取物对四氧嘧啶诱导的糖尿病兔具有降糖作用。Fujita H等[5]报告，豆豉水溶性提取物显示出葡萄糖苷酶抑制活性，表现出抗高血糖效果，并且对于非胰岛素依赖型糖尿病患者具有潜在作用。
临床研究表明[6]，大豆异黄酮具有防止脂质过氧化的作用，因此能减少人类心血管疾病的风险。大豆异黄酮可增加高密度脂蛋白胆固醇，降低低密度脂蛋白胆固醇，从而可缓解糖尿病，增加骨密度，减少骨质疏松[7]。Behloul N[8] 报告, 大豆异黄酮，染料木素具有治疗肥胖和糖尿病的作用。
Bartke A[9], 等报告，不论是含有低异黄酮还是高异黄酮的大豆饮食，均能使空腹血糖水平降低，并且改善葡萄糖耐受性。也就是说与异黄酮含量无关，可能是膳食大豆蛋白降低了空腹血糖，提高了葡萄糖耐受能力。Orsolya Mezei等[10] 研究表明，含有大豆异黄酮的的大豆蛋白能够改善改善脂质代谢，激活PPAR受体,具有抗糖尿病作用。
此前不久，我们研究[11 、 12]报告， 冷冻处理的毛豆中异黄酮含量最低，但是冷冻处理的毛豆灌胃给药2.20g/kg，连续灌胃28d后,对糖尿病小鼠血糖降低作
用明显, 小鼠空腹血糖比实验前降低29.78％，这可能是大豆蛋白、膳食纤维、
异黄酮等活性物质共同作用的结果。本发明报告发现毛豆水提取物具有抗糖尿病
作用，其主要活性物质是脱落酸。据报道显示[89]成熟大豆中脱落酸含量几乎为零，在毛豆中均有脱落酸分布，经检测毛豆脱落酸含量从2-30mg/kgfw。本发明报告每公斤毛豆水提取物含有500mg以上脱落酸。
本发明公开对果糖诱导胰岛素抵抗小鼠，施以脱落酸0.75mg/kg 就能明显地降低胰岛素抵抗小鼠的空腹血清血糖、空腹血清胰岛素水平和空腹胰岛素抵抗耐受指数（FIRI）。
本发明公开毛豆水提取物对于高脂饲料饲养的db/db小鼠以链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）所致2型糖尿病小鼠具有降糖、降脂等作用。
发明内容
本发明提供了菜用大豆水提取物的制备方法，其特征在于:新鲜菜用大豆经真空冷冻干燥，冷水提取，所得提取物，经HPLC测定含有脱落酸。菜用大豆水提取物具有降血糖、改善葡萄糖耐量、调节血脂以及保护和修复受损胰岛的作用。脱落酸，能显著提高果糖诱导的胰岛素抵抗小鼠胰岛素的敏感性，防止胰岛素抵抗。脱落酸能够很好地改善高脂饲料饲养的小鼠血清中的TC、TG、HDL-C水平，明显降低肝脏中MDA含量，升高SOD含量；脱落酸可以降低肥胖小鼠的体重，减少小鼠腹部脂肪，因此脱落酸具有抗肥胖效果。
本发明的积极效果在于：首次公开菜用大豆水提取物对2型糖尿病具有预防治疗作用，降低糖尿病患者空腹血糖和提高糖耐量，可降低糖尿病小鼠肝脏中MDA的含量；首次公开脱落酸具有抗肥胖作用。
本发明可以以单一或组合物的形式通过口服给药方式施用于糖尿病治疗的患者。也可以制成饮品、冲剂等一切具有预防治疗2型糖尿病和其他心血管等疾病的药品、食品、健康功能性食品。
附图 1 脱落酸标准品的高效液相色谱图（图中1为脱落酸）
附图2 杨氏三号毛豆高效液相色谱图（图中1为脱落酸）
附图3 毛豆水提物对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。
实施例1
取新鲜菜用大豆50g稍蒸，去皮，豆粒蒸熟，冷却,真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取10g加50ml水，调pH至3，于10℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入400ml 95%乙醇，并进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末约0.1g。经测定脱落酸0.5mg。
实施例2
取新鲜菜用大豆50g稍蒸，去皮，豆粒蒸熟，真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取10g加50ml水，调pH至4，于10℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入400ml 95%乙醇，并进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末0.095g。经测定脱落酸含量为0.2mg。
实施例3
取新鲜菜用大豆50g稍蒸，去皮，豆粒蒸熟，真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取10g加50ml水，调pH至5，于10℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入400ml 95%乙醇，并进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末0.102g。经测定脱落酸0.1mg。
实施例4
取新鲜菜用大豆500g稍蒸，去皮，豆粒蒸熟，真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取100g加500ml水，调pH至2.8，于4℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入4000ml 95%乙醇，并进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末约0.90g。经测定脱落酸含量5.7mg。
实施例5
取新鲜菜用大豆50g稍蒸，去皮，豆粒蒸熟，真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取10g加50ml水，调pH至3，于20℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入400ml 95%乙醇，并进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末约0.11g。经测定脱落酸0.33mg。
实施例6
取新鲜菜用大豆50g稍蒸，去皮，豆粒蒸熟，真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取10g加50ml水，调pH至3，于25℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入400ml 95%乙醇，并进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末约0.09g。经测定脱落酸0.27mg。
实施例7
取新鲜菜用大豆50g稍蒸，去皮，豆粒蒸熟，真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取10g加50ml水，调pH至3，于25℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入400ml 95%乙醇，并进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末约0.11g。经测定脱落酸0.26mg。
实施例8
取新鲜菜用大豆50g稍蒸，去皮，豆粒蒸熟，真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取10g加50ml水，调pH至2.8，于30℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入400ml 95%乙醇，并进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末约0.10g。经测定脱落酸0.37mg。
实验例 1毛豆提取物中脱落酸含量测定
1 实验材料和药品
成熟大豆购于长春农贸市场，菜用大豆采自加拿大渥太华杨氏3号非转基因品种，脱落酸 （纯度 98%）。
***性试验
色谱柱：大连依利特HypersilODS2（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温：45℃；流动相：甲醇-0.2%磷酸水（55:45），流速：0.8mL/min；检测波长：260 nm；进样量：20 µL。脱落酸对照品和毛豆样品的液相色谱图见附图1和附图2。
1.1 对照品溶液的制备
对照品溶液：精密称取脱落酸对照品5.51 mg，置50 mL容量瓶中，用80%的色谱甲醇定容，摇匀，得到浓度为0.11 mg·mL-1对照品溶液。
1.2 样品处理
样品+80%甲醇研磨，浸提三次，每次4h。三次提取液合并后抽滤，35℃回收甲醇，浓缩至原体积的1/4时，冷却，将PH调至2.8-3之间，用乙酸乙酯萃取两次，每次30min，合并萃取液，回收乙酸乙酯，浓缩至5ml左右，40℃挥干，用甲醇溶解，定容至10ml，过0.45μm的滤膜，备用。
1.3 线性关系考察
线性关系考察
分别精密吸取“1.1”项下的对照品储备液10、20、30、40、50、60 μL，进样，以进样量为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y），建立标准曲线，得回归方程为：Y=1.58×105X-6.29×104 R2=0.9996
结果表明脱落酸在0.1102 µg~3.306 µg范围内线性关系良好。
精密度试验
将“1.1”项下的对照品溶液同上色谱条件连续进样6次，计算脱落酸的峰面积RSD为1.4%。结果表明仪器的精密度良好。
稳定性试验
取同一份样品溶液，在室温下放置，分别于0，1，2，4，8，24 h进样分析，记录脱落酸的峰面积，计算RSD为0.8%，说明供试品溶液在24 h内基本稳定。
重复性试验
取同一批次脱落酸标准品溶液5份，按1.2项下，制备样品溶液，测定峰面积值，计算RSD值，脱落酸RSD分别为2.15%。表明该法重复性良好。
加样回收率试验
精密称取已知含量的杨氏三号毛豆和普通毛豆样品各1.0 g，共12份，分别精密加入0.1102 mg· mL-1对照品溶液0.5 mL，按“1.2”项下的方法制得供试品溶液，进样量20 µL，计算平均回收率。结果杨氏三号毛豆和普通毛豆样品平均
回收率分别为97.3%和101.5%。说明样品回收率良好。
表1样品中脱落酸的含量（mg/g）
| 样品 | 样品重（g） | 含量(mg/g） |
| 成熟大豆 | 1.41 | - |
| 杨氏三号毛豆 | 1.07 | 5.71 |
| 市售普通毛豆 | 1.00 | 1.09 |
脱落酸，是一种能够抑制植物生长的植物激素。有报道显示成熟大豆中脱落酸含量几乎为零，只有新鲜毛豆中存在脱落酸。近年来，研究表明脱落酸具有抗糖尿病的作用。Sheth D.B.等指出，脱落酸不仅能够用于改善糖耐量，胰岛素抵抗也可用于改善代谢紊乱。
实验例 2 脱落酸对果糖诱导的胰岛素抵抗小鼠的作用
胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）是近些年来学术界争相探讨的热点之一，随着研究的不断升温，有关胰岛素抵抗的研究领域逐渐从内分泌学科扩展到心血管病学科、肾病学科和神经病学科等多个交叉学科之中。据报道，目前对于治疗胰岛素抵抗比较有效的药物是烷二酮类。如吡格列酮，它可以通过改善2型糖尿病患者的肌肉、脂肪、肝脏的胰岛素抵抗，从而达到保护胰岛β细胞的功能。但这些药物对于胰岛素抵抗的治疗都具有一定的副作用。因此，寻找一种天然，低副作用的药物具有重要的意义。Sheth等指出脱落酸（ABA）对胰岛素抵抗大鼠有调节改善的作用。本实验例用不同剂量脱落酸对果糖诱导的胰岛素抵抗小鼠的影响。
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂
表2-1 主要试剂
2.1.2 实验仪器
表2-2 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 实验动物
雄性ICR小鼠，体重为18~23g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号SCXK（吉）-2011-0004。饲养温度为23±3℃，湿度为50±3%，适应性饲养7d，适应期间饲料为普通饲料，小鼠自由饮食、饮水。
2.2.2 分组与给药
ICR小鼠（18~23g），随机分为六组（n=10），饲养条件（12h光照/黑暗周期，24℃，湿度35~60%），正常对照组（纯净水和普通饲料，30d），模型组（10%果糖水和普通饲料，30d），阳性对照组（10%果糖水和普通饲料，灌胃给药15mg/kg的盐酸吡格列酮），低剂量组（10%果糖水和普通饲料，灌胃给药0.75mg/kg脱落酸），中剂量组（10%果糖水和普通饲料，灌胃给药1.5mg/kg脱落酸），高剂量组（10%果糖水和普通饲料，灌胃给药3mg/kg脱落酸）。记录小鼠每天体重，食物和饮水量，30天后进行血液和组织采集。
2.2.3 空腹血清血糖、空腹血清胰岛素和FIRI
小鼠给药30d后，测定各组小鼠空腹血糖。小鼠禁食12h后（不禁水），眼眶后静脉丛取血，于3500r/min离心10min，分离血清，空腹血清血糖是通过使用葡萄糖测定试剂盒测定。空腹血清胰岛素是通过使用Mouse INS ELISA Kit试剂盒。空腹胰岛素抵抗耐受指数（FIRI）的计算公式如下：FIRI=空腹血清血糖（mg/dL）×空腹血清胰岛素（μU）/25
2.2.4 血脂测定
小鼠给药30d后，小鼠禁食12h后（不禁水），眼眶后静脉丛取血，于3500r/min离心10min，分离血清，按照试剂盒说明书使用连续光谱扫描式酶标测定总胆固醇（TC）、总甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）。
2.2.5 肝脏和肌肉糖元
将肝脏和大腿肌肉组织取出，用生理盐水洗净并用滤纸去除血液，称重，按照肝/肌糖元试剂盒说明书，使用连续光谱扫描式酶标仪进行测定。
2.2.6 数据统计
数据结果以平均值±标准差来表示。用SPSS17.0软件进行统计学分析，使用one-way ANOVA法，方差采用LSD法分析处理数据。
2.3 结果分析
2.3.1 脱落酸对胰岛素抵抗小鼠空腹血清血糖、胰岛素和FIRI的影响
表2-3脱落酸（ABA）对胰岛素抵抗小鼠血糖、血清胰岛素的影响
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表2-3可知，小鼠通过30d的 10%果糖喂养，检测其血清参数。根据Mouse INS ELISA Kit试剂盒方法分别于96孔板加样，做出标准曲线：Y=0.0161X+0.0862，R2=0.999，结果表明，果糖显著增加血清空腹血糖浓度（P＜0.001），血清胰岛素（P <0.001）和FIRI（P <0.001）。对照组吡格列酮（10mg/kg）和给药组脱落酸为（0.75、1.5、3mg/kg）相比均呈现出显著降低血清空腹血糖。与空白组相比，模型组显著性（P＜0.001）。与模型组相比，所有治疗组小鼠空腹血糖均有降低的趋势，其中，吡格列酮和脱落酸低、高剂量作用显著（P＜0.05），中剂量作用显著（P＜0.01），因此，脱落酸能够降低胰岛素抵抗小鼠的空腹血糖水平。小鼠空腹血清胰岛素与空白组相比，模型组显著（P＜0.001），与模型组相比，所有治疗组小鼠空腹血清胰岛素均有降低的趋势，其中，吡格列酮和脱落酸低、高剂量作用显著（P＜0.01），中剂量作用显著（P＜0.001），因此，脱落酸能够降低胰岛素抵抗小鼠的空腹血清胰岛素。
2.3.2 脱落酸对胰岛素抵抗小鼠血脂的影响
表2-4 脱落酸（ABA）对胰岛素抵抗小鼠血脂的影响
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表2-4可知，与正常对照组相比，模型组小鼠的TC、TG显著差异（P＜0.01），HDL-C显著降低（P＜0.05）。脱落酸高剂量与模型组相比，TC、TG显著降低（P＜0.05），其效果与阳性对照组（盐酸吡格列酮）相似。表明阳性药和ABA均能很好的降低胰岛素抵抗小鼠的TC、TG。对HDL-C水平的影响，ABA中、高剂量组在一定程度上升高小鼠血清中HDL-C水平，与模型组相比，显著性差异（P＜0.05）。ABA给药组能够改善小鼠血清中HDL-C水平。
2.3.3 脱落酸对胰岛素抵抗小鼠肝糖元、肌糖元的影响
表2-5脱落酸（ABA）对胰岛素抵抗小鼠肝糖元、肌糖元的影响
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表2-5可知，与正常对照组相比，模型组小鼠的肝糖元显著差异（P＜0.001），肌糖元显著差异（P＜0.01）。脱落酸中、高剂量与模型组相比，肝糖元显著增加（P＜0.05），脱落酸高剂量与模型组相比，肌糖元显著增加（P＜0.05），其效果与阳性对照组（盐酸吡格列酮）相似。表明脱落酸中剂量给药组能够改善小鼠肌糖元水平，高剂量给药组可以改善小鼠肌、肝糖元水平。
2.4 结论
脱落酸能够明显降低胰岛素抵抗小鼠的空腹血糖水平和空腹血清胰岛素；
高剂量的脱落酸（3(mg/Kg)不仅降低了升高的空腹血清血糖和胰岛素，而且显著降低小鼠血清中甘油三酯、胆固醇水平，改善高密度脂蛋白胆固醇水平，而且还增加了肝脏和肌肉糖元含量。
实验例
3
菜用大豆水提取物对小鼠
2
型糖尿病
3.1 实验材料
3.1.1主要试剂
表3-1 主要试剂
基础饲料、高脂饲料均购自于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，其组成配方如下：
表3-2 饲料组分表（g/100g）
3.1.2实验仪器
表3-3 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1实验动物
SPF级雄性ICR小鼠（18~22g），购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号SCXK（吉）-2011-0004。饲养温度为23±3℃，湿度为50±3﹪，适应性饲养7d，适应期间饲料为普通饲料，小鼠自由饮食、饮水。
3.2.2 动物模型的建立
ICR小鼠适应性饲养7 d，随机抽取10只作为正常对照组，其余小鼠给予高脂饲料喂养4周后造模，造模前禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射STZ 100 mg/kg（溶于0.1 M 新配制的柠檬酸缓冲盐溶液中，PH=4.5）继续给予高脂饲料喂养4周后，尾静脉采血测定空腹血糖值（fasting blood glucose，FBG）水平，选取FBG≥7.8 mmol/L的小鼠作为糖尿病造模成功的小鼠，选取其中40 只实验使用。
0.1M 柠檬酸缓冲盐溶液的配制：称取2.10 g柠檬酸溶于 100 mL 纯净水中，配成 0.1M 柠檬酸溶液a。再称取 2.94 g 柠檬酸钠溶于 100 mL 纯净水中，配成 0.1 M 柠檬酸钠溶液 b。准确量取 57 mL 溶液 a与 43 mL 溶液 b充分混匀，配成 100 mL 缓冲液。将缓冲液调至PH=4.5，过 0.22 μm 滤膜，置 4℃冰箱冷藏。
STZ 溶液的配制：将新配制的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配成10 mg/mL 的STZ溶液，注意避光。
3.2.3 分组与给药
将糖尿病小鼠随机分成4 组（n=10），分别为模型组（灌胃给药0.9%的生理盐水）、阳性对照组（灌胃给药盐酸二甲双胍250mg/kg）、低剂量组（灌胃给药0.25g菜用大豆水提物）、高剂量组（灌胃给药0.5g/kg菜用大豆水提物），正常对照组（灌胃给药0.9%的生理盐水），记录小鼠每天体重，食物和饮水量，4周后进行血液和组织采集。
3.2.4 空腹血糖的测定
给药四周后，小鼠禁食不禁水12h，眼眶后静脉丛取血，于3500r/min离心10min，分离血清，通过使用葡萄糖测定试剂盒测定，测定小鼠空腹血糖。
3.2.5 口服糖耐量的测定
第27天给药前禁食12 h，给药1 h后，灌胃给药葡萄糖2g/kg，分别测定小鼠0min，30min，60min，120min的空腹血糖。采用血糖仪测定其口服葡萄糖耐受量（oral glucose tolerance
test，OGTT）水平。
3.2.6 血脂测定
末次给药前禁食不禁水12 h，摘除眼球采血，放置30 min后在4200 r/min条件下离心，取血清测定总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density
lipoprotein-cholesterol，HDL-C）含量。
3.2.7 肝脏中MDA、SOD的测定
小鼠摘除眼球取血后，脊椎脱臼处死，迅速摘取肝脏，肝脏取0.5g左右，按 1：9 的比例加入 4℃生理盐水，匀浆，以 4200r/min 转速反复离心，取上清液，测定肝脏中 MDA 和 SOD 的含量。
3.2.8 脏器指数测定
小鼠摘除眼球取血后，脊椎脱臼处死，取小鼠脏器，用带冰的生理盐水吸取脏器上的血，称量脏器湿质量，计算脏器指数。
3.2.9 数据处理
数据结果以平均值±标准差来表示。用SPSS17.0软件进行统计学分析，使用one-way ANOVA法，方差采用LSD法分析处理数据。
3.3 结果与分析
3.3.1 对糖尿病小鼠状态、体重、饮食、饮水的影响
造模成功的小鼠会出现“三多一少”的症状，随着给药时间的增加，模型组与正常组相比，小鼠平均体重最小，饮食、饮水相应的都会减少，而二甲双胍及其脱落酸给药组与模型组相比并没有显著差异。
3.3.2对糖尿病小鼠血糖的影响
由附图3可知，与空白对照组相比，模型组小鼠空腹血糖具有极显著性差异（P<0.001），持续给药四周后，与模型组相比，阳性组与毛豆提取物高剂量组小血糖显著降低，差异极显著（P<0.01），而毛豆提取物低剂量组小鼠血糖也有所降低，但无显著性差异，无统计学意义。
3.3.3对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响
表3-4毛豆提取物对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表3-4可知，与正常组相比，模型组小鼠在0、0.5、1、2h时的糖耐量均具有显著性，说明本实验造模成功。与模型组相比，给药组在这四个时间段的糖耐量及曲线下面积（AUC）均有不同程度的降低，高低剂量AUC与模型组相比有显著性（P<0.05），说明毛豆提取物具有提高小鼠口服糖耐量的效果。
3.3.4对糖尿病小鼠血脂的影响
表3-5毛豆提取物对糖尿病小鼠血脂的影响
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表3-5可知，与正常对照组相比，模型组小鼠的TC、TG显著差异（P＜0.001），毛豆提取物高剂量与模型组相比，TC显著降低（P＜0.01）TG显著性降低（P＜0.001），其效果与阳性对照组（二甲双胍）相似。毛豆提取物低剂量组仅对糖尿病小鼠的TG水平有明显降下作用。
3.3.5对脏器指数影响
表3-6毛豆提取物对2型糖尿病小鼠脏器指数的影响（Mean±SD，mg/g）
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表3-6可知，与正常对照组相比，糖尿病小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺和胰腺指数均有极显著性差异，肝脏和胸腺显著性差异（P<0.001），脾脏，肾脏和胰腺显著性差异（P<0.01），说明糖尿病小鼠的脏器已经发生病变。毛豆提取物低、高剂量组的肝脏指数与模型组相比均有极显著差异（P<0.001），说明毛豆提取物低、高剂量对糖尿病小鼠的肝脏具有一定的保护作用。毛豆提取物低剂量组对糖尿病小鼠的脾脏、肾脏、胸腺和胰腺指数的影响与模型组相比显著性差异（P<0.05），而毛豆提取物高剂量组对糖尿病小鼠的肾脏和胰腺指数的影响与模型组相比有显著性差异（P<0.01），胸腺指数与模型组相比也有显著性差异（P<0.05），脾脏指数与模型组相比并无显著性差异。说明毛豆提取物低剂量对糖尿病小鼠整体脏器指数均有显著性影响，毛豆提取物高剂量对除脾脏之外的脏器均有显著性影响。
3.3.6 毛豆提取物对糖尿病小鼠肝脏中MDA和SOD的影响
表3-7 毛豆提取物对肝脏中MDA和SOD的影响
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表3.7可知，与空白组相比，模型组MDA含量有显著性差异（P<0.001），阳性药组与模型组相比，显著性差异（P<0.001），毛豆提取物低、高剂量与模型组相比，均具有显著性差异（P<0.01）说明毛豆提取物低、高剂量均可降低糖尿病小鼠肝脏中MDA的含量。
由表3.7可知，与空白组相比，模型组SOD含量有显著性差异（P<0.001），阳性药组与模型组相比，显著性差异（P<0.001），毛豆提取物低、高剂量与模型组相比，均具有显著性差异，且低剂量显著性差异（P<0.05），高剂量显著性差异（P<0.001）说明毛豆提取物低、高剂量均可升高糖尿病小鼠肝脏中SOD的含量，但毛豆提取物高剂量的效果较为明显。
实验例 4 脱落酸对肥胖小鼠抗肥胖作用
随着人们生活水平的提高，肥胖的现象越来越普遍，很多人认为这只是由于饮食过度，缺乏运动造成的，而并非是一种疾病，但随着肥胖所带来的并发症日益增多，肥胖病越来越得到人们的重视。目前比较普遍的抗肥胖药物主要有盐酸芬特明、盐酸安非拉酮和奥利司他等几个品种可供选择，且伴有一定的副作用。因此，寻找一种天然的药物来代替这些减肥药亦将成为人们关注的重点。
4.1实验材料
4.1.1主要试剂
表4-1 主要试剂
Tab.4-1 Reagent used in this chaper
基础饲料、高脂饲料均购自于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，其组成配方如下：
表4-2 饲料组分表（g/100g）
4.1.2实验仪器
表4-3 实验仪器
Tab.4-3 Apparatus used in this
chapter
4.2 实验方法
4.2.1实验动物
雄性ICR小鼠60只，体重约为18~22g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号SCXK（吉）-2011-0004。饲养温度为23±3℃，湿度为50±3﹪，适应性饲养7d，适应期间饲料为普通饲料，小鼠自由饮食、饮水。
4.2.2 肥胖模型的建立
将适应性饲养一周的小鼠称重、记录。从中随机挑选出10只小鼠作为空白对照组，喂食普通饲料，直到实验结束。其他小鼠喂食高脂饲料配搭普通饲料 1 周后，继续以全高脂饲料喂养4 周，每周称量一次体重，4周后选取高脂饲料喂养组小鼠重量比空白组体重高 20%的小鼠40只，作为肥胖小鼠，供实验使用。
4.2.3分组与给药
将肥胖小鼠随机分为4组（n=10），饲养条件（12h光照/黑暗周期，24℃，湿度35~60%），空白对照组（纯净水和普通饲料，4周），模型组（纯净水和高脂饲料，4周），阳性对照组（纯净水和高脂饲料，灌胃给药100mg/kg的左旋肉碱，4周），脱落酸低剂量组（纯净水和高脂饲料，灌胃给药1.5mg/kg脱落酸，4周），脱落酸高剂量组（纯净水和高脂饲料，灌胃给药3mg/kg脱落酸，4周）。记录小鼠的基本生理指标，如体重，摄食量和饮水量，4周后进行血液和组织采集。
4.2.4 血脂测定
小鼠给药4周后，小鼠禁食12h后（不禁水），眼眶后静脉丛取血，于3500r/min离心10min，分离血清，按照试剂盒说明书使用连续光谱扫描式酶标测定总胆固醇（TC）、总甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）。
4.2.5肝脏中MDA和SOD的测定
小鼠摘除眼球取血后，脊椎脱臼处死，迅速摘取肝脏，肝脏取0.5g左右，按 1：9 的比例加入 4℃生理盐水，匀浆，以 4200r/min 转速反复离心，取上清液，测定肝脏中MDA和SOD 的含量。
4.2.6 脏器指数测定
小鼠摘除眼球取血后，脊椎脱臼处死，解剖，快速摘取小鼠肝脏、脾脏、肾脏、腹部脂肪、肾周围脂肪，用带冰的生理盐水吸取脏器上的血，称量脏器湿质量，计算脏器指数。
4.2.7统计学分析
数据结果以平均值±标准差来表示。用SPSS17.0软件进行统计学分析，使用one-way ANOVA法，方差采用LSD法分析处理数据，P<0.05表示具有统计学意义。
4.3 结果与分析
4.3.1 给药期间小鼠摄食量及饮水量的变化
在小鼠正常饲养期间，各组小鼠的摄食量与饮水量并无明显变化，体重的增长情况也无明显差异，造模期间，喂食高脂饲料的小鼠摄食量明显高于空白对照组，平均每天的摄食量比空白对照组多1-2g/只，饮水量较空白对照组也有所增涨，但无显著性差异。给药期间，空白对照组与模型组小鼠的摄食量及饮水量均无明显变化，阳性给药组在给药第2周开始，摄食量略有减少，平均每天减少1-2g/只，而脱落酸低、高剂量给药组在给药第3周开始，摄食量才略有减少，但无明显变化。由此看出，脱落酸对肥胖小鼠的摄食量抑制作用较小，并无显著性差异，可以推测出，脱落酸的抗肥胖作用并非是通过控制小鼠摄食量与饮水量来达到减肥的效果，可能是其他方面原因起到的抗肥胖作用。
4.3.2给脱落酸（ABA）期间小鼠体重的变化
表4-4给药期间小鼠体重的变化
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表4-4可知，在4周给药期间，空白组小鼠体重与模型组小鼠体重均平稳增长，且模型组小鼠体重与空白组小鼠体重呈极显著性。阳性组小鼠体重呈显著降低（P<0.01），而脱落酸低剂量给药组的小鼠体重几乎不变，高剂量组小鼠体重在第4周时呈显著性降低（P<0.05），说明高剂量的脱落酸可以降低肥胖小鼠的体重。
4.3.3 脱落酸（ABA）对小鼠器官和脂肪的影响
表4-5 脱落酸（ABA）对小鼠脏器指数的影响（Mean±SD，mg/g）
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
由表4-5可知，与空白组相比，模型组小鼠的肝、肾具有显著性（P<0.05），肾周脂肪和腹部脂肪具有极显著性，分别为P<0.01和P<0.001。与模型组相比，阳性组的肾周脂肪与腹部脂肪具有显著性差异（P<0.05），脱落酸低剂量组只对小鼠肝脏就有显著性影响（P<0.05），脱落酸高剂量组对小鼠肝脏及其腹部脂肪有显著性影响（P<0.05）通过上述结果可知，脱落酸高剂量具有一定的抗肥胖效果。
4.3.4 脱落酸（ABA）对小鼠血脂的影响
表4-6 脱落酸（ABA）对小鼠血脂的影响
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
肥胖患者多伴有高血脂症，即血清中的胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平过高，高密度脂蛋白（HDL-C）水平过低等情况。由表4-6可知，高脂饮食已经显著增加了模型组小鼠的血脂水平，与空白组相比，TC、TG均具有显著性（P<0.001），HDL-C具有显著性（P<0.01）。脱落酸高剂量组与阳性药组相似，显著降低了TC水平（P<0.001），升高了HDL-C水平（P<0.01），但对TG水平并无显著性影响。脱落酸低剂量在影响TC、HDL-C水平的同时，也对TG水平有着显著性影响（P<0.05）。综上所述，脱落酸能够很好的改善小鼠血清中的TC、TG、HDL-C水平，其中脱落酸低剂量的效果最好。
4.3.5脱落酸对小鼠肝脏中MDA和SOD含量的影响
表4-7 脱落酸（ABA）对肝脏中MDA和SOD的影响
注：*表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.01），***表示模型组与空白组相比，显著性（P＜0.001）。#表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.01），###表示给药组与模型组相比，显著性（P＜0.001）。
肥胖患者不仅会造成血清中血脂的变化，也会影响肝脏中SOD、MDA的含量，一般表现为SOD降低和MDA升高，以此来反映肥胖的程度。由表4-7可知，高脂饲料的喂养，使小鼠肝脏中的MDA含量升高，形成肥胖小鼠，与空白对照组有显著性差异(P<0.001)，通过4周的给药后，阳性给药组与脱落酸高剂量组降低了小鼠肝脏中的MDA含量，与模型组相比有显著性差异(P<0.05)，但脱落酸低剂量组与模型组相比并无显著性差异。由表4-7可知，模型组小鼠与空白对照组小鼠相比SOD含量显著下降(P<0.001)，通过4周的给药，各给药组的SOD含量均有不同程度的降低，其中效果最好的为脱落酸高剂量组，显著性差异(P<0.01)，其次是阳性组与脱落酸低剂量组，著性差异(P<0.05)，综上所述，脱落酸高剂量较脱落酸低剂量更能够在降低MDA含量，升高SOD含量上起到较为明显的作用。
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Claims (6)
1.一种菜用大豆提取物的制备方法，具体方法如下：
取新鲜菜用大豆，稍蒸，去皮取出豆粒蒸熟，冷却,真空冷冻干燥，然后粉碎过60目筛，称取一定量加5倍水，调pH 2.8-5，于4-30℃条件下提取2h，离心过滤，残渣如前再行提取过滤，合并2次滤液，徐徐加入4倍量的 95%乙醇，同时进行搅拌，低温条件下回收酒精，水溶液再行真空冷冻干燥，得干燥粉末。
2.根据权利要求1，菜用大豆提取物用HPLC测定，由于不同处理方法，毛豆提取物所含有的脱落酸各不相同，从0.1-0.6mg/g。
3.脱落酸能显著提高果糖诱导的小鼠胰岛素的敏感性，有效地防止胰岛素抵抗。
4.脱落酸能够很好地改善高脂饲料饲养的小鼠血清中的TC、TG、HDL-C水平，明显降低肝脏中MDA含量，升高SOD含量，脱落酸可以降低肥胖小鼠的体重，减少小鼠腹部脂肪，因此脱落酸具有抗肥胖效果。
5.根据权利要求1，毛豆水提取物明显降低糖尿病小鼠空腹血糖，明显改善2型糖尿病小鼠口服糖耐量，毛豆水提取物可明显降低2型糖尿病小鼠肝脏中MDA的含量和提高SOD的含量，毛豆水提取物对糖尿病小鼠的肝脏具有一定的保护作用，毛豆提取物对糖尿病小鼠的脾脏、肾脏、胸腺和胰腺指数的影响与模型组相比均有显著性差异，对各脏器均有积极保护作用。
6.根据权利要求1，菜用大豆水提取物含有脱落酸具有防止胰岛素抵抗、抗肥胖、抗糖尿病作用，可以应用于糖尿病预防及治疗药品的开发，也可应用于相关领域的食品及保健品的开发。
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