CN101953862A - 五加属植物提取物、其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明关于五加属植物(Eleutherococcus spp.)提取物及其制备方法。本发明亦关于使用本发明五加属植物提取物于治疗或预防至少一种代谢症候群症状的用途。

Description

五加属植物提取物、其制备方法及其用途
技术领域
本发明系关于中草药提取物及其制备方法。本发明亦关于所述的提取物于治疗或预防代谢症候群的用途。
背景技术
代谢症候群亦称为X症候群、胰岛素阻抗症候群、雷文氏症候群(Reaven’s syndrome)及致命四重奏(deadly quartet)，其代表心血管疾病危险因子的汇集。美国国家胆固醇教育计划(NCEP)、世界卫生组织(WHO)、国际糖尿病联盟(IDF)及美国内分泌学学院等机构针对代谢症候群提出多种定义。一般而言，代谢症候群的定义系指一个体具有下述至少两种或以上的特征：依据腰围所定义的中央肥胖、高血压(例如大于或等于140/90mmHg)、高三酸甘油酯、高空腹血糖及低量的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇。
一般而言，罹患代谢症候群中的个别疾病系分别以不同的药物治疗。利尿剂及ACE抑制剂可用于治疗高血压；胆固醇药物则用于降低LDL胆固醇及三酸甘油脂，并可提高HDL胆固醇浓度。缓解胰岛素抗性的药物，诸如甲福明(metformin)及胰岛素增敏药物(thiazolidinediones(TZD))亦可用于治疗代谢症候群。
原名Acanthopanax senticosus(Araliaceae)的刺五加Eleutherococcus senticosus(Ruper.Et Maxim.)Maxime广泛地单独或与其它中草药合并使用来治疗疾病。JP2003-277282及JP 2006-234603揭示自刺五加Acanthopanaxsenticosus Harms提取医药化合物的方法。JP 2007-277128关于利用五加属植物粉末作为治疗肥胖、糖尿病及高脂血症的中草药的活性成分。JP 2006-348054则建议Acanthopanaxdieboldianus的水提取物、醇提取物、醚提取物及酮提取物具有抑制脂酶的功效，且所述的提取物可有效预防或治疗肥胖及高脂血症。然而，JP 2006-348054仅证明水提取物在活体外抑制脂酶的IC50为170μg/0.5ml值。Hikino H等人(J.Nat.prod.，1986，49(2)；293-7)及Medon P.J等人(Zhongguo YaoLi Xue Bao.，1981，2(4)：281-5)揭示对老鼠投与EleutheroCoccus sent：Cosus提取物可有效降低血糖浓度。CN 101356968揭示台湾何首乌Polygonum multiflorum Thunb.Ex Murrayvar.hypoleucum(Ohwi)具有改善代谢症候群的功效。
由于代谢症候群患者有日益增加的趋势，本发明因此关注于代谢症候群的治疗。
发明内容
本发明的一目的为提供一种制备五加属植物提取物的方法。
本发明的另一目的为提供一种五加属植物提取物。
本发明的又一目的为提供一种包含本发明五加属植物提取物的组合物。
本发明的又一目的为提供一种预防或治疗个体罹患代谢症候群的至少一种病症的方法，其包括投与本发明组合物至有需要的个体。
本发明的又一目的为提供一种预防或治疗个体罹患脂联素相关疾病的方法，其包括投与本发明组合物至有需要的个体。
本发明的又一目的为提供一种预防或治疗个体罹患过氧化体增殖剂活化受体γ(PPARγ)相关疾病的方法，其包括投与本发明组合物至有需要的个体。
本发明的又一目的为提供一种降低个体氧化压力的方法，其包括投与本发明组合物至有需要的个体。
本发明的再一目的为提供一种本发明五加属植物提取物于制备用于预防或治疗代谢症候群的至少一种病症的药物的用途。
本发明的再一目的为提供一种本发明五加属植物提取物于制备用于预防或治疗脂联素相关疾病的药物的用途。
本发明的再一目的为提供一种本发明五加属植物提取物于制备用于预防或治疗过氧化体增殖剂活化受体γ(PPARγ)相关疾病的药物的用途。
本发明的再一目的为提供一种本发明五加属植物提取物于制备用于降低氧化压力的药物的用途。
本发明在以下部分中详细描述。本发明的其它特征、目的及优点可易见于本发明的实施方式及申请专利范围中。
附图说明
图1显示本发明红毛五加提取物不仅可促进PPARγ的活性，且可提高3T3-L1细胞内PPARγ量，其中「Trog」及「EA16」分别代表曲格列酮及红毛五加50％EtOH-EtOAc提取物；及
图2显示SD大鼠口服葡萄糖耐受性试验第四周的结果，其中所载数据以平均值±标准偏差表示(n＝7~8)，*、#分别表示与正常对照组(C)、高果糖对照组(F)间具有统计上明显差异(p＜0.05)。
具体实施方式
除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应具有一般技术者通常理解的含义。术语的含义及范畴应为明确的；然而，若存在任何潜在含糊性，则本文所提供的定义优先于任何词典或外来定义。
除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
除非另外指示，否则应了解如本案所用的以下术语具有以下含义：
如本文所用的术语「预防」表示延缓易罹病个体的症状的起始或降低病症的发生。
术语「治疗」表示减少及/或改善罹病个体的症状。
术语「个体」表示动物，特别是哺乳动物。根据本发明的较佳实施例，「个体」系指人类。
术语「治疗有效量」表示一活性成分单独或与其它治疗/药物合并使用时的用量，所述的用量足以显示治疗功效。
术语「载剂」或「医药可接受的载剂」系指稀释剂、赋形剂、接受体(acceptors)或类似物，其为制造医药组合物技术中的一般技术者所熟知。
术语「五加属植物(Eleutherococcus sp.)」系指五加属植物的根部、叶子、茎部及/或整株植物，较佳者，五加属植物为刺五加(E.senticosus(Ruper.Et Maxim)Maxim)、红毛五加(E.giraldii)及三叶五加(E.trifoliatu)。根据本发明，植株系未经加工或经诸如干燥、切片或研磨等加工处理。
制备方法
根据本发明，制备五加属植物提取物的方法包括下述步骤：
a)以醇类溶液提取五加属植物；及
b)自步骤a)所得提取物中移除固体部分，即制得五加属植物提取物。
根据本发明的方法，五加属植物的重量与醇类溶液体积的比例为约1/5至约1/50，较佳者为约1/10至约1/30，更佳者则为约1/20。
根据本发明的方法，术语「醇类溶液」系指绝对醇类或藉由混合醇类及水所得的溶液。根据本发明，所述的醇类为具有1至6个碳原子的直链或支链烷基部分，较佳者为1至4个碳原子，更佳者为1至3个碳原子。例如，所述的醇类为甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。较佳者，所述的醇类为甲醇或乙醇。
根据本发明方法，醇类溶液中醇类浓度为约30至100v/v％。本发明的一较佳实施例，所述的醇类溶液为约30至100v/v％、较佳者为约40至90v/v％、更佳者为约50至70v/v％的甲醇。另一较佳实施例，所述的醇类溶液为约30至100v/v％、较佳者为约40至90v/v％、更佳者为约50至70v/v％的乙醇。
根据本发明方法，提取步骤a)可用任何习知方法实施，例如煎煮、浸泡、超音波提取法、搅拌、摇晃或其组合。提取时间为约1至约48小时、较佳者为约12至36小时、更佳者为约24小时。提取温度为约20至45℃、较佳者为约25至35℃。
根据本发明方法，步骤b)中所述的固体部分可由任何习知方法移除，例如经由纱布过滤、离心或其组合。
根据本发明方法，其可进一步包括步骤c)以任何习知方法浓缩五加属植物提取物，例如冷冻干燥或蒸发(J.Pharmacol.Sci.，99：294-300，2005及J.Chromatography，932：91-95，2001)以获得经浓缩的五加属植物提取物。
根据本发明方法，自步骤c)所得的所述的经浓缩的五加属提取物可进一步藉由具有中度至高度极性的溶剂提取/分配，以获得第二五加属植物提取物。根据本发明，所述的具有中度至高度极性的溶剂可为技艺人士所熟知者，例如醚类、醇类、酯类或其混合物。可作为溶剂的实例包括，但不限于异丁醇、正丁醇、乙酸丁酯、氯仿、乙酸乙酯及其混合物。经浓缩的五加属植物提取物与溶剂的v/v比为约1∶1至1∶4。
根据本发明方法的一较佳实施例，所述的溶剂为乙酸乙酯且藉由液液提取法进行提取(Free Radic Res.，38(1)：97-103，2004及J.Herb.Pharmacother.，7：107-128，2007)。一般系将经浓缩的五加属植物提取物与乙酸乙酯接触，随后以约1∶1v/v的比例加入0.5％碳酸氢钠至酯层以移除脂肪酸(Biosci.Biotechnol.Biochem.62(3)：532-534，1998)。
组合物
本发明提供一种包含治疗有效量的本发明五加属植物提取物的组合物。本发明组合物可作为食品组合物或医药组合物。
本发明组合物可藉由任何适当途径投与至个体，例如口服投与。本发明组合物适当调配形式包括，但不限于锭剂、喉片、硬式或软式胶囊、水性或油性悬浮液、乳剂、可分散粉末或颗粒、糖浆或酏剂(elixir)。如需要，可针对所述的组合物灭菌或与任何医药可接受的载剂，例如安定剂、湿化剂等混合。
本发明组合物可藉由任何习知方法与习知医药可接受的赋形剂予以混合。因此，欲用于口服的本发明组合物可包含，例如一或多种呈色剂、甜味剂、增味剂及/或保存剂。
本发明组合物可与其它一或多种目前正在使用的药物(例如，降脂药物、抗糖尿病药物及抗氧化药物)并用，以治疗代谢症候群。
用途
本发明组合物可用于预防或治疗至少一种、较佳为二或多种代谢症候群的症状。代谢症候群的主要症状包括，但不限于肥胖、腹部肥胖、血脂异常、葡萄糖耐受异常、心血管疾病、胰岛素阻抗及II型糖尿病(Life Sci.，2003，73：2395-2411)。
本发明组合物可用于抑制乙酰辅酶A羧化酵素(acetyl-CoAcarboxylase，ACC)的活性。ACC是脂肪酸合成的关键酵素，其产物丙二酰基辅酶A(malonyl-CoA)为脂肪酸合成酵素(fattyacid synthase，FAS)的受质，且是肉酸素棕榈酰转移酶(carnitin palmitoyl CoA transferase，CPT)的抑制剂。因此抑制ACC不但可以降低三酸甘油脂的合成，也可减少脂肪酸的合成。(Kusunoki等人，Endocrine，29：91-100，2006、Abu-Elheigh等人，PNAS，100：10207-10212、Arbeeny等人，J.Lipid Res.，33(6)：843-851，1992、Rose-kahn及Bar-Tana，Biochem.Biophys.Acta.1042：259-264，1990及Harwood，Expert.Opin.Ther.Targets，9(2)：267-281，2005)。
本发明组合物可用于预防或治疗脂联素相关的疾病，其包括，但不限于肥胖、胰岛素阻抗、高血糖症及动脉粥状硬化(J.Cardiometab.Syndr.，2007，2(4)：288-294及J.Clin.Endocrinol.Metab.，2005，90：4792-4796)。
本发明组合物可用于活化PPARγ。PPARγ的活化可诱发前脂肪细胞的分化及脂肪的代谢，亦可改善细胞的胰岛素敏感性(Endocrine Rev.，1999，20：649-688)。
本发明组合物可用于清除活性氧化物质(reactive oxygenspecies(ROS))，例如用作抗氧化剂。ROS过量是有害且对细胞及组织具毒性，其在糖尿病、动脉粥状病变、肾病变及视网膜病变的发生上扮演重要角色(Am.J.Nephrol.，29：62-70，2009及Cardiovascular Diabetology，1：3-32，2002)。膳食抗氧化剂，其对于抗氧化压力具保护作用，已被视为抵抗肝损害、视网膜损害及动脉粥状硬化的治疗剂(Crit.Rev.FoodSci.Nutr.，44：575-586，2004、Diabetes Metab.Rev.，22：38-45，2006及J.Pharmacol.Sci.，99：294-300，2005)。
本领域的技艺人士当可无困难地选择适当的投与途径及剂量以进行治疗。根据本发明，较佳途径为口服投与。剂量则根据疾病的本质及其状况、个体的年纪及健康状况、投与途径及前处理等情形而定。技艺人士当了解剂量会随着个体的年纪、体重、健康状况及其它相关因素而变化。
以下的非限制性的实例有助于本发明技术领域所属的技术人员实施本发明。所述的等实例不应视为过度地限制本发明。本发明技术领域所属的技术人员可在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行修改及变化，而仍属于本发明的范围。
实例
实例1五加属植物提取物的制备
(1)醇类提取物
五加属植物，包括刺五加(Eleutherococcus senticosus(Ruper.et Maxim.)Maxim.)、红毛五加(E.giraldii)及三叶五加(E.trifoliatus)以磨碎机研磨后，以例如50％或70％的甲醇或乙醇(W/V＝1/20)等溶剂萃制24小时，4层纱布过滤后，以减压机予以浓缩。
(2)醇类/乙酸乙酯提取物
取上述50％或70％的甲醇或乙醇提取物，加入等体积乙酸乙酯进行提取。将乙酸乙酯层用5％碳酸氢钠处理以移除脂肪酸后，再浓缩乙酸乙酯层部分，得到甲醇或乙醇/乙酸乙酯(MeOH或EtOH-EtOAc extracts)提取物。
实例2五加属植物取物提取物对ACC的抑制活性
自大鼠肝分离并纯化ACC，以测试自实例1所制得的提取物对于ACC活性的抑制功效，其测试步骤为参考Tanabe等人的方法(Tanabe等人，1981.Methods in Enzymology 71(Pt C)：5-16.)。结果如表1所示，所有提取物均具有抑制ACC的作用。
表1、五加属植物提取物对于ACC活性的抑制功效
Figure GSA00000015057500101
实例3红毛五加提取物对于3T3-L1前脂肪细胞分化的影响
参考Waki等人的方法(2007.Cell Metab.5：357-370)，先将3T3-L1前脂肪细胞以DMEM培养基(4,500mg/L葡萄糖)(含10％小牛血清、2mM麸胺酰胺、100units/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素及110μg/ml丙酮酸钠)在5％CO2培养箱中于37℃下培养。当要诱导分化为脂肪细胞时，加入10ug/ml胰岛素至培养基中(第0天)，培养7天(在第2及第4天时更换新鲜培养基)后更换成一般培养基继续多培养2天。在分化(第0天)及更换培养基时即添加红毛五加提取物至培养基中。以商业套组检测三酸甘油酯(TG)(Triglycerol assay Kit，Audit Diagnostics，Ltd.)、脂联素含量(Quantikine Mouse Adiponectinimmunoassay，R&D systems)及PPARγ结合活性(BDTM TransfactorFamily Colorimetric Kits-PPARαβγ，BD Biosciences或Transcription Factor PPARγ ELISA Kit，Panomics)，并用西方墨点法分析细胞核内PPARγ蛋白质量。结果如表2所示，红毛五加提取物不仅以剂量依赖性关系的方式促进3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞，且同时可促进胞内及分泌型脂联素的分泌。图1则显示，不同于已知PPARγ激动剂曲格列酮(troziglitazone(TGZ))，本发明红毛五加提取物不仅可促进PPARγ的活性，且可提高细胞内PPARγ蛋白质量。
表2、红毛五加提取物对于3T3-L1前脂肪细胞分化的影响
Figure GSA00000015057500111
实例4红毛五加70％乙醇提取物对于具高果糖诱发代谢症候群的SD大鼠的影响
本实例所例示的动物实验用于证明红毛五加提取物对于预防及治疗代谢症候群的功效。将体重约200克雄性Sprague-Dawley大鼠(其系购自台湾BioLASCO)每两只安置于一隔离动物箱中，将动物箱置于光照/黑暗周期为12/12小时，温度范围23±2℃的控制室中。动物可自由摄取食物及饮水。
将大鼠随机分为4组，每组8只。正常对照组C组给予标准饲料(Altromin 1362N，Altromin，Im Seelenkamp，Germany)。另外三组(F、L及H组)则给予40％高果糖饲料以诱发代谢失调症状，其中L及H组除了高果糖饲料外，每只大鼠每天分别灌食94及188mg/kg的70％乙醇红毛五加提取物，而F组则灌食等体积水。
定时测量大鼠的体重及食物摄取量，其中于9:00-11:00AM间测量体重。于实验期间第4和8周对各组大鼠进行口服葡萄糖耐受性试验(OGTTs)，藉此检测胰岛素阻抗的情形。大鼠经隔夜禁食16小时后分别秤重，以尾巴采血取得约0.5mL的空腹血液作为第0分钟的样本，接着立刻灌食10％D-葡萄糖溶液(1.5g/kg体重)。于灌食后的第30、60、90及120分钟再分别采取血液样本(0.5mL)。第4周口服葡萄糖耐受性试验结果如图2所示，在灌食葡萄糖后第60、90和120分钟，F组大鼠的血糖浓度明显高于C组(p＜0.05)，而在第90和120分钟时，不论是L组或H组大鼠的血糖浓度则明显低于F组(p＜0.05)。第8周的口服葡萄糖耐受性试验结果类似第4周的结果。
10周后牺牲大鼠，取其腹睪脂肪组织、肝脏及肾脏并秤重。表3显示经喂食红毛五加提取物10周后，L组及H组大鼠的腹睪脂肪组织相对重量均明显小于F组，且在实验末期，解剖结果亦未发现大鼠器官有异常化的现象。本实验亦测量肝中三酸甘油酯的浓度，发现10周饮食控制后的H组的三酸甘油酯浓度明显低于F组(10.7±1.7mg/g肝vs.12.5±1.4mg/g肝，p＜0.05)。
因此，红毛五加提取物对于改善活体的葡萄糖耐受性及降低腹睪脂肪组织的重量具有极显着的功效。
表3、SD大鼠饮食处理10周后的相对组织脏器重量
Figure GSA00000015057500131
结果以平均值±标准偏差表示(n＝7~8)。*、#分别表示与正常对照组(C)、高果糖对照组(F)间具有统计上明显差异(p＜0.05)。
实例5五加属植物提取物对于高糖诱发HepG2细胞中三酸甘油酯累积的抑制功效
将HepG2细胞以2.5×105cells/well的细胞密度接种植至DMEM-LG(含5.5mM葡萄糖)，于37℃、95％湿度及5％CO2恒温培养箱中培养24小时的后，更换新的培养基。新的培养基分别为DMEM-LG、DMEM-HG(含50mM葡萄糖)及DMEM-HG-提取物(含50mM葡萄糖及五加属植物的不同提取物)继续培养120小时。培养120小时后吸除旧的培养基，以D-PBS清洗两次，加入细胞溶解缓冲液(50mM Hepes，1％ Triton X-100，150mM NaCl，2mMNaVO4，1mM PMSF)，最后测定细胞悬浮液的三酸甘油酯(Triglyceride GPO-PAP kit，E.Merck，Darmstadt，Germany)和蛋白质含量(Bio-Rad Protein assay kit，Bio-Rad，Hercules，CA，USA，)。如表四所示，三叶五加及红毛五加的70％乙醇提取物都可抑制因高葡萄糖所诱发的HepG2细胞中三酸甘油酯的累积，而进一步以乙酸乙酯划分的红毛五加50％乙醇提取物的后，可使其抑制作用更明显。
表4、五加属植物提取物对于高糖诱发HepG2细胞中三酸甘油酯堆积的抑制作用
Figure GSA00000015057500141
Figure GSA00000015057500151
*抑制率％＝(TG试验组-TG高葡萄糖对照组)/(TG低葡萄糖对照组-TG高葡萄糖对照组)×100
实施例六、五加属植物提取物的抗氧化活性测试
体外总抗氧化活性分析为采氧化自由基吸收能力(ORAC(oxygen-radical absorbance capacity))方法(Ou等人，2001.J.Agric.Food Chem.，49：4619-4626及Huang等人，2002.J.Agric.Food Chem.，50：4437-4444)。所述的方法为将20μl空白(blank)(75mM磷酸缓冲液)、0~200μM天然多酚物trolox(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(Aldrich，WI，USA)或根据本发明上述实例所载的不同五加属植物提取物样品分别加至96孔黑色微滴盘后，再加入150μl 96nM的荧光素钠disodium fluorescein(Aldrich)，置于荧光分析仪(Infinite M200 fluorescence microplate reader，TECAN)内混合后，加入30μl的320mM AAPH(2，2’-azobis(2-amidinopropane)dihdrochloride，Aldrich)后，立即放入仪器内即刻读取荧光读值。荧光设定仪设定其激发光为490nm，发散光为530nm。所有五加属植物乙醇提取物均表现相当的抗氧化活性(表5)。除三叶五加以外，其余的乙醇提取物的抗氧化活性均高于其乙酸乙酯划分物。
表5、五加属植物提取物的抗氧化活性
Figure GSA00000015057500152
*TE表天然多酚物等同量。结果以平均值±SD表示(n＝3)。
本实例进一步根据Puhl等人(1994.Methods in Enzymology233：425-441)的方法测试本发明红毛五加50％乙醇/乙酸乙酯提取物的抗氧化能力。首先取得同意采集来自正常血脂健康人的血液，所述的受检者为经过隔夜禁食，将血液以连续超高速离心方法分离得到人类LDL(d＝1.019-1.063g/mL)。接着以含1mmol/L EDTA及0.15mol/L NaCl的PBS(pH 7.4)透析(Miyazaki等人，1994.J Biol.Chem.269：5264-9)。将150μl LDL(100μg蛋白质/mL)与CuSO4(最终浓度为5μM)及20μl受试样品、60μl 5mM磷酸缓冲液(pH 7.4)充分混合，立即于232nm波长下检测共轭双烯生成量随时间的变化。结果发现20g/ml的红毛五加50％乙醇/乙酸乙酯提取物可使LDL的氧化时间由58分钟(空白组)延长至268分钟。

Claims (17)

1.一种制备五加属植物提取物的方法，其包括以下步骤：
a)以醇类溶液提取五加属植物；及
b)自步骤a)所得的提取物中移除固体部分以获得五加属植物提取物。
2.如权利要求1的方法，其中所述的五加属植物为刺五加Eleutherococcus senticosus(Ruper.et Maxim.)Maxim、红毛五加(E.giraldii)或三叶五加(E.trifoliateus)。
3.如权利要求1的方法，其中五加属植物对醇类溶液的重量比为约1/5至1/50。
4.如权利要求1的方法，其中所述的醇类溶液为乙醇、甲醇或异丙醇溶液。
5.如权利要求1的方法，其中所述的醇类的浓度为约30％至约100v/v％。
6.如权利要求1至5中任一项的方法，其系进一步包括步骤c)浓缩五加属植物提取物。
7.如权利要求6的方法，其系进一步包括步骤d)以具有中度至高度极性的溶剂提取/分配所述的经浓缩的五加属提取物，以获得第二五加属植物提取物。
8.如权利要求7的方法，其中所述的具有中度至高度极性的溶剂系选自异丁醇、正丁醇、乙酸丁酯、氯仿、乙酸乙酯或其混合物。
9.如权利要求8的方法，其中所述的具有中度至高度极性的溶剂为乙酸乙酯。
10.一种五加属植物提取物，其为如权利要求1至9中任一项的方法所制得。
11.一种组合物，其包含治疗有效量的如权利要求10的五加属植物提取物及视情形的医药可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
12.如权利要求11的组合物，其系食品组合物或医药组合物。
13.一种如权利要求10的五加属植物提取物于制备预防或治疗代谢症候群的至少一种症状的药物的用途。
14.如权利要求13的用途，其中所述的症状为中央肥胖(腹部肥胖)、血脂异常、心血管疾病、葡萄糖耐受异常或胰岛素抗阻。
15.一种如权利要求10的五加属植物提取物于制备抑制乙酰辅酶A羧化酵素(acetyl-CoA carboxylase)的药物的用途。
16.一种如权利要求10的五加属植物提取物于制备预防或治疗与脂联素相关疾病的药物的用途。
17.一种如权利要求10的五加属植物提取物于制备活化过氧化体增殖剂活化受体γ(PPARγ)的药物的用途。
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