CN104880439B - 样本分析装置及样本分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能正确分析尿或体液等样本中所含有的有形成分的样本分析装置及样本分析方法。将含有用于染色核酸的染色色素的染色试剂混入样本，制备测定试样，向流动室供应测定试样，形成试样流，从光源照射光，在流动室的试样流上形成射束点，用荧光脉冲面积分类比射束点直径大的有核成分，用荧光强度分类比射束点直径小的有核成分。

Description

样本分析装置及样本分析方法
技术领域
本发明涉及一种通过测定由尿或体液等样本与试剂混合而成的测定试样来分析样本的样本分析装置和样本分析方法。
背景技术
对采自生物体的血液或尿等样本所含有的成分进行分析的样本分析在临床检查领域应用广泛，近年来，能自动分析样本的样本分析装置获得应用。
专利文献1公开了一种用流式细胞技术分析细胞的细胞分析装置。此专利文献1中记述的细胞分析装置将含有核酸被染色的细胞的测定试样放入流动室，激光照射该流动室，在流经流动室的测定试样上形成测定试样流动方向的直径（宽）3~8μm的射束点，用此时荧光信号的脉冲面积（积分值）区分出核大小为10~15μm的异常细胞和核大小为5~7μm的正常细胞。
专利文献
专利文献1：特开（日本专利公开）2009-103687号公报。
发明内容
发明要解决的技术问题
尿和体液中不仅有白细胞、上皮细胞、异型细胞等较大细胞，有时还含有细菌等小细胞。例如，白细胞直径大约10~15μm，其核直径约为10μm。与此相对，细菌直径仅约0.4~2μm。即细菌比白细胞的核还要小很多。
专利文献1所记述的细胞分析装置适用于分析含有大型细胞的样本，但不适合分析诸如尿或体液那种既含有大型细胞也含有小型细胞的、所含有的细胞大小差异大的样本。
本发明正是有鉴于此，其目的在于提供一种能分析含有从大细胞到小细胞的、细胞大小差异大的尿或体液等样本的样本分析装置和样本分析方法。
解决技术问题所采用的技术本发明第一形态涉及的样本分析装置具有：混合样本和核酸染色试剂制备测定试样的试样制备部件、用光照射所述测定试样所含有的细胞，接收细胞所发出的荧光，输出荧光信号的光学检测部件、从所述光学检测部件输出的荧光信号获取细胞荧光脉冲面积和荧光强度的信号处理部件、以及能够根据荧光脉冲面积检测所述测定试样所含有的白细胞，根据荧光强度检测所述测定试样所含有的细菌的信息处理部件。
由此，能够根据荧光脉冲面积正确检测出白细胞这一大型细胞，根据荧光强度正确检测出细菌这种小型细胞。
在上述发明中还可以如下设计：所述信息处理部件能够根据荧光脉冲面积进一步检测所述测定试样中所含有的上皮细胞。以此，还能够根据荧光脉冲面积正确检测出上皮细胞这一大型细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述信息处理部件能够根据荧光脉冲面积进一步检测出所述测定试样中所含有的与白细胞和上皮细胞不同的异型细胞。由此，根据荧光脉冲面积也能够正确检测出异型细胞这种大型细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述信息处理部件能够根据荧光强度进一步检测所述测定试样中所含有的真菌。由此，还能够根据荧光强度正确地检测真菌这一小型细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述信息处理部件能够根据荧光强度进一步检测所述测定试样中所含有的***。由此，还能够根据荧光强度正确地检测***这一小型细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述信息处理部件能够根据荧光强度进一步检测出所述测定试样中所含有的毛滴虫。由此，还能够根据荧光强度正确地检测毛滴虫这一小型细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述光学检测部件包括形成测定试样的试样流的流动室、以及向所述流动室照射光并形成射束点的光源，所述试样流流动方向的射束点直径为3μm以上8μm以下。由此，射束点直径小于大型细胞、大于小型细胞，根据荧光脉冲面积就能正确检测大型细胞，根据荧光强度就能正确检测小型细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述光学检测部件接收细胞所发出的散射光，输出散射光信号，所述信息处理部件能够根据基于散射光信号的细胞的参数和所述荧光脉冲面积检测所述测定试样中所含有的白细胞。由此，不仅使用荧光脉冲面积，还使用基于散射光信号的细胞的参数，能够更准确地检测白细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述信息处理部件能够根据基于散射光信号的细胞的参数和所述荧光强度检测所述测定试样中所含有的细菌。由此，不仅使用荧光强度，还使用基于散射光信号的细胞的参数，能够更准确地检测细菌。
在上述形态下还可以如下设计：所述光学检测部件能够用第一检测灵敏度和灵敏度高于第一检测灵敏度的第二检测灵敏度输出荧光信号，所述信息处理部件能够根据以第一检测灵敏度输出的荧光信号的荧光脉冲面积检测白细胞，根据以第二检测灵敏度输出的荧光信号的荧光强度检测细菌。由此，根据细胞大小使用适当灵敏度的荧光信号，能够更准确地检测白细胞和细菌。
本发明另一形态的样本分析装置具有：混合样本和核酸染色试剂制备测定试样的试样制备部件、具有光源和流动室，在所述光源光照下的所述流动室内形成所述测定试样的试样流，以此从所述测定试样所含有的细胞获取反映细胞大小或核直径的参数以及细胞的荧光脉冲面积和荧光强度的测定部件、根据荧光脉冲面积识别具有在所述一定值以上的所述参数的细胞的种类，根据荧光强度识别具有不到一定值的所述参数的细胞的种类的信息处理部件。
由此，能够根据反映细胞大小或核直径的参数值适当使用荧光脉冲面积和荧光强度，得以正确检测各种大小或各种核直径的细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述信息处理部件将具有一定值以上的所述参数且具有在一定范围内的荧光脉冲面积的细胞识别为白细胞、上皮细胞或异型细胞，将具有不到一定值的所述参数且具有在一定范围内的荧光强度的细胞识别为细菌、真菌、***或毛滴虫。由此，能够用荧光脉冲面积正确检测出白细胞、上皮细胞或异型细胞这种大型细胞，用荧光强度正确检测细菌、真菌、***或毛滴虫这种小型细胞。
在上述形态下还可以如下设计：所述测定部件包括：接收所述试样流中所含有的细胞的散射光，输出散射光信号的散射光受光部件、接收荧光并输出荧光信号的荧光受光部件，所述信息处理部件将所述散射光信号作为所述反映细胞大小或核直径的参数使用。
本发明的另一形态提供一种样本分析装置，包括：混合样本和核酸染色试剂，制备测定试样的试样制备部件；用光照射所述测定试样中所含有的细胞，接收细胞所发出的荧光，输出荧光信号的光学检测部件；从所述光学检测部件输出的荧光信号获取细胞荧光脉冲面积和荧光强度的信号处理部件；处理器；及储存有计算机程序以便使所述处理器进行以下处理的存储部件：根据荧光脉冲面积检测所述测定试样中所含有的白细胞；根据荧光强度检测所述测定试样中所含有的细菌。
优选地，所述样本是尿。
本发明其他形态涉及一种样本分析方法，其具有以下步骤：混合样本和核酸染色试剂，制备测定试样的步骤；让所制备的测定试样流过流动室，用光照射所述流动室中的测定试样的试样流的步骤；输出与测定试样中的细胞在光照下发出的荧光相应的荧光信号的步骤；从荧光信号中获取细胞的荧光脉冲面积和荧光强度的步骤；根据荧光脉冲面积检测所述测定试样中所含有的白细胞的步骤；根据荧光强度检测所述测定试样中所含有的细菌的步骤。
本发明的另一形态提供一种样本分析方法，包括以下步骤：混合样本和核酸染色试剂，制备测定试样的步骤；用光照射制备的所述测定试样的步骤；根据所述测定试样中的细胞在光照下发出的光，获取反映细胞大小或核直径的参数以及细胞的荧光脉冲面积和荧光强度的步骤；根据荧光脉冲面积识别具有一定值以上的所述参数的细胞种类的步骤；根据荧光强度识别具有不到一定值的所述参数的细胞种类的步骤。
发明的有益效果采用本发明，能够正确分析含有从大型细胞到小型细胞的、大小差距大的细胞的尿或体液等样本。
附图说明
图1为实施方式涉及的尿样本分析装置的整体结构斜视图；
图2为试样制备部件和光学检测部件简要功能的结构图；
图3为光学检测部件的结构图；
图4为实施方式涉及的尿样本分析装置的结构框图；
图5为信息处理部件的结构框图；
图6为实施方式涉及的尿样本分析装置的样本测定处理步骤的流程图；
图7为测定试样制备处理步骤的流程图；
图8为有核成分测定处理步骤的流程图；
图9A为说明光学信号强度的示意图；
图9B为说明光学信号脉冲幅度的示意图；
图9C为说明光学信号脉冲面积的示意图；
图10为测定数据分析处理步骤的流程图；
图11为说明尿中有核成分大小与核酸量关系的示意图；
图12A为说明从大型有形成分获得的荧光信号脉冲面积的示意图；
图12B为说明从小型有形成分获得的荧光信号脉冲面积的示意图；
图13为前向散射光强度和前向散射光脉冲幅度所规定的特征参数空间中有核成分的出现区域的示意图；
图14为前向散射光强度和第一高灵敏度荧光强度所规定的特征参数空间中有核成分出现区域的示意图；
图15为前向散射光脉冲幅度和低灵敏度荧光脉冲面积所规定的特征参数空间中有核成分出现区域的示意图；
图16A为白细胞检测结果一例的散点图；
图16B为上皮细胞检测结果一例的散点图；
图16C为异型细胞检测结果一例的散点图；
图17为前向散射光强度和第一高灵敏度荧光强度所规定的特征参数空间中有核成分出现区域的示意图；
图18A为真菌检测结果一例的散点图；
图18B为毛滴虫检测结果一例的散点图；
图18C为***检测结果一例的散点图；
图19为前向散射光强度和第二高灵敏度荧光强度所规定的特征参数空间中细菌出现区域的示意图；
图20为细菌检测结果一例的散点图。
具体实施方式
以下参照附图对本发明的优选实施方式进行说明。
<尿样本分析装置的结构>
本实施方式就分析尿中有形成分的尿样本分析装置进行说明。本实施方式涉及的尿样本分析装置将尿样本取入装置内部，对尿中有形成分（红细胞、白细胞、上皮细胞、管型和细菌等）进行分析。
图1为本实施方式涉及的尿样本分析装置结构的外观斜视图。在图1中，尿样本分析装置100有测定单元10和信息处理部件13。测定单元10具有：制备测定试样的试样制备部件2、移送样本架（试管架）3的架台4、从测定试样中检测有形成分信息的光学检测部件5以及线路部件14。机壳的侧面通过臂15安装有支座16，其上设置有信息处理部件13。信息处理部件13与测定单元10的线路部件14连接并能够进行数据通讯。
图2为所述试样制备部件2和光学检测部件5简要功能的结构图。在图中，装入试管T的尿样本通过无图示的注射泵用吸管17吸移，由样本分配部件1分装到试样制备部件2。本实施方式中的试样制备部件2具有反应槽2u和反应槽2b，样本分配部件1向反应槽2u和反应槽2b各自分配有定量样本的样本等份（aliquot）。
在反应槽2u，分配的样本等份与稀释液19u和染色液18u混合。以此用染色液18u中的色素对样本中的有形成分染色。在此反应槽2u调制的混合物用于分析尿中的红细胞和管型等无核粒子（无核成分）。以下称在反应槽2u调制的混合物为第一测定试样。
在反应槽2b，分配的样本等份与稀释液19b和染色液18b混合。以此用染色液18b中的色素对样本中的有形成分染色。在此反应槽2b调制的混合物用于分析尿中有核酸的细胞，即尿中的白细胞、上皮细胞和真菌等有核细胞和细菌。以下称尿中有核酸的细胞为“有核成分”，称在反应槽2b制备的混合物为第二测定试样。
有管从反应槽2u、2b延伸至光学检测部件5的流动室51，在反应槽2u、2b制备的测定试样能够向流动室51输送。如上制备的两种测定试样中，反应槽2u的第一测定试样先输送到光学检测部件5，然后，反应槽2b的第二测定试样再输送到光学检测部件5。输送到光学检测部件5的第一和第二测定试样在流动室51形成被鞘液包被的细流，用激光照射细流。在后述微型计算机11（控制装置）的控制下，通过运行无图示的泵和电磁阀等自动进行此作业。
染色液18b含有染色核酸的色素。更详细而言，染色液18b包括用于特异性染色核酸的嵌入剂（intercalator）和结合于小沟(minor groove)的荧光色素。所述嵌入剂（intercalator）有花菁（cyanine）类、吖啶（acridine）类和菲啶（phenanthridium）类的众所周知的色素。比如，花菁（cyanine）类的嵌入剂（intercalator）有SYBR Green I、噻唑橙（Thiazole orange）。吖啶（acridine）类嵌入剂（intercalator）有吖啶橙（Acridinorange）。菲啶（phenanthridium）类嵌入剂（intercalator）有碘化丙啶（propidiumIodide）、溴化乙锭（Ethidium bromide）。结合于小沟的色素如有DAPI、Hoechst等众所周知的色素。比如，结合于小沟的Hoechst色素可列举出Hoechst33342、Hoechst 33258等。在本实施方式中，花菁（cyanine）类嵌入剂（intercalator）较为理想，特别是SYBR Green I、噻唑橙（Thiazole orange）更好。
稀释液19b含有溶血剂。具体而言，稀释液19b含有阳离子型表面活性剂，这种表面活性剂用于破坏细胞膜，使染色液18b穿透细胞膜，同时使红细胞溶血，使红细胞碎片等杂质收缩。表面活性剂的种类不限于阳离子型表面活性剂，也可以是非离子型表面活性剂。混合尿样本、染色液18b和稀释液19b，以此使有核酸的尿中有形成分染色到与其结构和特性相适应的程度。
稀释液19b含有溶血剂，所以能够使第二测定试样中所含有的红细胞溶血，能够精确地测定白细胞等有核酸的细胞。此外，使用含有溶血剂的稀释液19b破坏细胞膜，所以能够高效地对核酸进行染色。这将有益于提高有核酸细胞的测定精度。
染色液18u含有对无核酸的有形成分进行染色的荧光色素。
稀释液19u是以缓冲剂为主要成分的试剂。稀释液19u含有渗透压补偿剂，以便能够在不让红细胞溶血的情况下获得稳定的荧光信号。
图3为光学检测部件5的结构图。聚光镜52将半导体激光光源53放射的激光聚集于流动室51。
由于聚光镜52，从光源53照射出的光在流动室51内的试样流上形成扁平的射束点。此射束点在试样流的流动方向的直径为3~8μm。要稳定地向细胞核照射激光，射束点在上述流动方向的直径以3.5~7.5μm为宜，4~7μm更好。本实施方式的射束点在上述流动方向的直径为4~7μm。
聚光镜54将测定试样中的有形成分发出的前向散射光聚集于第一散射光受光部件55。聚光镜56将有形成分发出的侧向散射光和荧光聚集于分色镜57。分色镜57将侧向散射光反射到作为第二散射光受光部件58的光电倍增管，使荧光向作为荧光受光部件59的光电倍增管方向透过。第一散射光受光部件55、第二散射光受光部件58和荧光受光部件59将光信号转换成电信号，分别输出前向散射光信号（以下称“FSC”）、侧向散射光信号（以下称“SSC”）和荧光信号（以下称“FL”）。荧光受光部件59通过切换驱动电压就可以以低灵敏度和高灵敏度输出荧光信号。此灵敏度的切换通过后述微型计算机11进行。
光源也可以用气体激光光源取代所述半导体激光光源，但从低成本、小型且低耗电量这几点来说，最好采用半导体激光光源。
图4为尿样本分析装置100的结构框图。测定单元10具有上述样本分配部件1、试样制备部件2、光学检测部件5、放大此光学检测部件5的输出信号的放大线路50、对放大线路50的输出信号进行过滤处理的过滤线路6、将过滤线路6的输出信号（模拟信号）转换为数字信号的A/D转换器7、对数字信号进行一定波形处理的数字信号处理线路8、连接在数字信号处理线路8上的存储器9、与样本分配部件1、试样制备部件2、放大线路50和数字信号处理线路8连接的微型计算机11、以及连接微型计算机11的LAN适配器12。信息处理部件13通过此LAN适配器12与测定单元10用LAN缆连接。信息处理部件13分析测定单元10获取的测定数据。光学检测部件5、放大线路50、过滤线路6、A/D转换器7、数字信号处理线路8和存储器9构成了用于测定测定试样并生成测定数据的测定部件10a。
光学检测部件5用前置放大器放大FSC、SSC、FL各信号。放大的各信号输入到放大线路50。从光学检测部件5的输出端延伸出来的FL信号频道在前置放大器和放大线路50之间分叉为二。其中一个信号频道连接放大线路50的高放大率的放大器（高倍放大器）。另一个信号频道连接低放大率的放大器（低倍放大器）。因此，从一个粒子相应的FL获取高灵敏度放大的FLH和低灵敏度放大的FLL。以下称输入高倍放大器的FL为“FLH”，称输入低倍放大器的FL为“FLL”。
放大线路50按照设定的增益（gain）放大FSC、SSC、FLH和FLL四种信号。放大线路50能够设定不同的数种增益。微型计算机11通过设定放大线路50的增益就能调节放大线路50的灵敏度。
图5为信息处理部件13的结构框图。信息处理部件13是个人电脑。信息处理部件13具有主机400、输入部件408和显示部件409。主机400具有CPU401、ROM402、RAM403、硬盘404、读取装置405、输入输出接口406、图像输出接口407和通信接口410。
CPU401执行存储在ROM402的计算机程序和下载到RAM403中的计算机程序。RAM403用于读取存储在ROM402和硬盘404的计算机程序。RAM403还可以作为CPU401执行这些计算机程序时的工作空间。
硬盘404装有操作***和应用程序等供CPU401执行的各种计算机程序以及执行计算机程序所需要的数据。硬盘404装有分析测定单元10传过来的测定数据、输出分析结果的计算机程序。
读取装置405由CD驱动器或DVD驱动器等构成，能够读取存储于存储介质的计算机程序及数据。输入输出接口406连接由键盘和鼠标构成的输入部件408，用户用输入部件408向信息处理单元13输入数据。图像输出接口407与由液晶显示屏等构成的显示部件409连接，将与图像数据相应的影像信号输出到显示部件409。显示部件409按照输入的影像信号显示图像。信息处理部件13通过通信接口410连接测定单元10，能够通过通信接口410与测定单元10传输数据。
<尿样本分析装置的运行>
下面就本实施方式涉及的尿样本分析装置的运行进行说明。
图6为尿样本分析装置100的样本测定处理步骤的流程图。首先，用户通过信息处理部件13的输入部件408输入测定实施指示（步骤S101）。收到此指示，CPU401向测定单元10发送指示开始测定的指示数据（步骤S102）。测定单元10收到指示数据（步骤S103）后，微型计算机11实施测定试样制备处理（步骤S104）、无核成分测定处理（步骤S105）和有核成分测定处理（步骤S106）。
图7为测定试样制备处理步骤的流程图。在测定试样制备处理中，首先微型计算机11控制样本分配部件1，让吸管17从试管T吸一定量尿样本，并分别向反应槽2u和反应槽2b分装一定量尿样本（步骤S201、S202）。
微型计算机11控制试样制备部件2实施以下步骤S203~S207。在步骤S203和步骤S204，向反应槽2u定量分装一定量稀释液19u和染色液18u（步骤S203及步骤S204）。在步骤S205及步骤S206，向反应槽2b定量分装一定量稀释液19b和染色液18b（步骤S205及步骤S206）。反应槽2u和反应槽2b分别被无图示加热器加热到一定温度，在此状态下，在步骤S207中用螺旋桨状的搅拌器（无图示）搅拌各槽内的混合物（步骤S207）。以此在反应槽2u制备无核成分测定用第一测定试样，在反应槽2b制备有核成分测定用第二测定试样。步骤S207的处理结束后，微型计算机11将处理返回主程序。
在无核成分测定处理（步骤S105）中，与鞘液一起，第一测定试样从反应槽2u供应到流动室51，在流动室51形成鞘液包裹下的第一测定试样的试样流。然后，光源53向形成的试样流照射激光光束，在流动室51形成射束点。每当粒子通过射束点时就会产生前向散射光、荧光和侧向散射光。前向散射光、荧光和侧向散射光分别被第一散射光受光部件55、荧光受光部件59和第二散射光受光部件58接收并转换为电信号，输出FSC、FLH、FLL和SSC。输出的FSC、FLH、FLL和SSC被放大线路50放大。
放大线路50放大的FSC、FLH、FLL和SSC由过滤线路6进行过滤处理后，由A/D转换器7转换为数字信号，由数字信号处理线路8施以一定的信号处理。以此对每个通过流动室51的粒子提取前向散射光强度（FSCP）、前向散射光脉冲幅度（FSCW）、荧光强度（FLHP）、荧光脉冲幅度（FLLW）及侧向散射光强度（SSCP）等分析用参数。分析用参数作为测定数据存入存储器9，结束无核成分测定处理。
下面就有核成分测定处理（步骤S106）进行说明。图8为有核成分测定处理步骤的流程图。在有核成分测定处理中，首先微型计算机11以第一设定值设定第一散射光受光部件55、第二散射光受光部件58和荧光受光部件59的灵敏度及放大线路50的增益（步骤S311）。此第一设定值是用于测定白细胞、上皮细胞、真菌等比细菌大且有核的有核细胞的设定值。微型计算机11驱动无图示的压缩机向流动室51输送鞘液（步骤S312）。在如此向流动室51输送鞘液的状态下，微型计算机11驱动无图示的压缩机从反应槽2b向流动室51供应第二测定试样（步骤S313）。
由此，在流动室51形成被鞘液包被的第二测定试样的试样流。形成的试样流受到来自光源53的激光光束照射（步骤S314），在流动室51形成射束点。粒子每次通过射束点，就会产生前向散射光、荧光和侧向散射光。前向散射光、荧光和侧向散射光分别被第一散射光受光部件55、荧光受光部件59和第二散射光受光部件58接收并转换为电信号（步骤S315）。荧光受光部件59将受光水平转换为电信号时的灵敏度根据在步骤S311设定的有核细胞测定用第一设定值而定。
第一散射光受光部件55、荧光受光部件59和第二散射光受光部件58将与受光水平相应的电信号作为FSC、FL及SSC输出。光学检测部件5将FL分成FLH和FLL并输入放大线路50。输入的信号被放大线路50放大。放大线路50的信号放大率根据步骤S311设定的有核细胞测定用第一设定值而定。
第一设定值与后述第二设定值相比灵敏度更低。换言之，当设定为第一设定值时，FL以低于设定为第二设定值时的放大率放大。具体而言，当设定为第一设定值时，粒子发出的荧光被荧光受光部件59以低灵敏度进行光电转换后输出。此时光学检测部件5输出的FLH和FLL分别由放大线路50的高倍放大器和低倍放大器以高放大率和低放大率放大。其结果，获得以低放大率放大的低灵敏度荧光信号（FLL）和以高放大率放大的第一高灵敏度荧光信号（以下称“FLH1”）两种荧光信号。
放大的FSC、FLL、FLH1及SSC由过滤线路6施以过滤处理后，由A/D转换器7转换为数字信号，由数字信号处理线路8施以一定的信号处理。
数字信号处理线路8通过信号处理从光学信号（FSC、SSC、FLL、FLH1）提取用于分析处理的参数。分析用参数包括：前向散射光强度（以下称“FSCP”）、前向散射光脉冲幅度（以下称“FSCW”）、侧向散射光强度（以下称“SSCP”）、低灵敏度荧光强度（以下称“FLLP”）、低灵敏度荧光脉冲幅度（以下称“FLLW”）、低灵敏度荧光脉冲面积（以下称“FLLA”）、第一高灵敏度荧光强度（以下称“FLHP1”）、第一高灵敏度荧光脉冲幅度（以下称“FLHW1”）和第一高灵敏度荧光脉冲面积（以下称“FLHA1”）。
下面根据图9A~图9C说明分析用参数的提取。分析用参数就各光学信号而言有“强度”、“脉冲幅度”和“脉冲面积”三种。强度用P表示。脉冲幅度用W表示。脉冲面积用A表示。FSCP、SSCP、FLLP和FLHP1等光学信号强度分别获取的是图9A所示脉冲的峰值高度PP。FSCW、FLLW和FLHW1等光学信号脉冲幅度如图9B所示，分别获取的是脉冲从超过一定阈值的时间T1到低于阈值的时间T2的间隔PW。FLLA和FLHA1等光学信号脉冲面积如图9C所示，获取的是信号强度的时间积分值，即用信号脉冲波形线L1、表示脉冲高度取一定阈值时的时间的直线L2、L3以及表示光学信号强度值为0的直线L4包围的区域（图中画斜线的区域）PA的面积。
在此所示分析用参数的提取方法仅为一例，可以用其他不同的提取方法。脉冲面积只要是反映脉冲时间曲线下面积的值就可以，也可以是近似值，并不限于时间积分值。例如，脉冲面积可以是脉冲幅度与峰值高度的积，也可以是从脉冲幅度与峰值高度求出的三角形面积。在提取时间积分值的方式中，底边也可以不是强度为0的直线，可适当设定。比如，也可以以图9C所示的一定阈值为底边，或者以只有鞘液流入流动室51时的脉冲值为基准值，以此为底边。
再次参照图8，如上所述从光学信号提取的参数作为测定数据存入存储器9（步骤S316）。
从第二测定试样供给流动室51起经过一定时间后，微型计算机11便将荧光受光部件59的灵敏度和放大线路50的增益变为第二设定值（步骤S317）。此第二设定值为测定细菌用的设定值。
在荧光受光部件59和放大线路50以第二设定值设定的状态下，测定部件10a测定第二测定试样（步骤S318）。由此，荧光受光部件59以依第二设定值而定的灵敏度输出FL，第一散射光受光部件55、第二散射光受光部件58和荧光受光部件59的输出信号以按第二设定值设定的放大率被放大线路50放大。
第二设定值比上述第一设定值灵敏度高。换言之，当设定为第二设定值时，FL以高于设定为第一设定值时的放大率放大。当设定为第二设定值时，荧光受光部件59进行光电转换的受光灵敏度设定为第一设定值的数倍。放大线路50的放大率与第一设定值中的放大率相同。在设定为第二设定值的状态下，荧光受光部件59输出的FL由放大线路50中的高倍放大器放大，并获取其作为第二高灵敏度荧光信号（以下称“FLH2”）。
荧光受光部件59在第二设定值中的灵敏度是荧光受光部件59在第一设定值中的灵敏度的5倍。这是因为细菌比白细胞和上皮细胞等有核细胞小，荧光量比有核细胞小。将荧光受光部件59的灵敏度调到高于测定有核细胞时的灵敏度，使之达到适于细菌的灵敏度，这样能够精确地检测出细菌。在本实施方式中，在第二设定值中，为了使放大率达到5倍，仅提高了荧光受光部件59的灵敏度，但也可以使荧光受光部件59的灵敏度和放大线路50的放大率两者同时提高。比如，在第二设定值中，可以将荧光受光部件59的灵敏度设定为第一设定值中灵敏度的2.5倍，同时将放大线路50的放大率设定为第一设定值中放大率的2倍。
放大后的FSC、FLH2和SSC由过滤线路6进行过滤处理后，由A/D转换器7转换为数字信号，再由数字信号处理线路8进行一定的信号处理。通过这种信号处理，从FSC提取FSCP和FSCW，从SSC提取SSCP。再提取FLH2的峰值作为第二高灵敏度荧光强度（以下称“FLHP2”）。提取FLH2的脉冲幅度作为第二高灵敏度荧光脉冲幅度（以下称“FLHW2”）。提取FLH2的脉冲面积作为第二高灵敏度荧光脉冲面积（以下称“FLHA2”）。以此就通过流动室51的各个粒子获取分析用参数。就各粒子提取的参数数据作为测定数据存入存储器9（步骤S319）。上述处理完成后，微型计算机11将处理返回主程序。
上述有核成分测定处理后，微型计算机11将无核成分测定处理和有核成分测定处理生成的测定数据发送至信息处理部件13（步骤S107），结束处理。
信息处理部件13接收测定数据（步骤S108）后，CPU401实施测定数据分析处理（步骤S109），生成尿样本分析结果，将该分析结果存入硬盘404。图10为测定数据分析处理步骤的流程图。测定数据分析处理中包括第一无核成分分类处理（步骤S401）、第二无核成分分类处理（步骤S402）、区分处理（步骤S403）、第一有核成分分类处理（步骤S404）、第二有核成分分类处理（步骤S405）和细菌检测处理（步骤S406）。
在第一无核成分分类处理S401中，使用测定第一测定试样获得的FSC和FLH，检测红细胞和结晶，求出各自的计数值。
在第二无核成分分类处理S402中，使用测定第一测定试样获得的FSC和FLL，检测管型和粘液丝，求出各自的计数值。
然后，通过区分处理、第一有核成分分类处理、第二有核成分分类处理和细菌检测处理分类尿中有核酸的细胞。
在此，就本实施方式涉及的样本分析装置的有核成分分类进行说明。图11为说明尿中有核成分大小与核酸量关系的示意图。在图11中，横轴表示核酸量，纵轴表示有核成分大小（粒径）。尿中有核成分中按核酸量从多到少的顺序依次有异型细胞、上皮细胞、白细胞、***、毛滴虫、真菌和细菌。
这些有核成分中，上皮细胞、异型细胞、白细胞较大。上皮细胞其直径约为50~100μm，核直径约为10μm。异型细胞其直径约为10~20μm，核直径约为10~15μm。白细胞其直径约为10~15μm，核直径约为10μm。
与此相对，***、毛滴虫、真菌和细菌较小。***头部大小约为4~5μm。毛滴虫其直径约为7~15μm，核直径约为5μm。出芽前真菌直径约为3~8μm，核直径约为3μm。细菌比***、毛滴虫和真菌还小，其直径约为0.4~2μm。细菌无核，但内含核酸。
如上所述，在本实施方式中由光源53形成的射束点在试样流动方向的直径约为4~7μm，所以上皮细胞、异型细胞和白细胞核直径大于射束点直径。***头部、毛滴虫的核、真菌的核和细菌均小于射束点直径。
图12A为说明从白细胞等大型细胞获得的荧光信号脉冲面积的示意图，图12B为说明从真菌等小型细胞获得的荧光信号脉冲面积的示意图。如图12A所示，大型细胞LC的核N1比射束点直径W大，故射束点中容纳不下大型细胞LC的核N1。因此，荧光信号强度只反映了所照射的核的一部分核酸量。而以时间对荧光信号强度进行积分所得出的面积值LA1可以认为是反映核整体核酸量的值。因此，关于大型细胞LC，以时间对荧光信号强度进行积分所得出的面积值LA1适合作为反映核整体核酸量的参数。
与此相对，在真菌等小型细胞SC中，如图12B所示，核N2比射束点直径W还小，射束点中容纳细胞LC的全部核N2。至于细菌这种特别小型的细胞，整个粒子均容纳于射束点中。当细胞SC向行进方向前行时，从核N2进入射束点到出去为止的期间，核N2整体受到连续照射。因此，用以时间对荧光信号强度进行积分所得出的面积值LA2作为反映小型细胞SC的核酸量的参数，则看到的值比实际核酸量要大。而荧光信号强度可以视为反映核的实际核酸量的值。因此，对于小型细胞SC而言，荧光信号强度适宜作为反映核酸量的参数。
本实施方式涉及的样本分析装置1区分包括上皮细胞、异型细胞和白细胞在内的大型细胞的第一群，以及包括***、毛滴虫和真菌在内的小型细胞的第二群（区分处理），用荧光脉冲面积对第一群的有核成分进行分类（第一有核成分分类处理），用荧光信号强度对第二群有核成分进行分类（第二有核成分分类处理）。并有别于第一群和第二群，另外地检出细菌（细菌检测处理）。
在区分处理S403中，首先用FSCP和FSCW将第二测定试样中的粒子分为第一群和第二群的团，以及细菌团。图13为FSCP和FSCW所规定的特征参数空间中有核成分出现区域的示图。根据FSCP和FSCW标绘出第二测定试样中的粒子，则图13所示区域R11中标绘有第一群和第二群的有核成分。区域R12中标绘有包含细菌的有形成分群。区域R11和R12以外所标绘的粒子作为杂质从分析对象中排除。
接着，用FSCP和FLHP1将标绘在图13区域R11的粒子团分为第一群和第二群。FSCP作为反映细胞大小或核直径的参数使用。图14为FSCP和FLHP1所规定的特征参数空间中有核成分出现区域的示图。标绘在图13区域R11的粒子团标绘在FSCP和FLHP1所规定的特征参数空间中。在图14所示区域R21中标绘第一群的有核成分。在区域R22标绘第二群的有核成分。
在第一有核成分分类处理S404中，用FSCW和FLLA将标绘在图14区域R21中的第一群粒子团分为异型细胞、白细胞和上皮细胞，分别求出其计数值。
异型细胞、白细胞和上皮细胞与***、毛滴虫和真菌等相比核酸量大，因此被光励起时产生的荧光量也大。因此，低灵敏度荧光信号适于分析。又因为核直径比射束点直径大，所以荧光脉冲面积较为适合作为参数。因此，异型细胞、白细胞和上皮细胞用FLLA进行分类。
图15为FSCW和FLLA所规定的特征参数空间（以下称“FSCW- FLLA空间”）中有核成分出现区域的示图。第一群的有核成分标绘于FSCW- FLLA空间。如图所示，白细胞和上皮细胞与异型细胞的FLLA的分布区域不同。这是因为白细胞与上皮细胞核酸量几乎相差无几，而异型细胞则比白细胞和上皮细胞核酸量多，FLLA反映核酸量。白细胞和上皮细胞的FSCW的分布区域不同。这是因为上皮细胞比白细胞大，FSCW反映粒子的大小。区域R31中标绘的粒子作为异型细胞计数。区域R32中标绘的粒子作为白细胞计数。区域R33中标绘的粒子作为上皮细胞计数。
图16A~图16C中显示在第一有核成分分类处理S404中实际检出有核成分的结果。图16A为白细胞检测结果一例的散点图，图16B为上皮细胞检测结果一例的散点图，图16C为异型细胞检测结果一例的散点图。图16A显示了含有白细胞的样本的测定结果，图16B显示了含有上皮细胞的样本的测定结果，图16C显示了含有异型细胞的样本的测定结果。
在第二有核成分分类处理S405中，用FSCP和FLHP1将图14区域R22中标绘的粒子团分为毛滴虫、真菌和***，并分别求出计数值。
***、毛滴虫和真菌与白细胞、上皮细胞和异型细胞比核酸量少，所以被光励起时产生的荧光量相对比第一群细胞小。因此，高灵敏度荧光信号适于分析。又因为核直径比射束点直径小，所以作为参数，荧光强度比较适合。因此，***、毛滴虫和真菌用FLHP1进行检测。
图17为FSCP和FLHP1所规定的特征参数空间中有核成分出现区域的示图。第二群的有核成分标绘于FSCP和FLHP1所规定的特征参数空间中。***、真菌和毛滴虫在FSCP和FLHP1所规定的特征参数空间中的分布区域不同。这是因为***、真菌和毛滴虫在核酸量和大小上各不相同。标绘于区域R41的粒子作为***计数。标绘于区域R42的粒子作为真菌计数。标绘于区域R43的粒子作为毛滴虫计数。
图18A~图18C中显示在第二有核成分分类处理S405中实际检出有核成分的结果。图18A为真菌检测结果一例的散点图，图18B为毛滴虫检测结果一例的散点图，图18C为***检测结果一例的散点图。图18A显示了含有真菌的样本的测定结果，图18B显示了含有毛滴虫的样本的测定结果，图18C显示了含有***的样本的测定结果。
在细菌检测处理S406中，就图13区域R12中标绘的粒子团，用FSCP和FLHP2对细菌进行计数。
细菌比白细胞等其他有核细胞小很多，且核酸量也少，故荧光量比其他有核细胞少。细菌是微小的，粒径比射束点直径还小。因此，细菌用灵敏度最高的荧光信号强度FLHP2进行检测。图19为FSCP和FLHP2所规定的特征参数空间中细菌出现区域的示图。图13区域R12中标绘的粒子团展开在FSCP和FLHP2所规定的特征参数空间中。在图19所示特征参数空间，区域R5出现细菌。另外，在图19所示特征参数空间中可能标绘有细菌以外的有核细胞，但这种有核细胞大多在转换为高灵敏度荧光信号时饱和而从分析对象中排除。另外，荧光强度比区域R5低的区域中会出现无核酸的杂质。标绘于区域R5的粒子作为细菌计数。
图20显示在细菌检测处理S406中实际检出细菌的结果。图20为细菌检测结果一例的散点图。图20显示了含有细菌的样本的测定结果。
CPU401结束测定数据分析处理后，将处理返回主程序。
CPU401将上述测定数据分析处理获得的分析结果显示在显示部件409（步骤S110），结束处理。
（其他实施方式）
在上述实施方式中，在区分处理中区分出第一群和第二群，在第一有核成分分类处理中用FLLA分类第一群的有核成分，在第二有核成分分类处理中用FLHP1分类第二群的有核成分，但不限于此。即，不必要反复提取标绘于特征参数空间一定范围的粒子并将提取的粒子标绘于下一个特征参数空间。比如也可以将把一个粒子识别为某种细胞的条件定义为：“既有在第一特征参数空间中的规定范围内的参数，又有在第二特征参数空间中的规定范围内的参数”。针对每一种细胞分别定义这种条件。然后，将满足某个条件的粒子作为该条件相应的细胞种类加以识别。具体举例而言，将具有进入图14的R21中的FSCP和FLHP1且具有进入图15的R32中的FSCW和FLLA的有核成分作为白细胞检出。将具有进入图14的R22的FSCP和FLHP1且具有进入图19的R5的FSCP和FLHP2的有核成分作为细菌检出。其他种类的细胞也同样，以此就能识别细胞种类。
在上述实施方式中，列举了二维特征参数空间的例子，但也可以将粒子标绘于三维或更多维的特征参数空间。
在上述实施方式中，区分处理主要利用FSCP的不同来区分第一群和第二群，进行检测，但不限于此。区分第一群和第二群的参数只要是反映细胞大小或核直径的参数即可，可以使用FSCP以外的其他参数。例如，也可以用SSCP取代FSCP。还可以用荧光脉冲幅度取代FSCP。由于核直径比射束点大的有核细胞从进入射束点起到出来所需时间比核直径比射束点小的有核细胞长，所以荧光脉冲幅度也大。因此，使用荧光脉冲幅度也能够区分第一群和第二群。
另外，在其他实施方式中，也可以使用DC阻抗作为反映细胞大小或核直径的参数。具体而言，可以构建一个由流式细胞仪和众所周知的DC阻抗检测器组合构成的样本分析装置。此装置通过流式细胞仪获取细胞的荧光信号，同时通过DC阻抗检测器获取反映细胞大小或核直径的参数。
在上述实施方式中，第一有核成分分类处理用FSCW和FLLA分类第一群的有核成分，但不限于此。也可以用FSCP或SSCP取代FSCW。
在上述实施方式中，第二有核成分分类处理用FSCP和FLHP1分类第二群的有核成分，但不限于此。也可以用SSCP取代FSCP。
在上述实施方式中，第一有核成分分类处理区分并检出白细胞、上皮细胞和异型细胞，但不限于此。也可以用荧光脉冲面积检出白细胞、上皮细胞和异型细胞其中之一或之二。第二有核成分分类处理也可以不区分并检出***、毛滴虫和真菌，而是用荧光强度检出***、毛滴虫和真菌其中之一或之二。
在上述实施方式中，制备测定试样时分别向反应槽供应染色液和稀释液，但不限于此。使用含有染色色素和稀释液成分的一种试剂制备测定试样时，也可以向反应槽供应一种试剂。
在上述实施方式中，就分析尿样本的尿样本分析装置进行了说明，但不限于此。本发明也可以适用于分析体液样本的样本分析装置，还可以适用于分析尿样本和体液样本的样本分析装置。
在上述实施方式中，样本分配部件1通过吸量作业定量吸移样本，向反应槽2u和反应槽2b分配样本等份，但不限于此。也可以通过采样阀定量所吸移的样本，将定量的样本等份供应到反应槽2u和反应槽2b。
在上述实施方式中，依次实施测定试样制备处理、无核成分测定处理、有核成分测定处理和测定数据分析处理，但此顺序只是一例，也可以按其他顺序进行上述处理。比如可以在制备第一测定试样后实施无核成分测定处理，再进行第一无核成分分类处理和第二无核成分分类处理，然后制备第二测定试样，进行有核成分测定处理，再进行第一有核成分分类处理、第二有核成分分类处理和细菌检测处理。另外，有核成分测定处理中使用第一设定值的第二测定试样的测定与使用第二设定值的第二测定试样的测定顺序也可以改变。
在上述实施方式中，由信息处理部件13进行测定数据分析，但不限于此。也可以由测定单元10的微型计算机11分析测定数据。
编号说明
1 样本分配部件
2 试样制备部件
2u、2b 反应槽
3 样本架
4 架台
5 光学检测部件
10 测定单元
11 微型计算机
13 信息处理部件
18u、18b 染色液
19u、19b 稀释液
50 放大线路
100 尿样本分析装置
401 CPU

Claims (17)

1.一种样本分析装置，包括：
混合样本和核酸染色试剂制备测定试样的试样制备部件；
用光照射所述测定试样所含有的细胞，接收细胞所发出的荧光，输出荧光信号的光学检测部件；
从所述光学检测部件输出的荧光信号获取细胞荧光脉冲面积和荧光强度的信号处理部件；以及
能够根据荧光脉冲面积检测所述测定试样所含有的白细胞，根据荧光强度检测所述测定试样所含有的细菌的信息处理部件。
2.根据权利要求1所述的样本分析装置，其特征在于：
所述信息处理部件能够根据荧光脉冲面积进一步检测所述测定试样中所含有的上皮细胞。
3.根据权利要求2所述的样本分析装置，其特征在于：
所述信息处理部件能够根据荧光脉冲面积进一步检测出所述测定试样中所含有的与白细胞和上皮细胞不同的异型细胞。
4.根据权利要求1所述的样本分析装置，其特征在于：
所述信息处理部件能够根据荧光强度进一步检测所述测定试样中所含有的真菌。
5.根据权利要求1所述的样本分析装置，其特征在于：
所述信息处理部件能够根据荧光强度进一步检测所述测定试样中所含有的***。
6.根据权利要求1所述的样本分析装置，其特征在于：
所述信息处理部件能够根据荧光强度进一步检测出所述测定试样中所含有的毛滴虫。
7. 根据权利要求1所述的样本分析装置，其特征在于：
所述光学检测部件包括形成测定试样的试样流的流动室
以及向所述流动室照射光并形成射束点的光源；
所述试样流流动方向的射束点直径为3μm以上8μm以下。
8.根据权利要求1所述的样本分析装置，其特征在于：
所述光学检测部件接收细胞所发出的散射光，输出散射光信号；
所述信息处理部件能够根据基于散射光信号的细胞的参数和所述荧光脉冲面积检测所述测定试样中所含有的白细胞。
9.根据权利要求8所述的样本分析装置，其特征在于：
所述信息处理部件能够根据基于散射光信号的细胞的参数和所述荧光强度检测所述测定试样中所含有的细菌。
10.根据权利要求1所述的样本分析装置，其特征在于：
所述光学检测部件能够用第一检测灵敏度和灵敏度高于第一检测灵敏度的第二检测灵敏度输出荧光信号；
所述信息处理部件能够根据以第一检测灵敏度输出的荧光信号的荧光脉冲面积检测白细胞，根据以第二检测灵敏度输出的荧光信号的荧光强度检测细菌。
11.一种样本分析装置，包括：
混合样本和核酸染色试剂制备测定试样的试样制备部件；
具有光源和流动室，在所述光源光照下的所述流动室内形成所述测定试样的试样流，以此从所述测定试样所含有的细胞获取反映细胞大小或核直径的参数、以及细胞的荧光脉冲面积和荧光强度的测定部件；
根据荧光脉冲面积识别具有在一定值以上的所述参数的细胞的种类，根据荧光强度识别具有不到所述一定值的所述参数的细胞的种类的信息处理部件。
12.根据权利要求11所述的样本分析装置，其特征在于：
所述信息处理部件将具有所述一定值以上的所述参数且具有在一定范围内的荧光脉冲面积的细胞识别为白细胞、上皮细胞或异型细胞；
将具有不到所述一定值的所述参数且具有在一定范围内的荧光强度的细胞识别为细菌、真菌、***或毛滴虫。
13.根据权利要求11所述的样本分析装置，其特征在于：
所述测定部件包括：接收所述试样流中所含有的细胞的散射光并输出散射光信号的散射光受光部件和接收荧光并输出荧光信号的荧光受光部件；
所述信息处理部件将所述散射光信号作为反映所述细胞大小或核直径的参数使用。
14.一种样本分析装置，包括：
混合样本和核酸染色试剂，制备测定试样的试样制备部件；
用光照射所述测定试样中所含有的细胞，接收细胞所发出的荧光，输出荧光信号的光学检测部件；
从所述光学检测部件输出的荧光信号获取细胞荧光脉冲面积和荧光强度的信号处理部件；
处理器；及
储存有计算机程序以便使所述处理器进行以下处理的存储部件：
根据荧光脉冲面积检测所述测定试样中所含有的白细胞；
根据荧光强度检测所述测定试样中所含有的细菌。
15.根据权利要求1~14其中任意一项所述的样本分析装置，其特征在于：
所述样本是尿。
16.一种样本分析方法，包括以下步骤：
混合样本和核酸染色试剂，制备测定试样的步骤；
用光照射制备的所述测定试样的步骤；
输出与所述测定试样中的细胞在光照下发出的荧光相应的荧光信号的步骤；
从荧光信号中获取细胞的荧光脉冲面积和荧光强度的步骤；
根据荧光脉冲面积检测所述测定试样中所含有的白细胞的步骤；
根据荧光强度检测所述测定试样中所含有的细菌的步骤。
17.一种样本分析方法，包括以下步骤：
混合样本和核酸染色试剂，制备测定试样的步骤；
用光照射制备的所述测定试样的步骤；
根据所述测定试样中的细胞在光照下发出的光，获取反映细胞大小或核直径的参数以及细胞的荧光脉冲面积和荧光强度的步骤；
根据荧光脉冲面积识别具有一定值以上的所述参数的细胞种类的步骤；
根据荧光强度识别具有不到所述一定值的所述参数的细胞种类的步骤。
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