CN104877919A - 一种球毛壳菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株对苹果炭疽病原菌具有强抑制效果的球毛壳菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 10609，保藏日期为2015年3月11日。本发明所提供的球毛壳菌HY1为濒危植物珊瑚菜的内生真菌，其发酵液与菌丝提取液均对苹果炭疽病原菌具有强抑菌效果，对其他植物病原菌也有一定的抑制作用，该菌株在苹果炭疽病防治等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种球毛壳菌及其应用

技术领域:

本发明涉及一株对苹果炭疽病原菌有强抑制作用的球毛壳菌,属于生物技术领域。

背景技术:

苹果炭疽病又称苦腐病，是苹果果实主要病害之一，我国大部分苹果产区均有发生，在夏季高温、多雨、潮湿的地区发病尤为严重。果实在座果后即可被感染，但在果实接近成熟时开始发病，采收后在贮藏期继续发展，造成采前大量落果和采后贮藏中果腐。

我国苹果炭疽病主要由胶孢炭疽菌引起，防治药剂也主要针对该病原菌。目前苹果炭疽病采前防治的方法主要有：生长期套袋、化学防治和生物防治等。套袋技术在苹果田间生产中已被大面积推广使用，存在的问题是生长期对幼果套袋增加了果农的经济和劳动投入，若掌握不好套袋时间和技术，可能还会造成更多不必要的经济损失。化学防治具有高效、速效、使用方便、经济效益高等特点，但是若使用不当容易造成植物发生药害，有益微生物受到损害，病原物产生抗药性，环境污染，甚至引起人畜中毒等许多严重后果。生物防治方法也为炭疽病的防治开辟了另一条途径，主要是通过有益微生物或诱抗剂的诱导使植物的抗病性增强，植物与病原物之间的关系发生改变，从而达到抑制病害发生的目的。

生物防治有广阔的应用前景，因为对环境的污染较小，无残留，对人畜安全，是近年来研究的热门课题，如具有抗植物病原菌作用的银杏内生真菌抗菌发酵液的制备方法，中国专利：CN103194490A、一种黄色篮状菌及其在防治植物病原菌中的应用，中国专利：CN102286383A，但是上述文献并未涉及球毛壳菌的防治作用。有关球毛壳菌的文献涉及其生物防治作用，如喜树内生真菌的抗植物病原菌发酵液的制备方法，中国专利：CN103255065A，但是均未涉及分离自濒危植物珊瑚菜内生球毛壳菌的报道。珊瑚菜是临床常用中药材料，少见病原菌侵染，其内生菌分离及其在农业病虫害生物防治中应用具有重要研究价值。

发明内容:

本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种分离自濒危植物珊瑚菜的内生球毛壳菌HY1，其培养要求简单，生长条件易控制且产率大，且抗菌效果较好，对苹果炭疽病原真菌的抑菌率最高达到100%，其发酵液与菌丝提取液对胶孢炭疽菌有很强的抑制作用，可作为苹果炭疽病的生物防治菌剂使用。

本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种球毛壳菌，其特征在于其保藏名称为：HY1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2015年3月11日，保藏编号为CGMCC No. 10609，分类命名：球毛壳菌Chaetomium globosum。

本发明的另一个目的是该球毛壳菌在抑制苹果炭疽病原菌中的应用。

本发明的另一个目的是该球毛壳菌的发酵液与菌丝提取液作为苹果炭疽病的生物防治菌剂的应用。

本发明球毛壳菌HY1，分离自山东省海阳市的海边自然生长的健康成年期珊瑚菜新鲜叶片内部，最初培养时菌落呈浅黄色，后颜色开始变黄变黑，液体培养时菌丝呈球状。显微形态观察发现菌丝具横隔状，基内菌丝向外周辐射，孢子囊外面包裹着不透明的黑色子囊壳，子囊壳上具有特殊的毛发状结构。子囊孢子柠檬形或广椭圆形而两端略尖，暗褐色至橄榄褐色。

本发明中球毛壳菌HY1，培养容易，可在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上生长良好，且在20℃—35℃均能正常培养。

本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：本发明培养要求简单，生长条件易控制且产率大。且抗菌效果较好，对苹果炭疽病原真菌的抑菌率最高达到100%，还对小麦赤霉菌、西瓜枯萎菌、番茄灰霉菌、玉米弯孢菌的抑制率分别达到66.53%、30.49%、31.25%、59.17%，该菌株在苹果炭疽病的防治方面具有广阔的应用前景。本发明球毛壳菌HY1的发酵液及其菌丝提取液对胶孢炭疽菌有很强的抑制作用，可作为苹果炭疽病的生物防治菌剂使用，对苹果炭疽病原菌抑制率高。

附图说明：

图1为球毛壳菌HY1在分离培养基上的培养特征图；

图2为球毛壳菌HY1的显微镜形态观察特征图；

图3为球毛壳菌HY1的发酵液与菌丝体水提液对苹果炭疽病原菌的抑菌率图；

图4为球毛壳菌HY1胞内代谢产物液与商品农药的使用效果比较图；

图5为球毛壳菌HY1胞外代谢产物液与商品农药的使用效果比较图。

具体实施方式：

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。

实施例1：内生真菌的筛选与抑菌活性：

所用的筛选培养基（加抗生素的PDA培养基）：马铃薯200g去皮切块后蒸煮20min, 后过4层纱布收集滤液，加入葡萄糖20g, 琼脂20g，加热融化后定容至1000ml，依次添加青霉素和链霉素至终浓度均为80ug/ml，pH值自然，121℃，高压灭菌20min后倒平板备用。

内生真菌的筛选：从健康成年期珊瑚菜上取新鲜叶片，在流水下冲洗干净，对材料进行表面消毒，先用75%的乙醇处理90S，然后在氯化汞中浸泡5min，无菌水冲洗4-5遍后再无菌的培养皿上将材料切成0.5cm*0.5cm的小块组织。将切块的珊瑚菜叶片组织用无菌镊子放置于筛选培养基的表面，切面朝向培养基，每皿放3-4块组织，28℃恒温培养，同时取表面消毒的未切开的叶片和冲洗最后一遍的无菌水分别置于平板中作为对照。经过5~7 d，菌丝从组织块上长出，形成一定大小菌落时(以叶片组织块为中心向周围进行扩散生长的为分离的目的菌种)，从边缘挑取菌丝移到另一筛选培养基平板上进行纯化，重复至纯培养。

抑制农业病原菌活性测定：采用抑制菌丝生长速率法测定。首先采用不添加抗生素的PDA液体培养基中28℃下培养7d，8000r/min离心收集菌丝体，经烘干后将研磨成粉末，以1:10（g/ml）比例用丙酮萃取18h，再用超声波细胞破碎仪破碎（5min, 600W）进一步提取其化学成分，取内生真菌的丙酮提取液备用。内生真菌培养物的丙酮提取液加入灭菌融化的PDA培养基（不加抗生素）中，每145ml培养基加5ml提取液，（用5ml的无菌水和丙酮分别做空白对照），混匀倒平板。用直径0.5cm的打孔器在已经活化的供试农业病原菌的菌落边缘按同心圆制备菌饼，接种于上述平板上，每个处理设3个重复，于28℃恒温培养4d，采用十字交叉法测量菌落直径。

抑菌率(%)=(对照净生长量-处理净生长量)/对照净生长量*100％

净生长量=三次重复平均值(cm) - 0.5cm

筛选的内生真菌对农业病原菌的抑制效果见表1，其中被检测的10株内生真菌中，菌株HY1的抑菌效果最好，对小麦赤霉病菌的抑菌率达到66.53%，对苹果炭疽病菌的抑菌率最高，达到100%。

表1 筛选的珊瑚菜内生真菌对农业病原菌的抑制效果

实施例2：内生真菌HY1的菌属鉴定：

形态特征：最初培养时菌落呈浅黄色，呈圆形生长，菌落表面无明显纹饰，菌落疏松且扁平，菌丝发达较长，生长速度较快（见附图1）；后期颜色开始变黄变黑，液体培养时菌丝呈球状。显微形态观察发现菌丝具横隔状，基内菌丝向外周辐射（见附图2），孢子囊外面包裹着不透明的黑色子囊壳，子囊壳上具有特殊的毛发状结构。

内生菌株的18S rDNA序列分析：CTAB法提取内生真菌HY1菌株的基因组DNA，采用18Sr DNA的通用引物（NS：5’-GTAGTCTATGCTTGTCTC-3’和NS6：5’-GCATCACAGCCTGTTATTGCC TC-3’）进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性94℃，4min；变性94℃，45S，退火55℃，45S，延伸72℃，1min,共30个循环，后延伸72℃，10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，利用凝胶回收试剂盒回收后送交公司测序。测序获得的其18S rDNA 基因序列长度为1349 bp，在GenBank上经BLAST比对分析，发现该菌株与Chaetomium globosum（AY545725.1）的18S rDNA序列高度相似，判定为同一种（相似度99%）。

 结合形态学和分子鉴定结果，确定菌株HY1为球毛壳菌（Chaetomium globosum）。

具体基因序列见序列表：

<110> 鲁东大学

<120> 一株对苹果炭疽病原菌具有强抑制作用的球毛壳菌

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 1

<211> 1349

<212> DNA

<213> 球毛壳菌(Chaetomium globosum)

taagtataag cattataccg cgaaactgcg aatggctcat taaatcagtt atcgtttatt 60

tgatagtacc ttactacatg gataaccgtg gtaattctag agctaataca tgctaaaaat 120

cccgacttcg gaagggatgt atttattaga ttaaaaacca atgcccttcg gggctctctg 180

gtgattcata ataacttctc gaatcgcacg gccttgcgcc ggcgatggtt cattcaaatt 240

tctgccctat caactttcga cggctgggtc ttggccagcc gtggtgacaa cgggtaacgg 300

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aaagttgttg aggttaaaaa gctcgtagtt gaaccttggg cctagccggc cggtccgcct 600

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gctcgaatac attagcatgg aataatagaa taggacgtgt ggttctattt tgttggtttc 780

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tgaaattctt ggatttattg aagactaact actgcgaaag catttgccaa ggatgttttc 900

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actcaccagg tccagacacg atgaggattg acagattgag agctctttct tgatttcgtg 1200

ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctgcttaa ttgcgataac 1260

gaacgagacc ttaacctgct aaatagcccg tattgctttg gcagtacgct ggcttcttag 1320

agggactatc gctcaagccc gaaaattta                                          1349

实施例3：球毛壳菌HY1胞内和胞外代谢产物的抑菌活性

将液体培养的菌株HY1培养液用8层无菌纱布过滤，分别收集发酵液和菌丝体，发酵液即为胞外代谢产物液。菌丝体60℃烘干后，研成粉末，以1:10（g/ml）比例用蒸馏水萃取18h，再用超声波细胞破碎仪破碎（5min, 600W）进一步提取其化学成分，即得胞内代谢产物液。以苹果炭疽病菌为指示菌，每100ml培养基分别加入胞外代谢产物液0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1.0ml、1.25ml；加入胞内代谢产物液0.25ml、0.5ml、0.75ml、1.0ml、1.25ml，，进行抑菌活性的测定，测定方法同实施例1中的抑制农业病原菌活性测定。

球毛壳菌HY1的菌丝体水提液（胞内代谢产物液）与发酵液（胞外代谢产物液）对苹果炭疽病原菌的抑菌效果见附图3。不同浓度的菌丝体水提取液与发酵液对苹果炭疽病原菌的抑菌活性都随着浓度的增加而增大，且水提液与发酵液的抑菌效果相当。当100ml培养基中加入1ml菌丝体蒸馏水提取液与发酵液时，其抑菌率均达到90%以上，菌丝体水提取液在加入0.5ml时就达到90%，球毛壳菌HY1的发酵液与菌丝水提取液对苹果炭疽病原菌均具有强抑菌作用。

实施例4：球毛壳菌HY1与商品农药的使用效果比较

按照实施例3中描述的方法制备球毛壳菌HY1的胞外代谢产物液和胞内代谢产物液。以苹果炭疽病菌为指示菌，每100ml培养基分别加入胞外代谢产物液0.25ml、0.5ml、0.75ml、1.0ml；加入胞内代谢产物液0.25ml、0.5ml、0.75ml、1.0ml、1.25ml，进行抑菌活性的测定，测定方法同实施例1中的抑制农业病原菌活性测定。根据现在市场苹果炭疽病菌防治药物靓果安的说明书：用药倍数为稀释600-800倍，将靓果安稀释为600倍，用相同的方法测其抑菌效果，并与球毛壳菌HY1的抑菌效果比较。球毛壳菌HY1与商品农药的使用效果比较见附图4和附图5，除了低浓度组（0.25ml）球毛壳菌HY1的抑制效果略低于商品农药外，其余试验组接近或高于商品农药的使用效果，每100ml加入0.5ml的菌丝体水浸提液和0.5ml发酵液与商品农药有相同的抑制苹果炭疽病原菌效果。

本发明的球毛壳菌HY1是一株对苹果炭疽病原菌具有强抑制作用的菌株，还未见除本发明之外的分离自珊瑚菜叶片组织的报道，其优点为发酵液及其菌丝提取液对苹果炭疽病原菌抑制率高，培养要求简单，生长条件易控制且产率大。该菌株在苹果炭疽病的防治方面具有广阔的应用前景。

Claims (3)

1.一种球毛壳菌，其特征在于其保藏名称为：HY1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2015年3月11日，保藏编号为CGMCC No. 10609，分类命名：球毛壳菌Chaetomium globosum。

2.权利要求1所述的一种球毛壳菌在抑制苹果炭疽病原菌中的应用。

3.权利要求1所述的一种球毛壳菌的发酵液与菌丝提取液作为苹果炭疽病的生物防治菌剂的应用。