CN113832160B

CN113832160B - ZmbZIPf3基因及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN113832160B
Application number: CN202010511250.7A
Authority: CN
Inventors: 邓馨; 刘晓强; 刘璐
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: CN113832160A

Abstract

本发明公开了ZmbZIPf3基因及其编码的蛋白和应用。本发明首先提供了DNA分子，所述DNA分子为SEQ ID NO.1第619‑1308位或编码序列为SEQ ID NO.1第619‑1308位所示的DNA分子。本发明进一步提供了上述DNA分子编码得到的蛋白质及其在调控植物耐旱性和/或耐碱性中的应用。本发明从玉米中筛选到ZmbZIPf3基因，将该基因导入野生型拟南芥，与野生型拟南芥相比，其抗旱性及耐碱性明显提高，说明ZmbZIPf3是与耐旱性及耐碱性相关的基因，对于培育抗旱及耐碱作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

ZmbZIPf3基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及ZmbZIPf3基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

植物在生长过程中常会受到干旱和盐碱等非生物逆境胁迫，这些不利的环境因素会对植物造成巨大伤害，导致植物发生一系列形态学、生理学和分子水平的变化，影响植物的生长发育和作物产量。阐明抗逆的分子机制，理解非生物逆境信号在植物体内的传导途径，并加以利用，是提高植物抗非生物胁迫性能的有效途径之一。同时也是利用基因工程方法，改良农作物抗逆性的必要前提。

随着全球水资源的缺乏和极端气候事件频率的不断上升，干旱对作物的产量和品质的负作用日趋显著。玉米是重要的粮食、饲料和能源作物，然而许多玉米产区干旱和盐渍化等问题严重影响其生长和产量。因此，通过分子操作技术提高玉米及其他作物对非生物胁迫的抵御能力变得日趋重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为如何提高植物的抗逆性，尤其是抗旱性和耐碱性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述DNA分子，所述DNA分子为ZmbZIPf3基因；所述ZmbZIPf3基因为如下A1)或A2)或A3)中任一所示：

A1)SEQ ID NO.1第619-1308位所示的DNA分子；

A2)编码序列为SEQ ID NO.1第619-1308位所示的DNA分子；

A3)在严格条件下与A1)或A2)限定的DNA分子杂交，且编码SEQ ID NO.2所示的蛋白质的DNA分子。

其中，SEQ ID NO.1由1531个核苷酸组成，其编码序列为自5′末端起第619-1308位，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

本发明进一步提供了一种蛋白质，来源于玉米(Zea mays)，名称为ZmbZIPf3蛋白或蛋白质ZmbZIPf3，所述蛋白质为如下B1)或B2)或B3)任一所示：

B1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

B2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

B3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。

其中，SEQ ID NO.1由229个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

与上述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。所述生物材料具体可为下述C1)至C12)中的任一种：

C1)编码上述蛋白质的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；

C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；

C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；

C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；

C9)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

C10)含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

C11)含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C12)含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，所述核酸分子可为上述A1)或A2)或A3)所示的DNA分子。

上述生物材料中，所述表达盒所述表达盒是含有编码上述蛋白质的核酸分子的表达盒(即ZmbZIPf3基因表达盒)，指能够在宿主细胞中表达蛋白质ZmbZIPf3的DNA分子，该DNA分子不但可包括启动ZmbZIPf3基因转录的启动子，还可包括终止ZmbZIPf3基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

在本发明具体的实施方式中，所述表达盒为SEQ ID NO.3所示的ZmbZIPf3基因表达盒，包括CaMV35Sq启动子、ZmbZIPf3基因的编码序列和pA35S终止子，其中，CaMV35Sq启动子为SEQ ID NO.3自5’末端第1-698位、ZmbZIPf3基因的编码序列为SEQ ID NO.3自5’末端第1128-1817位(对应SEQ ID NO.1自5’末端第619-1308位)、pA35S为SEQ ID NO.3自5’末端第1822-2040位。

上述生物材料中，所述重组载体可含有SEQ ID NO.2所示的用于编码上述蛋白质的DNA分子。

可用植物表达载体构建含有上述蛋白质的编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway***载体或双元农杆菌载体等，如pLeela、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA super1300、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用ZmbZIPf3构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

在本发明具体的实施方式中，所述重组载体为pLeela-ZmbZIPf3。所述pLeela-ZmbZIPf3是将植物表达载体pLeela的attR1和attR2重组位点间的序列替换为SEQ ID NO.3所示的DNA分子，且保持其它序列不变得到的载体。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。

上述生物材料中，所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

上述生物材料中，所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述DNA分子、上述蛋白质或上述生物材料在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

D1)调控植物耐旱性；

D2)制备调控植物耐旱性的产品；

D3)提高植物耐旱性；

D4)制备提高植物耐旱性的产品；

D5)调控植物耐碱性；

D6)制备调控植物耐碱性的产品；

D7)提高植物耐碱性；

D8)制备提高植物耐碱性的产品；

D9)调控植物对脱落酸(ABA)的敏感性；

D10)制备调控植物对ABA的敏感性的产品；

D11)提高植物对ABA的敏感性；

D12)制备提高植物对ABA的敏感性的产品。

上述DNA分子、上述蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用也在本发明的保护范围之内。

上述应用中，植物育种中的应用具体可为将含有上述蛋白质或上述生物材料(如上述蛋白质的编码基因)的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。

本发明进一步提供了提供一种培育抗旱性和/耐碱性高的转基因植物的方法。

本发明培育抗旱性和/耐碱性高的转基因植物的方法，包括提高目的植物中上述蛋白质的基因的表达量和/或所述蛋白质的含量和/或所述蛋白质的活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性和/耐碱性高于所述目的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中上述蛋白质的基因的表达量和/或所述蛋白质的含量和/或所述蛋白质的活性的方法为在目的植物中表达或过表达上述蛋白质。

上述方法中，所述表达或过表达的方法为将上述蛋白质的编码基因导入目的植物。

上述方法中，将所述蛋白质的编码基因导入目的植物可通过携带有本发明上述蛋白质的编码基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明所述蛋白质的编码基因的植物表达载体可通过使用农杆菌介导、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1第619-1308位所示的DNA分子。

携带有本发明所述蛋白质的编码基因的植物表达载体可为pLeela-ZmbZIPf3。所述pLeela-ZmbZIPf3是将植物表达载体pLeela的attR1和attR2重组位点间的序列替换为SEQ ID NO.3所示的DNA分子，且保持其它序列不变得到的载体。

本发明中耐旱性具体体现在：a1)通过PEG模拟干旱胁迫下转基因植株根长优于野生型植株；a2)通过PEG模拟干旱胁迫下转基因植株长势优于所述目的植物。

本发明中耐碱性具体体现在：b1)通过pH9.0碱胁迫作用下转基因植物的地上部生长强于所述目的植物；b1)通过pH9.0碱胁迫作用下转基因植物的根系生长强于所述目的植物。

本发明中，所述植物是如下E1)-E4)中的任一种：

E1)双子叶植物；

E2)单子叶植物；

E3)十字花科植物；

E4)禾本科植物；

其中，所述十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)；所述禾本科植物如玉米(Zea mays)。

本发明从玉米中筛选到一个响应干旱、碱胁迫及受ABA诱导表达的ZmbZIPf3基因，将该基因导入野生型拟南芥，得到转ZmbZIPf3拟南芥，与野生型拟南芥相比，该转ZmbZIPf3拟南芥的抗旱性及耐碱性明显提高，说明ZmbZIPf3是与耐旱性及耐碱性相关的蛋白，参与胁迫响应。因此ZmbZIPf3是与植物抗旱及耐碱胁迫相关的基因，对于培育抗旱及耐碱作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

附图说明

图1为转ZmbZIPf3拟南芥株系的鉴定(a)和表达量测定(b)。

图2为不同浓度ABA处理条件下转ZmbZIPf3拟南芥种子萌发情况；其中，a、b、c和d分别为1/2MS培养基、含0.25μM、0.5μM、1μM ABA的1/2MS培养基中转ZmbZIPf3拟南芥种子萌发情况。

图3为不同浓度ABA处理条件下转ZmbZIPf3拟南芥苗期生长情况；其中，a、b和c分别为1/2MS培养基、含0.1μM、1μM ABA的1/2MS培养基中转ZmbZIPf3拟南芥苗期生长情况。

图4为转ZmbZIPf3拟南芥的PEG模拟干旱下的生长情况；其中，a、b和c分别为1/2MS培养基、30％PEG、40％PEG渗透过夜的1/2MS培养基中转ZmbZIPf3拟南芥苗期生长情况。

图5为转ZmbZIPf3拟南芥的碱胁迫下的生长情况；其中，a和b分别为1/2MS培养基、1/2MS(pH 9.0)培养基中转ZmbZIPf3拟南芥地上部及根系生长情况。

图6为转ZmbZIPf3拟南芥叶片干旱胁迫下气孔开度对比结果。

图1-6中，Col代表野生型拟南芥Col-0，8-3代表转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4代表转ZmbZIPf3拟南芥株系12-4和15-5代表转ZmbZIPf3拟南芥株系15-5。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中用到的主要材料和试剂的来源如下：

玉米自交系B73，记载于非专利文献“Zea mays L.；ZmbZIP60 mRNA is splicedin maize in response to ER stress，BMC Research Notes(2012)5：144.”，公众可从中国科学院植物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

RNase抑制剂(购自Takara公司)，反转录酶SuperScript TM III(购自Invitrogen公司)，pENTR/D-TOPO(购自Invitrogen公司)，Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(购自NEB公司)。

植物表达载体pLeela记载于非专利文献“A novel role for histonemethyltransferase KYP/SUVH4 in the control of Arabidopsis primary seeddormancy，New Phytologist(2012)193:605-616”，公众可从中国科学院植物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

农杆菌Gv3101(pMP90RK)(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(pMP90RK))记载于非专利文献“Binary Agrobacterium vectors for planttransformation,M Bevanin，Nucleic Acids Research(1984)12：8711-8721.”，公众可从中国科学院植物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

拟南芥Col-0(ecotype columbia，Arabidopsis thaliana)记载于非专利文献“Arabidopsis,a useful weed.Meyerowitz EM，Cell(1989)56：263-270.”，公众可从中国科学院植物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

实施例1、ZmbZIPf3基因的获得

提取三叶一心期的玉米自交系B73的叶片的总RNA并以其为模板进行反转录；其中，反转录反应体系为：

(1)DNA消化：10ul体系

(2)反转录：25ul体系

充分解链，加入经步骤(1)DNA消化的总RNA 10ul

OligodT 1ul

DEPC-H₂0 2.5ul

条件：70℃温育5min，冰上放置5min。

以步骤(2)反转录得到的cDNA稀释10倍作为模板，利用引物F：5'–GAATCCGAGAAAAGGCGAAAG-3'和引物R：5'–GCACAAGAAGCATGGACCACAG-3'及Phusion High-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，获得PCR产物，其中，反应条件为：先98℃预变性45sec，然后98℃变性10sec，54℃退火20sec，再72℃延伸1.5min，共40个循环；最后72℃延伸10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到大小为1246bp左右的PCR产物；回收该PCR产物条带。

将该PCR产物与载体pENTR/D-TOPO连接，获得中间载体pENTR-ZmbZIPf3；所述pENTR-ZmbZIPf3是将该PCR产物导入含有拓扑异构酶的线性载体pENTR/D-TOPO,且保持其他序列不变得到的中间载体。所述pENTR-ZmbZIPf3是将pENTR/D-TOPO的第569-804位替换为PCR产物，且保持其他序列不变得到的载体。

将SEQ ID NO.1所示的基因命名为ZmbZIPf3，SEQ ID NO.1为ZmbZIPf3全长cDNA序列。经过测序，该PCR产物的序列如SEQ ID NO.1中自5’末端第218-1464位，该PCR产物包含SEQ ID NO.1中自5’末端第619-1308位所示的ZmbZIPf3的编码序列，将该基因编码的蛋白命名为ZmbZIPf3，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2、转ZmbZIPf3拟南芥的获得及其功能研究

一、转ZmbZIPf3拟南芥的获得

1、重组载体pLeela-ZmbZIPf3的获得

将实施例1构建的中间载体pENTR-ZmbZIPf3通过LR反应(LR克隆酶，购自Invitrogen公司)将实施例1的PCR产物导入植物表达载体pLeela中，同源重组得到重组载体。

经过测序，该重组载体为植物表达载体pLeela的attR1和attR2重组位点间的序列替换为SEQ ID NO.3所示的DNA分子，且保持其它序列不变得到的载体，该重组载体受35S启动子驱动，将该重组载体命名为pLeela-ZmbZIPf3。

其中，SEQ ID NO.3所示的DNA分子为ZmbZIPf3基因表达盒，包括CaMV35Sq启动子、ZmbZIPf3基因的编码序列和pA35S终止子，其中，CaMV35Sq启动子为SEQ ID NO.3自5’末端第1-698位、ZmbZIPf3基因的编码序列为SEQ ID NO.3自5’末端第1128-1817位(对应SEQ IDNO.1自5’末端第619-1308位)、pA35S为SEQ ID NO.3自5’末端第1822-2040位。

2、重组菌的获得

将步骤1得到的重组载体pLeela-ZmbZIPf3转化到农杆菌Gv3101(pMP90RK)细胞中，用含有50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml庆大霉素、50μg/ml利福平、50μg/mL的羧苄霉素的YEB培养基进行筛选，得到重组菌。

提取重组菌的质粒送去测序，结果该质粒为pLeela-ZmbZIPf3，说明为阳性重组菌，将该重组菌命名为Gv3101(pMP90RK)/pLeela-ZmbZIPf3。

3、转ZmbZIPf3拟南芥的获得及筛选

1)转ZmbZIPf3拟南芥的获得

将步骤2得到的重组菌Gv3101(pMP90RK)/pLeela-ZmbZIPf3采用花序浸泡法转化野生型拟南芥Col-0，得到T0代转ZmbZIPf3拟南芥。

2)转ZmbZIPf3拟南芥的筛选

取T0代转ZmbZIPf3拟南芥种子播种于含有100μg/ml羧苄青霉素钠的MS培养基上，将具有抗性的成活幼苗移至温室培养(培养温度22℃，光周期16/8小时)，收集15株T1代转ZmbZIPf3拟南芥种子并播种于含100μg/ml羧苄青霉素钠的MS培养基中，选取3株分离比为3:1的T1代转ZmbZIPf3拟南芥的成活幼苗(5-10棵)移至温室培养，收集T2代转ZmbZIPf3拟南芥种子并播种于含100μg/ml羧苄青霉素钠的MS培养基中，不发生分离转基因拟南芥即纯合体。最终选取T2代转ZmbZIPf3拟南芥纯合体株系OE8-3、OE12-4、OE15-5进行下述试验。

3)检测转ZmbZIPf3拟南芥中ZmbZIPf3的表达

A、提取3周苗龄的T2代转ZmbZIPf3拟南芥OE8-3、OE12-4、OE15-5和野生型拟南芥Col-0的基因组DNA，利用引物F：5'-CCCCTGCCAACTGCTCTTCT-3'和引物R：5'-GACGCAAGCCTTCTGGGACA-3'进行PCR扩增；其中，反应体系(10ul)如下：

反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸20sec，共35个循环；最后再72℃延伸10min。

检测结果图1中a所示，转ZmbZIPf3拟南芥OE8-3、OE12-4、OE15-5均扩增出较亮的，大小约为617bp的目的条带，而野生型株系则未扩增出目的条带。

B、提取3周苗龄的T2代转ZmbZIPf3拟南芥OE8-3、OE12-4、OE15-5和野生型拟南芥Col-0的RNA，反转录得到的cDNA稀释10倍作为模板(方法同实施例1)，利用引物ZmbZIPf3-F-RT：5'-CCAACTGCTCTTCTCCCACC-3'和ZmbZIPf3-R-RT：5'-CTTCTTGACCTCCTCTTCCAG-3'进行PCR扩增；其中，反应体系和反应程序如步骤A。

以Actin1基因为内参，扩增引物为：Actin1-F：5'-CATCAGGAAGGACTTGTAC GG-3'，Actin1-R：5'-GATGGACCTGACTCGTCATAC-3'。

结果如图1中b所示，转ZmbZIPf3拟南芥OE8-3、OE12-4、OE15-5均扩增出较亮的目的条带，且表达量为OE15-5＞OE12-4＞OE8-3，说明ZmbZIPf3基因在3个转基因株系中均成功表达，而野生型拟南芥Col-0无ZmbZIPf3基因表达。

二、转ZmbZIPf3基因拟南芥表型鉴定

1、ABA敏感性鉴定

选取转ZmbZIPf3基因拟南芥株系OE8-3、OE12-4、OE15-5及野生型拟南芥Col-0的种子，吸胀、低温放置3d后，分别点播于1/2MS培养基和含0.25μM、0.5μM、1μM ABA的1/2MS培养基上，培养10-12d，利用体视显微镜(品牌：OPTEC)，每天统计萌发率。

结果如图2所示，在1/2MS培养基上，转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3和15-5萌发率略低于野生型拟南芥Col-0，但在4-5d后萌发率均可达到100％(图2中a所示)；在含0.25μM ABA的1/2MS培养基上，转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5同野生型拟南芥Col-0无明显差异，萌发率均在90％以上(图2中b所示)；在含0.5μM ABA的1/2MS培养基上，转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3在4d为65％，明显低于野生型拟南芥Col-0(85％)，转ZmbZIPf3拟南芥株系12-4、15-5萌发率则同野生型拟南芥Col-0接近(图2中c所示)；在含1μM ABA的1/2MS培养基上，转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5在第4-5d时萌发率仅为30％～65％，均明显低于野生型拟南芥Col-0(85％)(图2中d所示)。

将转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5及野生型的种子，吸胀、低温放置3d后，分别点播于1/2MS培养基及含0.1μM和1μM ABA的1/2MS培养基上，培养两周后观察幼苗生长情况，拍照。

结果如图3所示，在1/2MS培养基和含0.1μM ABA的1/2MS培养基上，ZmbZIPf3转基因拟南芥株系8-3、12-4和15-5与野生型拟南芥Col-0生长情况无明显差异(图3中a和b所示)；而在含1μM ABA的1/2MS培养基上，与野生型拟南芥Col-0相比，转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5生长均受到比较明显的抑制。

上述结果表明，转ZmbZIPf3基因拟南芥株系对高浓度的ABA较为敏感，ABA是参与植物抗逆生理过程的重要激素，对ABA敏感性较高的植物通常具有耐旱等特性。

2、耐旱性鉴定

将转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5及野生型拟南芥Col-0的种子4℃处理3d后点播于1/2MS培养基上，生长3d，分别移至1/2MS培养基(CK)、30％PEG、40％PEG渗透过夜的1/2MS(PEG)培养基上，竖直培养4周后观察表型。

结果如图4所示，在1/2MS培养基(CK)中转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5与野生型拟南芥Col-0的长势无明显差异(图4中a所示)；在30％PEG、40％PEG渗透过夜的1/2MS(PEG)培养基中(即在PEG胁迫下)转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5与野生型拟南芥Col-0的根长无明显差异，但转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5的地上部的生长均稍强于野生型拟南芥Col-0(图4中b和c所示)。

PEG通常用来模拟干旱胁迫条件，上述结果表明转ZmbZIPf3拟南芥具有抗旱性。

3、耐碱性鉴定

碱胁迫处理：将转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5及野生型拟南芥Col-0的种子4℃处理3d后点播于1/2MS培养基上，生长3d，分别移至正常条件下的1/2MS培养基(CK)，碱性条件下的1/2MS(pH 9.0)培养基上进行培养，拟南芥幼苗生长2周左右进行观察。

结果如图5所示，在1/2MS培养基(CK)中，转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5与野生型拟南芥Col-0长势相当(图5中a所示)；在1/2MS(pH 9.0)培养基(即pH9.0的碱胁迫下)转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3和15-5的地上部及根系的生长均强于野生型拟南芥Col-0(图5中b所示)。

以上结果表明，转ZmbZIPf3拟南芥对碱胁迫具有抗性。

4、干旱胁迫下气孔开度观察

选取土壤中正常生长三周且长势相当的转ZmbZIPf3拟南芥株系8-3、12-4和15-5与野生型拟南芥Col-0植株，取成熟叶片若干，分为三组进行不同时间的干旱处理，分别在0h、1h、4h时取样，在正置显微镜(型号：Nikon 80i)下观察气孔，并利用ImageJ软件测量气孔开度的大小并进行统计结果如图6所示，转ZmbZIPf3拟南芥株系OE12-4的气孔开度在叶片干旱处理前后均低于野生型，转ZmbZIPf3拟南芥株系OE8-3和OE15-5气孔开度在叶片干旱前与野生型拟南芥Col-0差异不大，但干旱后明显低于野生型拟南芥Col-0，表明ZmbZIPf3过表达可使拟南芥叶片气孔开度变小，使植株的失水速率变慢，有利于植物的保水抗旱功能，这与其PEG抗性表型一致。

以上结果表明转ZmbZIPf3基因能够明显提高植株的耐旱性及耐碱性，说明ZmbZIPf3是与植物耐旱及耐碱胁迫相关的蛋白。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院植物研究所

<120> ZmbZIPf3基因及其编码的蛋白和应用

<130> GNCFY200884

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1531

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 1

gccaacaaaa acctcccagc actggcaaga acagggaatc gtcccctccc tccgtctcca 60

ccgcccacca ctgatcggat cacgtcggcg tcccatctcc tcctccacga cacagaacgc 120

cgctcccttt ccgggattct cctctccaat cgcagctaaa acgcaacgca ctggatcgga 180

cgtcgccaaa aagatcggtg gcgacaccat aaagaaagaa tccgagaaaa ggcgaaaggg 240

gaggagagaa aggggaggta caaaatttct acccgctaga ggttagctag ctcggcggcg 300

agggaacgag agacgcccta ccgtcgattc catatcgtcg ctccgatatt ctgatgccgg 360

aatcctgctt ttccggctag cttaccgata cctcctaggt ggtttccagt cctcaccctt 420

ccaacctcta ctatcctttt tttgtgaatt tacctccacc gaattcgggc agctcaccat 480

ttcttggagt ttggtgtcct ttctcgagtg tttccttcct ccctcccggg ttctactgct 540

gagtggcatc tttcttgtgc gacttgtccg ttgaccacag gcggagaaat ttgttctcgg 600

cacacattct ctgccacaat ggacgatgga gctgacctcc cctgccaact gctcttctcc 660

cacccggaga tgcctgacag cttcgacgag ttcttcaaca gcgccacgac gacctgcacc 720

cacacgcaca gctgcaaccc gcccggcccc tcggtcgcca tgcacacccg cacgtgcctg 780

cacgcgcaca ccctggtcct gggcagcggc ggggaggacg acgacgacgc cagggaggac 840

tcggcgaagc cgcgcagacc gctggggaac agggaagctg tgcgcaagta ccgggagaag 900

aagaaggcgc acgcggcctt tctggaagag gaggtcaaga agctccgcgc cgccaaccag 960

cagctccaga gacggctgca gggccatgca gctttggagg cggaggtggc gaggctccgg 1020

ggtctcctgc tcgatatccg gggcaagatc gacgccgagg tcggcggcgt gctccctttt 1080

cagaagccgt gcagtgtggg ctccgtggcg tgtgccgatc ctgctctgtg cttcaacggc 1140

aactcggagg ttggaggcgg ctgggaggag agctcaagac cggcagccgc ggactgcagg 1200

atcgatgaag tgcgagggat gtcacgggaa attgatgtcc cagaaggctt gcgtcattcc 1260

atggatgttg ttgcgagctt cgtgagttct gatcccctgg ctgaatgagc gcgtttgcct 1320

gattggcagt tttttttttt tggggcctct gccagtgcca gcttcttttg gcttgcttga 1380

aaggtcaaat tttcatgtaa ttagaagaat tgaggaactg ataatgagtg gaactacctc 1440

cactgtggtc catgcttctt gtgctggtgt tcagtgtgta tagctgagat tatattgaac 1500

taatataaat gcactgaaca ctgtttacat c 1531

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 2

Met Asp Asp Gly Ala Asp Leu Pro Cys Gln Leu Leu Phe Ser His Pro

1 5 10 15

Glu Met Pro Asp Ser Phe Asp Glu Phe Phe Asn Ser Ala Thr Thr Thr

20 25 30

Cys Thr His Thr His Ser Cys Asn Pro Pro Gly Pro Ser Val Ala Met

35 40 45

His Thr Arg Thr Cys Leu His Ala His Thr Leu Val Leu Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Glu Asp Asp Asp Asp Ala Arg Glu Asp Ser Ala Lys Pro Arg Arg

65 70 75 80

Pro Leu Gly Asn Arg Glu Ala Val Arg Lys Tyr Arg Glu Lys Lys Lys

85 90 95

Ala His Ala Ala Phe Leu Glu Glu Glu Val Lys Lys Leu Arg Ala Ala

100 105 110

Asn Gln Gln Leu Gln Arg Arg Leu Gln Gly His Ala Ala Leu Glu Ala

115 120 125

Glu Val Ala Arg Leu Arg Gly Leu Leu Leu Asp Ile Arg Gly Lys Ile

130 135 140

Asp Ala Glu Val Gly Gly Val Leu Pro Phe Gln Lys Pro Cys Ser Val

145 150 155 160

Gly Ser Val Ala Cys Ala Asp Pro Ala Leu Cys Phe Asn Gly Asn Ser

165 170 175

Glu Val Gly Gly Gly Trp Glu Glu Ser Ser Arg Pro Ala Ala Ala Asp

180 185 190

Cys Arg Ile Asp Glu Val Arg Gly Met Ser Arg Glu Ile Asp Val Pro

195 200 205

Glu Gly Leu Arg His Ser Met Asp Val Val Ala Ser Phe Val Ser Ser

210 215 220

Asp Pro Leu Ala Glu

225

<210> 3

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtctcagaag accagagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc 60

ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaagat 120

ggcttctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga atgcctctac 180

cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggaac atcgtggaaa aagaagacgt 240

tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgataac atggtggagc acgacactct 300

cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac cagagggcta ttgagacttt 360

tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 420

catcgaaagg acagtagaaa aggaagatgg cttctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 480

aaaggctatc gttcaagaat gcctctaccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca 540

cgaggaacat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat 600

gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt 660

cctctatata aggaagttca tttcatttgg agaggacctc gagaaagagg atccacctga 720

ggcctccgtt ccatgggcta gaagcttctc ctcctctgct aacgtaagcc tctctgtttt 780

ttttctctgt ttcttttgaa atgaatccaa ttagtgatga taatctgtgt ttgatgtatc 840

attgatttaa catcttgaca atgaatcgtg atcggaagtg ataaagttat gggtcaacgg 900

tttcaaagag agagaaagac ttttagagtc aactctcgac tctttcttaa ttatgttatt 960

gctatttgtc tcttttcttg aagtctgaac aattcttggg attgttttgc aggttctagc 1020

ttctccaacc acaggaattc atcgcccggg actgggttat caacaagttt gtacaaaaaa 1080

gcaggctccg cggccgcccc cttcaccaga tcggctgagc caaggccatg gacgatggag 1140

ctgacctccc ctgccaactg ctcttctccc acccggagat gcctgacagc ttcgacgagt 1200

tcttcaacag cgccacgacg acctgcaccc acacgcacag ctgcaacccg cccggcccct 1260

cggtcgccat gcacacccgc acgtgcctgc acgcgcacac cctggtcctg ggcagcggcg 1320

gggaggacga cgacgacgcc agggaggact cggcgaagcc gcgcagaccg ctggggaaca 1380

gggaagctgt gcgcaagtac cgggagaaga agaaggcgca cgcggccttt ctggaagagg 1440

aggtcaagaa gctccgcgcc gccaaccagc agctccagag acggctgcag ggccatgcag 1500

ctttggaggc ggaggtggcg aggctccggg gtctcctgct cgatatccgg ggcaagatcg 1560

acgccgaggt cggcggcgtg ctcccttttc agaagccgtg cagtgtgggc tccgtggcgt 1620

gtgccgatcc tgctctgtgc ttcaacggca actcggaggt tggaggcggc tgggaggaga 1680

gctcaagacc ggcagccgcg gactgcagga tcgatgaagt gcgagggatg tcacgggaaa 1740

ttgatgtccc agaaggcttg cgtcattcca tggatgttgt tgcgagcttc gtgagttctg 1800

atcccctggc tgaatgagtc tgtctagagt ccgcaaaaat caccagtctc tctctacaaa 1860

tctatctctc tctatttttc tccagaataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta 1920

gggttcttat agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg 1980

tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtgacc 2040

Claims

1.一种蛋白质或其相关生物材料在如下任一中的应用：

D1）提高植物耐旱性；

D2）制备提高植物耐旱性的产品；

D3）提高植物耐碱性；

D4）制备提高植物耐碱性的产品；

D5）提高植物对ABA的敏感性；

D6）制备提高植物对ABA的敏感性的产品；

所述蛋白质为如下B1）或B2）：

B1）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

B2）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

所述生物材料为下述C1）至C12）中的任一种：

C1）编码所述的蛋白质的核酸分子；

C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；

C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体；

C4）含有C2）所述表达盒的重组载体；

C5）含有C1）所述核酸分子的重组微生物；

C6）含有C2）所述表达盒的重组微生物；

C7）含有C3）所述重组载体的重组微生物；

C8）含有C4）所述重组载体的重组微生物；

C9）含有C1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；

C10）含有C2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

C11）含有C3）所述重组载体的转基因植物细胞系；

C12）含有C4）所述重组载体的转基因植物细胞系；

植物为玉米或拟南芥。

2.一种蛋白质或其生物材料在植物育种中的应用；所述育种的目的为提高植物的耐碱性和/或耐旱性；

所述蛋白质为如下B1）或B2）：

B1）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

所述生物材料为下述C1）至C12）中的任一种：

C1）编码所述的蛋白质的核酸分子；

C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；

C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体；

C4）含有C2）所述表达盒的重组载体；

C5）含有C1）所述核酸分子的重组微生物；

C6）含有C2）所述表达盒的重组微生物；

C7）含有C3）所述重组载体的重组微生物；

C8）含有C4）所述重组载体的重组微生物；

C9）含有C1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；

C10）含有C2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

C11）含有C3）所述重组载体的转基因植物细胞系；

C12）含有C4）所述重组载体的转基因植物细胞系；

植物为玉米或拟南芥。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：C1）所述核酸分子为如下A1）或A2）：

A1）SEQ ID NO.1第619-1308位所示的DNA分子；

A2）编码序列为SEQ ID NO.1第619-1308位所示的DNA分子。

4.一种培育抗旱性和/耐碱性高的转基因植物的方法，其特征在于：所述方法包括提高目的植物中一种蛋白质的基因的表达量和/或所述蛋白质的含量和/或所述蛋白质的活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性高于所述目的植物；

所述蛋白质为如下B1）或B2）：

B1）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

植物为玉米或拟南芥。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中蛋白质的基因的表达量和/或所述蛋白质的含量和/或所述蛋白质的活性的方法为在目的植物中表达或过表达所述蛋白质。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述表达或过表达的方法为将所述蛋白质的编码基因导入目的植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列是SEQ IDNO.1第619-1308位。