CN104597139B - Hplc同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法。方法包括：（1）对照品溶液的制备；（2）供试品溶液的制备；（3）HPLC检测。本发明方法的操作简便、准确度高、专属性好、精密度较高、重现性良好，有利于保证裸花紫珠制剂的质量稳定和临床疗效。

Description

HPLC同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，特别涉及同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法。

背景技术

裸花紫珠制剂如裸花紫珠片、裸花紫珠栓、裸花紫珠分散片等，具有镇痛、消炎、解毒、收敛止血等功效，其药效是多种活性成分共同作用的结果，目前裸花紫珠制剂如裸花紫珠片的检测的方法主要为以分光光度法测定总黄酮含量，以高效液相法测定指标性成分如木犀草素、毛蕊花糖苷、连翘酯苷等。紫珠属化学成分研究表明苯乙醇苷类成分是该属植物的主要成分类群之一。申请人通过研究也发现连翘酯苷B、毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷是裸花紫珠片的主要成分。同时现代药理研究表明连翘酯苷B、毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷具有抗血栓、降血脂、抗氧化、抑制肝细胞毒性和调节非特异性免疫反应等多方面的作用。但目前还没有同时测定这三种成分的文献报道。《中成药》2011年3月收载的陈德金等《HPLC法测定裸花紫珠片中毛蕊花糖苷及连翘酯苷的含量》，其样品处理繁琐，且没有检测出主要成分异毛蕊花糖苷等问题。

发明内容

本发明的目的就是针对裸花紫珠制剂的检测现状，为有效地控制裸花紫珠制剂的内在质量，提供一种同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法，有利于对裸花紫珠制剂产品质量的有效控制及保证其临床疗效。

一种同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法，包括如下步骤：

（1）对照品溶液的制备：

分别称取连翘酯苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加25%～75%乙醇或甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；

（2）供试品溶液的制备：

裸花紫珠制剂供试品溶液的制备：取裸花紫珠制剂，置锥形瓶中，加25%～75%乙醇或甲醇，称重，超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；

（3）HPLC检测：

分别吸取步骤（1）和（2）所得的裸花紫珠对照品溶液和裸花紫珠制剂供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定；

其中，色谱条件为：色谱柱为C₁₈反相色谱柱；紫外检测器；柱温为30～35℃；检测波长为320～340nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1～0.5%磷酸溶液，流速为0.8～1.2ml/min；分析时间25分钟；等度洗脱，流动相A:流动相B＝18～20:82～80。

所述步骤（1）供试品溶液的制备优选为下述方法进行：

分别称取连翘酯苷对照品11.70mg、毛蕊花糖苷对照品23.15mg、异毛蕊花糖苷对照品26.75mg，置于容量瓶中，加25%～75%乙醇或甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

所述步骤（2）供试品溶液的制备优选为下述方法进行：

a、裸花紫珠制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂：取裸花紫珠制剂内容物，研细，称取0.1～3g，置锥形瓶中，加25%～75%乙醇或甲醇25～100ml，称重，超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；

b、裸花紫珠制剂为合剂、口服液：取裸花紫珠制剂混匀，精密量取5～10ml，置25～100ml容量瓶中，加25%～75%乙醇或甲醇20～90ml，超声处理30～90min，放冷，用同种溶剂稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液。

所述步骤（3）中的色谱柱优选柱长为250mm的C₁₈反相色谱柱。

所述步骤（3）中检测波长优选为327nm。

所述步骤（3）中流动相B优选为0.4%磷酸溶液。

所述步骤（3）中流速优选为1ml/min。

所述步骤（1）和（2）中乙醇或甲醇浓度优选为50%。

所述步骤（3）中流动相A:流动相B的体积比优选为18.2:81.8。

所述步骤（2）中超声处理时间优选为45分钟。

本发明所述裸花紫珠制剂为：片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、合剂、口服液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明方法的操作简便、准确度高、专属性好、精密度较高、重现性良好，有利于保证裸花紫珠制剂的质量稳定和临床疗效。

附图说明

图1为检测波长3D图；

图2为三种标准品的HPLC色谱图；

图3为裸花紫珠片HPLC色谱图；

图4为连翘酯苷B对照品标准曲线图；

图5为毛蕊花糖苷对照品标准曲线图；

图6为异毛蕊花糖苷对照品标准曲线图；

图7为连翘酯苷B检测限；

图8为毛蕊花糖苷检测限；

图9为异毛蕊花糖苷检测限；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例1同时测定裸花紫珠片中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的方法

1.1药品与试剂

对照品连翘酯苷B（批号：111811-201001，含量测定用，中国食品药品检定研究院）、毛蕊花糖苷（批号：111530-201208，含量测定用，中国食品药品检定研究院）、异毛蕊花糖苷（批号：Y-073-121023，含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司），裸花紫珠片：0.5g/片，批号分别为110930、110730、110280、110990、110590、110360、110510、110580、110840、111160，由海南九芝堂药业有限公司提供。乙腈为色谱纯（美国TEDIA公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2仪器

Agilent1200高效液相色谱仪；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市仪器有限公司）；Milli-Q纯水***（美国Millipore公司）；16K台式离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；ZORBAX SB C-18分析柱（4.6mm×250mm，5μm，美国Agilent公司）；BS110S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

2方法与结果

2.1波长筛选、流动相选择、提取方法与时间选择

采用SPD-M20A检测器对样品进行了全波长扫描（见图1），根据3D效果图，综合峰形、峰高、峰面积等因素，选择327nm为检测波长。

考察了不同比例的水-乙腈，乙腈-磷酸溶液等流动相对样品的洗脱效果，综合考虑图谱分离度、柱效、对称因子等结果，最后选择乙腈-0.4％磷酸为流动相。又根据样品的检测结果（见图2至图3），发现三种苯乙醇苷类成分色谱峰在检测25min之内全部出峰，从而确定检测时间为25min。

称取裸花紫珠片0.5g，分别用水，25%甲醇，50%甲醇，75%甲醇，甲醇，25%乙醇，50%乙醇，75%乙醇，无水乙醇超声提取。通过检测结果发现，50%乙醇为溶剂提取，三个指标性成分总体含量比较大，因此选择50%乙醇为提取溶剂。随后考察精密加入50%乙醇25ml，50ml，75ml，100ml超声提取的效果，结果表明，精密加入50%乙醇50ml已经能将化学成分提取完全。最后考察超声提取时间对提取效果的影响，分别采用15min，30min，45min，60min超声提取，结果显示随着提取时间增长，超声提取时间30min与45min指标性成分含量无明显增大，为确保提取完全，选择超声45min为最终超声提取时间。

通过对提取溶剂、方法、体积、时间考察，最终确定选择50%乙醇50ml超声提取45min为片剂提取方法。

表1提取溶剂结果比较表

表2提取体积结果比较表

表3提取方法与时间选择结果比较表

2.2色谱条件

通过考察检测器、流动相体系、色谱柱、柱温和流速等条件，经过反复优化，得到裸花紫珠指纹图谱的最佳色谱条件为：紫外检测器，流动相：乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)＝18.2:81.8，等度洗脱，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm)，柱温为30℃，流速为0.8mL/min，进样量为10μl，检测波长327nm，检测时间：25min。

2.3供试品溶液制备

取本品10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，称重，超声处理（功率100W，频率40KHz）45分钟，放冷，补重，取上清液，离心5min，0.22μm滤膜滤过，备用。

2.4对照品溶液制备

精密称取量连翘酯苷B11.70mg、毛蕊花糖苷23.15mg、异毛蕊花糖苷26.75mg对照品，用50%乙醇分别溶解于3个25mL的容量瓶中，超声处理使其充分溶解，并用50%乙醇定容制成储备液。

2.5线性关系考察

分别精密吸取连翘酯苷B（浓度为：0.468mg/ml）、毛蕊花糖苷（浓度为：0.926mg/ml）、异毛蕊花糖苷（浓度为：1.070mg/ml）各2，4，6，8，10μl，注入高效液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明：连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品分别在0.936～4.680μg，1.852～9.260μg，2.140～10.700μg范围内线性关系良好，回归方程分别为：Y=1490.6X+294.66，r=0.9991；Y=1592.7X+129.43，r=0.9999；Y=2721.6X+212.49，r=0.9999。结果见表4，图4至图6。

由表1可看出，该方法测得的各个成分线性良好。

表4对照品回归方程、相关系数、线性范围

2.6检测限与定量限考察

2.6.1检测限分别精密吸取浓度为0.05μg/ml的连翘酯苷B、浓度为0.05μg/ml的毛蕊花糖苷、浓度为0.11μg/ml的异毛蕊花糖苷对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定，信噪比约为3，故检测限分别为为0.5ng、0.5ng、1.1ng。结果见图7至图9。

2.6.2定量限分别精密吸取浓度为0.05μg/ml的连翘酯苷B、浓度为0.05μg/ml的毛蕊花糖苷、浓度为0.11μg/ml的异毛蕊花糖苷对照品溶液各30μl注入液相色谱仪，测定，信噪比约为10，故定量限分别为为1.5ng、1.5ng、3.3ng。连续测定6次，其峰面积积分值RSD分别为4.14%，4.10％，3.04％，结果见表5。

表5定量限试验结果表

2.7精密度、重现性与稳定性实验

取批号为110930裸花紫珠片供试品溶液于同1d内重复进样连续进样6次，计算连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷峰面积RSD%，考察仪器日内精密度。

取批号为110930样品，分别制备6份，进行测定，计算含量及其RSD%，考察方法的重现性。

分别在0，6，12，18，24h对同一供试品溶液进行测定，记录峰面积，计算出相对保留时间和相对峰面积RSD%，以考察样品的稳定性。

表6方法学考察结果

2.8加样回收试验

精密称取已知含量的110930供试品6份（连翘酯苷B含量为9.9mg/g，毛蕊花糖苷含量为3.28mg/g，异毛蕊花糖苷含量为5.96mg/g），分别精密加入一定量的翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对照品，照2.3项下制备回收率试验液，依法测定，计算回收率，结果见表7。

表7方法回收率试验结果（n=6）

2.9耐用性考察

采用拟定的方法，采用不同的液相色谱仪，使用2个不同的色谱柱对同一批样品（110730、110280、110930）进行测定，结果见表8与表9。结果表明，本方法耐用性良好。

表8仪器及色谱柱型号

表9耐用性试验结果表

2.10样品含量测定

累计10批样品中20个含量测定数据。结果见表10。

表10批样品含量测定结果表

10批样品中连翘酯苷B苷含量平均值为6.9mg/片，按8折计算为5.5mg/片；毛蕊花糖苷含量平均值为13.8mg/片，按8折计算为11.0mg/片；异毛蕊花糖苷含量平均值为23.1mg/片，按8折计算为18.5mg/片。暂定本品每片含连翘酯苷B以连翘酯苷B(C₃₄H₄₄O₁₉)计不得少于5.5mg；每片含毛蕊花糖苷以毛蕊花糖苷（C₂₉H₃₆O₁₅）计不得少于11.0mg；每片含异毛蕊花糖苷以异毛蕊花糖苷（C₂₉H₃₆O₁₅）计不得少于18.5mg。

实施例2同时测定裸花紫珠胶囊中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的方法

1.1药品与试剂

对照品连翘酯苷B（批号：111811-201001，含量测定用，中国食品药品检定研究院）、毛蕊花糖苷（批号：111530-201208，含量测定用，中国食品药品检定研究院）、异毛蕊花糖苷（批号：Y-073-121023，含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司）；裸花紫珠胶囊：0.4g/粒，批号分别为20080801、20081102、20090302，市售，江西杏林白马药业有限公司。乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2仪器

Agilent1200高效液相色谱仪；KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水***(美国Millipore公司)；16K台式离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)。ZORBAX SB C-18分析柱(4.6mm×250mm，5μm，美国Agilent公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

2方法与结果

2.1色谱条件

流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)＝18:82，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm)，柱温为32℃，流速为1.2mL/min，进样量为10μl，检测波长340nm，检测时间：25min。

2.2对照品溶液制备

分别精密称取量连翘酯苷B10.52mg、毛蕊花糖20.05mg、异毛蕊花糖苷22.11mg对照品，用25%甲醇溶解到3个25mL的容量瓶中，超声使其充分溶解，并用25%甲醇定容制成储备液。

2.3供试品溶液制备

取本品10粒，取内容物，精密称定，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇25mL，称重，超声处理（功率100W，频率40KHz）30分钟，放冷，补重，取上清液，离心5min，0.22μm滤膜滤过，备用。

2.4样品含量测定

3批样品含量测定数据。结果见表11。

表11三批样品含量测定结果表

实施例3同时测定裸花紫珠颗粒中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的方法

1.1药品与试剂

对照品连翘酯苷B（批号：111811-201001，含量测定用，中国食品药品检定研究院）、毛蕊花糖苷（批号：111530-201208，含量测定用，中国食品药品检定研究院）、异毛蕊花糖苷（批号：Y-073-121023，含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司）；裸花紫珠颗粒：3g/袋，批号分别为20110305、20110306、20110307，由海南九芝堂药业有限公司提供。乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2仪器

Agilent1200高效液相色谱仪；KQ 3200 DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水***(美国Millipore公司)；16K台式离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)。ZORBAX SB C-18分析柱(4.6mm×250mm，5μm，美国Agilent公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

2方法与结果

2.1色谱条件

流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)＝20:80，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm)，柱温为35℃，流速为1.0mL/min，进样量为10μl，检测波长320nm，检测时间：25min。

2.2对照品溶液制备

分别精密称取量连翘酯苷B9.85mg、毛蕊花糖18.66mg、异毛蕊花糖苷20.07mg对照品，用75%乙醇溶解到3个25mL的容量瓶中，超声使其充分溶解，并用75%乙醇定容制成储备液。

2.3供试品溶液制备

取本品10袋，取内容物，精密称定，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇100mL，称重，超声处理（功率100W，频率40KHz）90分钟，放冷，补重，取上清液，离心5min，0.22μm滤膜滤过，备用。

2.4样品含量测定

3批样品含量测定数据。结果见表12。

表12三批样品含量测定结果表

实施例4同时测定裸花紫珠合剂中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的方法

1.1药品与试剂

对照品连翘酯苷B（批号：111811-201001，含量测定用，中国食品药品检定研究院）、毛蕊花糖苷（批号：111530-201208，含量测定用，中国食品药品检定研究院）、异毛蕊花糖苷（批号：Y-073-121023，含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司）；裸花紫珠合剂：200ml/瓶，批号分别为20110812、20110813、20110814，由海南九芝堂药业有限公司提供。乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2仪器

Agilent1200高效液相色谱仪；KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水***(美国Millipore公司)；16K台式离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)。ZORBAX SB C-18分析柱(4.6mm×250mm，5μm，美国Agilent公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

2方法与结果

2.1色谱条件

流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)＝18.5:81.5，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm)，柱温为30℃，流速为0.8mL/min，进样量为10μl，检测波长327nm，检测时间：25min。

2.2对照品溶液制备

分别精密称取量连翘酯苷B8.75mg、毛蕊花糖19.22mg、异毛蕊花糖苷20.05mg对照品，用50%甲醇溶解到3个25mL的容量瓶中，超声使其充分溶解，并用50%甲醇定容制成储备液。

2.3供试品溶液制备

取本品3瓶，混匀，精密量取10ml，置50ml容量瓶中，加入50%甲醇40mL，超声处理（功率100W，频率40KHz）45分钟，放冷，补重，取上清液，离心5min，0.22μm滤膜滤过，备用。

2.4样品含量测定

3批样品含量测定数据。结果见表13。

表13三批样品含量测定结果表

Claims (10)

1.一种同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

分别称取连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加25％～75％乙醇或25％～75％甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

裸花紫珠制剂供试品溶液的制备：取裸花紫珠制剂，置锥形瓶或容量瓶中，加25％～75％乙醇或25％～75％甲醇，称重，超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；

(3)HPLC检测：

分别吸取步骤(1)和(2)所得的对照品溶液和裸花紫珠制剂供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定；

其中，色谱条件为：色谱柱为C₁₈反相色谱柱；紫外检测器；柱温为30～35℃；检测波长为320～340nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1～0.5％磷酸溶液，流速为0.8～1.2ml/min；分析时间25分钟；等度洗脱，流动相A:流动相B＝18～20:82～80。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)对照品溶液的制备按照下述方法进行：

分别称取连翘酯苷B对照品11.70mg、毛蕊花糖苷对照品23.15mg、异毛蕊花糖苷对照品26.75mg，置于容量瓶中，加25％～75％乙醇或25％～75％甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)供试品溶液的制备按照下述方法进行：

裸花紫珠制剂供试品溶液的制备：

a、裸花紫珠制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂：取裸花紫珠制剂内容物，研细，称取0.1～3g，置锥形瓶中，加25％～75％乙醇或25％～75％甲醇25～100ml，称重，超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；

b、裸花紫珠制剂为合剂、口服液：取裸花紫珠制剂混匀，精密量取5～10ml，置25～100ml容量瓶中，加25％～75％乙醇或25％～75％甲醇20～90ml，超声处理30～90min，放冷，用同种溶剂稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液。

4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的色谱柱是柱长为250mm的C₁₈反相色谱柱。

5.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中检测波长为327nm。

6.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流动相B为0.4％磷酸溶液。

7.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流速为0.8ml/min。

8.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中乙醇或甲醇浓度为50％。

9.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流动相A：流动相B＝18.2:81.8。

10.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中超声处理时间为45分钟。