CN104846062A - 一种基于snp标记的黄瓜品种鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于单核苷酸多态性标记的黄瓜品种鉴定的方法。该方法是利用焦磷酸测序技术对黄瓜的12个单核苷酸多态性标记进行分型分析，以达到对黄瓜品种进行真实性鉴定的结果。本发明的检测方法在5h之内即可完成黄瓜品种真实性鉴定工作，具有稳定、高通量、精准的等特点。
Description
技术领域
本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及黄瓜品种真实性鉴定的检测方法，是一种利用焦磷酸测序技术对黄瓜的12个SNP位点进行分型分析的方法。
背景技术
黄瓜是人民日常生活中十大蔬菜品种之一，因其独特的风味和口感深受广大消费者喜爱，产品销售时间长，品种种植地域广。我国黄瓜种业一直领先世界，特别是天津科润黄瓜研究所培育的“津优”、“津美”号等黄瓜品种是天津市支柱型种子品牌，远销30个省、市、自治区，已覆盖全国黄瓜露地栽培面积的60%以上，在市场占有率明显高于先正达等国际种子公司。
伴随着我国黄瓜种业的优势发展，市场上出现了一些套牌品种，以次充好，影响了种植户的产量和收入；甚至人非法盗取育种材料进行繁种，严重影响了我国育种单位的利益及我国黄瓜种业的健康发展，因此，亟需建立一种精准、高通量、高自动化的黄瓜种子品种鉴定和纯度检测技术体系，服务于种子执法单位的监管检测及育种单位种子质量内部控制，而其中，多态性强、密度高、遗传稳定的分子标记指纹图谱的构建及配套高通量、高自动化的检测模式是检测技术体系的关键。常规的标记技术如形态特征标记、同工酶标记、RAPD标记、SSR标记等技术具有标记密度不足、操作复杂、不能自动化分析差等缺点，不能满足市场的要求。
本专利立足我国黄瓜育种产业发展，结合生物信息学分析和分子生物学实验技术，筛选、确认黄瓜SNP位点，确定黄瓜品种鉴定核心SNP位点，建立精确、快速、高通量和高度自动化的基于SNP标记的黄瓜品种鉴定技术体系奠定基础，为保护我国黄瓜育种单位产权利益，维护我国黄瓜育种产业健康、快速发展提供技术支撑，对规范、监管种子市场、保护种植户的产量和收入具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种基于SNP标记的黄瓜品种真实性鉴定方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
用于黄瓜品种真实性鉴定的12个SNP位点，以及用于检测该12个位点的12套引物，其特征在于：
注：“Biotin-”代表该引物在5’端加上生物素标记修饰。
本发明所述基于SNP标记的黄瓜品种真实性鉴定方法，该方法以供试品种基因组DNA为模板，对已知SNP标记位点进行PCR扩增分析，结合应用焦磷酸测序技术对标志性核酸位点进行SNP分型分析，其包括如下步骤：
（1）采用12套PCR引物（-F和-R）及GoTaqMaster Mix，分别以供试品种和对照品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系为：总体积为50μL，其中： Master Mix 25μL，10μmol/L引物各1μL，DNA模板2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序为：95℃预变性10min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；
（2）应用焦磷酸测序特异性引物（-S），分别对供试品种和对照品种的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析：50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads，1300rpm涡旋混匀15min，经Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中，80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温；将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓，即可上机测序。
（3）测序时间8～10min，测序结束后使用“SNP”模式对12个黄瓜SNP位点进行分型分析，比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况，全部相同为同一品种，否则，为不同品种。
本发明所述的检测方法，其中的Binding Buffer47μL指的是：10mmol/L Tris-HCl，2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1%Tween20，pH7.6的溶液；Annealing Buffer38.8μL指的是：20mmol/L Tris-AC，2mmol/L MgAc2，pH7.6的溶液。
本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol/L的贮存液，工作浓度为10μmol/L。
本发明所述的检测方法，DNA模板指的是从黄瓜种子中提取的基因组DNA。
本发明所述的检测方法，焦磷酸测序全过程为：测序引物与PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育；四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比；ATP硫酸化酶在三磷酸腺苷双磷酸酶存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测，并由可见光信号峰表示。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理
本方法应用一种新型的核酸测序方法其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度， 达到实时测定DNA序列的目的。本发明的测序方法具有准确性高，重复性好，自动化程度高和操作简单等优点。
2、引物设计
本发明依据12个多态性较强的黄瓜SNP标记位点，设计12套特异性引物。引物由上海生物工程公司合成。
表1引物序列表如下：
3、反应条件
PCR扩增反应试剂需要GoTaqMaster Mix、PCR扩增引物及模板DNA。测序反应试剂需要PCR扩增产物、Sepharose Beads、Binding Buffer、测序引物及Annealing Buffer，需要有焦磷酸测序仪，测序时间8～10min。
材料与方法：
（1）试剂：Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
（2）扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×GoTaqMaster Mix25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
（3）测序反应体系：50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads，1300rpm涡旋混匀15min，经Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中，80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温；将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓，即可上机测序。
（4）测序时间8～10min，测序结束后使用“SNP”模式对12个黄瓜SNP位点进行分型分析，比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况，全部相同为同一品种，否则，为不同品种。
本发明用于黄瓜品种真实性的检测，具有以下优点：
(1)本发明的黄瓜品种真实性鉴定方法与常规的测定方法的对比，其操作简便、适于高通量操作。
(2)精准性：该发明是以焦磷酸测序技术为基础，具有很高的准确性。
(3)快速高效：5h之内即可完成黄瓜品种鉴定工作；
(4)结果判定简单：鉴定结果可以直接从可见光信号峰值读出。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。黄瓜种子模板DNA的提取：常规CTAB法提取（见附件）。
实施例1
（1）试剂：Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
（2）扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×GoTaqMaster Mix25μL，10μmol/L引物各1μL，对供试品种和对照品种DNA模板2μL(黄瓜种子DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
（3）测序反应体系：50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads，1300rpm涡旋混匀15min，经Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中，80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温；将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓，即可上机测序。
（4）测序时间8～10min，测序结束后使用“SNP”模式对供试品种和对照品种的12个黄瓜SNP位点进行分型分析，比较供试品种和对照品种在12个 SNP位点上的分型情况。结果见下表。
结果表明，供试品种与对照品种在12个SNP分型结果上相同，所以供试品种与对照品种为同一品种。
实施例2
（1）试剂：Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
（2）扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×GoTaqMaster Mix25μL，10μmol/L引物各1μL，供试品种和对照品种的模板DNA2μL(黄瓜种子DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
（3）测序反应体系：50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads，1300rpm涡旋混匀15min，经Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中，80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温；将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓，即可上机测序。
（4）测序时间8～10min，测序结束后使用“SNP”模式对供试品种和对照品种的12个黄瓜SNP位点进行分型分析，比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况。结果见下表。
结果表明，供试品种与对照品种在12个SNP分型结果上相同，所以供试品种与对照品种为同一品种。
实施例3
（1）试剂：Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
（2）扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×GoTaqMaster Mix25μL，10μmol/L引物各1μL，供试品种和对照品种的模板DNA2μL(黄瓜种子DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
（3）测序反应体系：50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads，1300rpm涡旋混匀15min，经Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ96测序反应板中，80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温；将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓，即可上机测序。
（4）测序时间8～10min，测序结束后使用“SNP”模式对供试品种和对照品种的12个黄瓜SNP位点进行分型分析，比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况。结果见下表。
结果表明，供试品种与对照品种在12个SNP分型结果上有6个位点相同，6个位点不同，因此供试品种与对照品种不是同一品种。
附件：常规CTAB法提取黄瓜种子DNA
(1)取黄瓜种子10粒，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止;
(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样（依试样不同，可适当增加缓冲液的用量），65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；
(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(4)加入1倍体积的氯仿：异戊醇（24：1），充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管。
(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。
(7)干燥DNA沉淀，加30μL水或TE缓冲液溶解DNA。
Claims (2)
1.用于黄瓜品种真实性鉴定的12个单核苷酸多态性位点，以及用于检测该12个位点的12套PCR-焦磷酸测序检测引物，其特征在于：
注：“Biotin-”代表该引物在5’端加上生物素标记修饰。
2.一种采用权利要求1所述的12套特异性引物，使用PCR-焦磷酸测序方法，鉴定黄瓜品种真实性的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）采用权利要求1中所述的12套引物中的PCR引物（-F和-R）及GoTaqMaster Mix，分别加入供试品种和对照品种的DNA模板进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系为：总体积为50μL，其中： 10μmol/L引物各1μL，DNA模板2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序为：95℃预变性10min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；
（2）采用权利要求1所述的焦磷酸测序特异性引物（-S），分别对供试品种和对照品种的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析：50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads，1300rpm涡旋混匀15min，经Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ96测序反应板中，80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温；将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓，即可上机测序。
（3）测序时间8～10min，测序结束后使用“SNP”模式对12个黄瓜SNP位点进行分型分析，比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况，全部相同为同一品种，否则，为不同品种。
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