CN104561247A - 一种可视化检测单核苷酸多态性的方法及其应用 - Google Patents

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黄璐琦
王树
袁媛
刘礼兵
蒋超
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Abstract

本发明公开了一种可视化的单核苷酸多态性多种基因型同时检测的方法。本发明提供了一种检测或辅助检测待测DNA中突变位点的方法，包括以下步骤：1)以待测DNA为模板进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物；2)用荧光物质标记步骤1)得到的环介导等温扩增产物，得到标记荧光物质的产物；3)将步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物反应，紫外灯下直接目测观察反应产物的颜色确定待测DNA中目标基因SNP位点的基因型。利用本方法对金银花trnL-trnF序列的625C>A位的SNP位点进行分型，实验证明，利用少量供试品材料即可检测中药原植物，中药材，及含有中药材生药原粉的中成药金银花真伪，经由颜色变化可同时检测金银花正品、伪品及两者的混杂品。

Description

一种可视化检测单核苷酸多态性的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种可视化的单核苷酸多态性位点不同基因型同时检测技术。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和***。SNP它是人类可遗传的变异中最常见的一种，在疾病易感性研究，药物基因组研究，临床耐药性研究，临床育种，食品及中药的分子检测方面具有重要的应用价值。
近年来，随着分子生物学的发展，通过分子标记尤其是DNA分子标记检测中药真伪越来越成为一种趋势。然而许多中药与其伪品药材亲缘关系非常近，DNA序列变异很小，甚至只有单核苷酸的差异，检测相对困难。并且现有的单核苷酸多态性检测手段无法满足中药鉴定简单、快速、易于操作的要求。
现有的单核苷酸多态性检测方法主要包括DNA测序技术，限制性酶切长度多态性分析，单链DNA构象多态性分析技术，变性高效液相色谱技术，寡核苷酸连接分析等，这些方法需要繁琐的分离或洗涤程序及反复的PCR循环，增加了检测时间。虽然均相检测能避免这一问题，但现有的均相检测手段均基于荧光偏振或小分子染料之间的荧光拉曼能量转移，检测灵敏度不高或需要对探针进行双标记，成本高昂。
经过市场调研及有关专家确认可作为中药材金银花的伪品有灰毡毛忍冬(Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.)、红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)、华南忍冬(LoniceraConfusa DC.)或黄褐毛忍冬(Lonicera fulvotomentosa HsuetS.C.Cheng)等(郝近大等，实用中药材经验鉴别(第2版)，2001年)，目前现有的技术中，中华人民共和国药典(2010版)主要采用性状鉴别和化学鉴别，通过金银花的外观形态或化学成分与标准样品进行比对鉴别金银花真伪。然而金银花和灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬外形特征非常相似，性状鉴别具有一定的主观性，要求鉴别者具有丰富的鉴别经验，如果外形不完整或者破碎后就很难鉴别。对于薄层鉴别，灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬均含有绿原酸，薄层鉴别无法把金银花和灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬区分开来。前期的研究表明金银花和其常见伪品之间在trnL-trnF625位上具有一个625C>A的单核苷酸多态性位点，可用于金银花真伪的检测(蒋超等，基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究，中国中药杂志，2012年)。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种灵敏的检测或辅助检测待测样品中单核苷酸多态性的方法，本发明的目的之二是提供一种检测金银花真伪品的方法。
本发明提供的方法包括以下步骤：
1)以待测DNA为模板进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物；
2)用荧光物质标记步骤1)得到的环介导等温扩增产物，得到标记荧光物质的产物；
3)将步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物反应，
紫外灯下直接目测观察反应产物的颜色确定待测DNA中目标基因SNP位点的基因型。在上述的方法中，步骤1)中所述环介导等温扩增引物组为能扩增所述待测DNA中目标基因的引物组；
步骤2)中所述用荧光物质标记步骤1)中得到的环介导等温扩增产物包括以下步骤：
向步骤1)中获得的环介导等温扩增产物中加入特异性延伸引物以及与对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP，进行单碱基延伸反应，得到标记荧光物质的产物；
所述特异性单碱基延伸引物与所述SNP位点相邻20-28bp的序列互补，且所述特异性延伸引物3’末端核苷酸位于所述SNP位点上游1bp处；
所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP与所述SNP位点的野生型基因型或突变型基因型互补；
每一个所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质的荧光颜色不同；
步骤3)，将所述步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物反应包括以下步骤：
将所述步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物混合均匀，得到反应产物；
在上述的步骤3)中，在365nm紫外光照射下观察反应产物的颜色确定待测DNA中目标基因的SNP位点的基因型的方法为：
若反应产物的颜色与荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质颜色相同，则所述待测DNA中目标基因含有或候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型；若反应产物的颜色与所加入dNTP或ddNTP的荧光物质颜色的混合色相同，则所述待测DNA中目标基因同时含有或同时候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型；若反应产物的颜色与所加入dNTP或ddNTP的荧光物质颜色的颜色或混合色不同，则所述待测DNA中目标基因不含有或不候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型；
上述的颜色也可能是相应的颜色，指所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP被上述PFP化合物吸附后产生的与所述荧光物质本色有区别的颜色。
检测实验结果可通过紫外灯照射，用眼睛观察96孔板中反应产物的颜色得知；检测实验结果也可通过将溶液颜色拍照，通过分析所照照片96孔板中反应产物对应的RGB值。
所检测的情况不限于碱基对的替换，也可以说碱基对的***/缺失。
所述荧光物质可以为荧光素，德克萨斯红或Cy3。
本发明提供的检测金银花真伪品的方法包括以下步骤：
在上述的步骤1)中，所述环介导等温扩增引物组由trnL-FIP，trnL-BIP，trnL-F3，trnL-B3组成，trnL-FIP引物序列为：5’-GGAGGATAAATAATTGGGGAGTCAATTTAGAAATCGTGAGGGTTCA-3’；trnL-BIP引物序列为5’-AGCGGTTCCAAATTCGTTATATTTCAAAACATTTCCGCTCAGATC-3’trnL-F3引物序列为5'-GTAAGAGGAAAATCCGTCGA-3’；trnL-B3引物序列为5’-TCACAAGACTTGTGATAAGAGA-3’；
在上述步骤2)中用于检测金银花真伪的SNP位点为625C>A，目标基因核苷酸序列为序列表5，其对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为荧光素标记的dUTP及Cy3标记的dGTP；所述特异性单碱基延伸引物trnL.SBE序列为：5’-AGTAAGGTGGATGAGAAATATAACGAATTT-3’。
在上述的步骤1)中所述环介导等温扩增温度为63℃；
步骤2)中所述单碱基延伸反应的退火温度为63℃；
在上述的在步骤1)和步骤2)反应之间，还包括如下步骤：将步骤1)得到的环介导等温扩增产物进行核酸外切酶I和碱性磷酸酶消化，得到消化产物；
在上述的在步骤2)和步骤3)反应之间，还包括如下步骤：将步骤1)得到的环介导等温扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物。
在往上述步骤3)加入PFP并混合均匀后，在365nm紫外灯下成像，若反应产物为红色，则待测DNA中含有或候选含有金银花药材；若反应产物为绿色，则含有或候选含有金银花伪品类药材；若反应产物为粉色或粉白色，则同时含有或同时候选含有金银花正品及伪品类药材。
所述待测DNA是金银花或其同属近缘物种山银花的基因组DNA；
所述待测DNA材料来源包括金银花或其同属近缘物种山银花的原植物，中药材或经过加工处理制成的含有金银花或其同属近缘物种山银花生药粉末的中成药。
以下的实施案例有助于更好的理解本发明，但不限定本发明。
附图说明
图1供试品金银花及其伪品625C>A位测序结果
图2应用PFP检测金银花及其伪品的颜色变化结果
具体实施方案：
下面结合附图和具体实施方案对本发明做进一步的详细说明：
1.材料和方法
1.1材料
实验中所用材料如表1所示，包括：
表115个忍冬EST-SSR引物对的序列
1.2实验仪器
台式高速离心机(Eppendorf公司)、7500基因扩增仪(ABI公司)、紫外灯箱
1.3方法
模板DNA的提取：选取无霉变的干燥供试品材料0.1g，置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0mL的Eppendorf管中，加入900μL已灭菌的CTAB提取液(2％CTAB，100mmol/LTris-Hcl pH=8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNacl)、0.02g PVP40000、10μLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900μL氯仿-异戊醇(24：1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(24：1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000×g离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量dd水溶解，-20℃。
环介导等温扩增：环介导等温扩增引物组由trnL-FIP，trnL-BIP，trnL-F3，trnL-B3组成，
trnL-FIP引物序列为：
5'-GGAGGATAAATAATTGGGGAGTCAATTTAGAAATCGTGAGGGTTCA-3’；
trnL-BIP引物序列为5’
-AGCGGTTCCAAATTCGTTATATTTCAAAACATTTCCGCTCAGATC-3’；
trnL-F3引物序列为5'-GTAAGAGGAAAATCCGTCGA-3’；
trnL-B3引物序列为5’-TCACAAGACTTGTGATAAGAGA-3’；
环介导等温扩增反应体系25μL含2.5tL10×ThermoPol缓冲液(NEB公司)，2μL0.25mmol/L dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，1.6μM trnL-FIP引物，1.6μM trnL-BIP引物，0.2μMtrnL-F3引物，0.2μMtrnL-B3引物，约10ng DNA模板。反应在ABI公司的7500型基因扩增仪上进行扩增，反应条件为63℃恒温孵育1h后80℃下10min灭活；反应结束后4℃保存，得到扩增产物。
核酸外切酶I和碱性磷酸酶消化：向环介导等温扩增产物加入5μL酶消化液(3μL10×碱性磷酸酶缓冲液，1U碱性磷酸酶(宝生物工程(大连)有限公司)，核酸外切酶I(宝生物工程(大连)有限公司))，于37℃恒温孵育1h后80℃下10min灭活，得到消化产物。
单碱基延伸：单碱基延伸反应的总体积为15μL，含1.5μL10×PCR缓冲液，2μL消化产物30pM荧光素标记的dUTP(珀金埃尔默公司)及30pM Cy3标记的dGTP(珀金埃尔默公司)，1U rTaq DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司))，单碱基延伸引物trnL.SBE(序列为：5’-AGTAAGGTGGATGAGAAATATAACGAATTT-3’)1.5μM。单碱基延伸反应在ABI公司的7500型基因扩增仪上进行扩增，反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃延伸30s，5个循环；反应结束后4℃保存，得到单碱基延伸产物。
检测：向消化产物中加入2μL酶消化液(1.5μL10×碱性磷酸酶缓冲液，0.5U碱性磷酸酶)，37℃恒温孵育20min后80℃下10min灭活。向酶处理的反应液中加入24μL PFP(15μM)，室温下旋涡振荡混合。打开紫外灯，365nn下观察96孔PCR板中的颜色变化。
2.结果
若反应产物为红色，则供试品中含有或候选含有金银花药材；若反应产物为绿色，则供试品含有或候选含有金银花伪品类药材；若反应产物为粉色或粉白色，则供试品同时含有或同时候选含有金银花正品及伪品类药材。

Claims (7)

1.一种检测或辅助检测待测DNA中单核苷酸多态性(SNP)的方法，包括以下步骤： 
1)以待测DNA为模板进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物； 
2)用荧光物质标记步骤1)得到的环介导等温扩增产物，得到标记荧光物质的产物； 
3)将步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物反应，紫外灯下直接目测观察反应产物的颜色确定待测DNA中目标基因SNP位点的基因型。 
2.如权利要求1所述的方法，其特征为： 
步骤1)中进行环介导等温扩增时使用的引物组为能扩增所述待测DNA中目标基因的引物组； 
步骤2)中所述用荧光物质标记步骤1)中得到的环介导等温扩增产物包括以下步骤： 
向步骤1)中获得的环介导等温扩增产物中加入特异性单碱基延伸引物以及与对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP，进行单碱基延伸反应，得到标记荧光物质的产物； 
所述特异性单碱基延伸引物与所述SNP位点相邻20-28bp的序列互补，且所述特异性单碱基延伸引物3’末端核苷酸位于所述SNP位点上游1bp处； 
所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP与所述SNP位点的野生型基因型或突变型基因型互补； 
每一个所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质的荧光颜色不同； 
步骤3)，将所述步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物反应包括以下步骤： 
将所述步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物混合均匀，得到反应产物； 
在365nm紫外光照射下观察反应产物的颜色确定待测DNA中目标基因的SNP位点的基因型；若反应产物的颜色与荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质颜色相同，则所述待测DNA中目标基因含有或候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型；若反应产物的颜色与所加入dNTP或ddNTP的荧光物质颜色的混合色相同，则所述待测DNA中目标基因同时含有或同时候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型；若反应产物的颜色与所加入dNTP或ddNTP的荧光物质颜色的颜色或混合色不同，则所述待测DNA中目标基因不含有或不候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型； 
所述荧光物质具体为荧光素，德克萨斯红或Cy3。 
3.如权利要求1或2所述的一种检测方法，其特征为： 
所述待测DNA是金银花或其同属近缘物种山银花的基因组DNA； 
其中环介导等温扩增引物组由trnL-FIP，trnL-BIP，trnL-F3，trnL-B3组成，trnL-FIP引物序列为序列表的核苷酸序列1：5’ -GGAGGATAAATAATTGGGGAGTCAATTTAGAAATCGTGAGGGTTCA-3’；trnL-BIP引物序列为序列表的核苷酸序列2：5’-AGCGGTTCCAAATTCGTTATATTTCAAAACATTTCCGCTCAGATC-3’；trnL-F3引物序列为序列表的核苷酸序列3：5’-GTAAGAGGAAAATCCGTCGA-3’；trnL-B3引物序列为序列表的核苷酸序列4：5’-TCACAAGACTTGTGATAAGAGA-3’； 
步骤2)中用于检测金银花真伪的SNP位点为625C/A，目标基因核苷酸序列为序列表的核苷酸序列5，其对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为荧光素标记的dUTP及Cy3标记的dGTP；所述特异性单碱基延伸引物trnL.SBE序列为序列表的核苷酸序6：5’-AGTAAGGTGGATGAGAAATATAACGAATTT-3’。 
4.如权利要求书1或2中任一所述方法，其特征为： 
步骤1)中所述环介导等温扩增温度为63℃； 
步骤2)中所述单碱基延伸反应的退火温度为63℃； 
在步骤1)和步骤2)反应之间，还包括如下步骤：将步骤1)得到的环介导等温扩增产物进行核酸外切酶I和碱性磷酸酶消化，得到消化产物； 
在步骤2)和步骤3)反应之间，还包括如下步骤：将步骤1)得到的环介导等温扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物。 
5.如权利要求书1或2中任一所述方法，其特征为： 
所述待测DNA是金银花或其同属近缘物种山银花的基因组DNA； 
所述待测DNA的材料来源包括金银花或其同属近缘物种山银花的原植物，中药材或经过加工处理制成的含有金银花或其同属近缘物种山银花生药粉末的中成药。 
6.一种检测金银花真伪的方法，包括以下步骤 
1)以金银花或其同属近缘物种山银花的基因组DNA为模板进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物；其中环介导等温扩增引物组由trnL-FIP，trnL-BIP，trnL-F3，trnL-B3组成，trnL-FIP引物序列为序列表的核苷酸序列1：5’-GGAGGATAAATAATTGGGGAGTCAATTTAGAAATCGTGAGGGTTCA-3’；trnL-BIP引物序列为序列表的核苷酸序列2：5’-AGCGGTTCCAAATTCGTTATATTTCAAAACATTTCCGCTCAGATC-3’；trnL-F3引物序列为序列表的核苷酸序列3：5’-GTAAGAGGAAAATCCGTCGA-3’；trnL-B3引物序列为序列表的核苷酸序列4：5’-TCACAAGACTTGTGATAAGAGA-3’； 
2)用荧光物质标记步骤1)得到的环介导等温扩增产物，得到标记荧光物质的产物； 
步骤2)中所述用荧光物质标记步骤1)中得到的环介导等温扩增产物包括以下步骤： 
向步骤1)中获得的环介导等温扩增产物中加入特异性单碱基延伸引物以及与对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP，进行单碱基延伸反应，得到标记荧光物质的产物； 
所述特异性单碱基延伸引物与所述SNP位点相邻20-28bp的序列互补，且所述特异性单碱基延伸引物3’末端核苷酸位于所述SNP位点上游1bp处； 
所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP与所述SNP位点的野生型基因型或突变型基因型互补； 
每一个所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质的荧光颜色不同； 
步骤3)，将所述步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物反应包括以下步骤： 
将所述步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物混合均匀，得到反应产物； 
在365nm紫外光照射下观察反应产物的颜色确定待测DNA中目标基因的SNP位点的基因型；若反应产物的颜色与荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质颜色相同，则所述待测DNA中目标基因含有或候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型；若反应产物的颜色与所加入dNTP或ddNTP的荧光物质颜色的混合色相同，则所述待测DNA中目标基因同时含有或同时候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型；若反应产物的颜色与所加入dNTP或ddNTP的荧光物质颜色的颜色或混合色不同，则所述待测DNA中目标基因不含有或不候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的基因型； 
3)将步骤2)得到的标记荧光物质的产物与阳离子水溶性聚芴衍生物(PFP)化合物反应，紫外灯下直接目测观察反应产物的颜色确定待测DNA中目标基因SNP位点的基因型。 
7.如权利要求6所述的检测金银花真伪的方法，其特征为：所述特异性单碱基延伸引物trnL.SBE序列为序列表的核苷酸序6：5’-AGTAAGGTGGATGAGAAATATAACGAATTT-3’。 
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