CN101928766A - 一种快速鉴定黄瓜杂交种种子纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴定黄瓜杂交种种子纯度的方法。该方法以温室黄瓜新品种“津优38”供试种子的基因组DNA为模板，通过对已知“津优38”亲本DNA差异性片段进行分析，结合应用焦磷酸测序技术对“津优38”杂交种种子的纯度进行鉴定。本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有简单易行、灵敏度高、快速、费用低、便于推广等特点，为种子纯度鉴定开辟了广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及黄瓜杂交品种种子纯度的鉴定方法，特别是一种利用焦磷酸测序技术对“津优38”的杂交种种子纯度快速鉴定方法。
背景技术
种子是重要的农业生产资料，其质量的优劣程度直接影响农产品质量和产量。种子纯度是保证优良品种增产潜力得以发挥的关键因素，在农业生产中如果种子纯度不高，会导致产品异质性增强，致使产品形状不整齐和收成减少，直接影响到农户的经济利益。发展快速准确的种子纯度鉴定技术不仅保护农户利益，也为种子生产单位销售种子争取时间，把握商机。种子在市场销售需要达到一定的纯度级别。常规的种子纯度鉴定技术耗时长、受环境条件、时间条件等因素影响严重，难以满足市场的需要。
当前常用的黄瓜种子纯度鉴定技术有形态学鉴定技术、同工酶鉴定技术和DNA分子标记(RAPD、AFLP、SSR等)鉴定技术，综合起来，主要存在以下不足：(1)标记技术的多态性不足：随着分子辅助育种技术的发展，黄瓜的育种速度大大提高。形态性状标记的查找需要丰富的经验和大量的时间，很难满足育种的需要；同工酶鉴定技术依靠黄瓜生长过程中的蛋白质表达的时空差异，检测目标为特别时间特别部位的某一特定同工酶，筛选难度大，且稳定性较差；RAPD和SSR基于PCR技术，灵敏度高，但由于黄瓜的遗传基础比较狭窄，两个标记技术多态性少已无法满足日益增长的育种速度。
(2)无法克服电泳技术瓶颈：同工酶鉴定技术和RAPD、SSR等分子标记鉴定技术都必须经过电泳、染色过程获得谱带信息，并通过谱带分析才能得到最终结果。电泳技术(包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳)虽已成熟，但是操作繁琐，需要做胶、灌胶、凝胶、点样等一系列过程，整个过程需要1-3个小时，耗时费力，而且单个电泳板单次点样数量有限，难以实现高通量操作；电泳后的谱带分析也费时、困难。电泳技术是种子纯度鉴定的技术瓶颈。(3)难以高通量操作：目前的种子纯度鉴定技术检测对象都是单粒种子，每批检测数量在100粒左右。资料显示，在纯度检测过程中，取150粒种子经检测都为F1代杂交种，纯度为98.2％。为提高纯度鉴定的精确度，就必须扩大取样量。形态学鉴定技术在田间试验小区进行，理论上可以无限扩大种子种植数量，但占地多，后续工作量大，实践中无法实施；同工酶鉴定技术和RAPD、SSR分子标记鉴定技术为定性检测技术，无法在单个反应中进行多样本检测；同时受电泳技术限制，难以实现高通量操作。
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是应用于DNA序列分析的新一代技术。在遗传分析中，可以提供核酸序列信息的分子检测技术是“黄金标准”，其权威性比其他DNA分析方法如Northern杂交，基因芯片和实时定量PCR(Taqman探针)技术更好。其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术用于测量短DNA链序列，是目前唯一能实时得到定量序列结果的技术，兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，具有准确性高，重复性好，自动化程度高，操作简单的特点，非常适合用于对蔬菜杂交品种种子纯度的鉴定。迄今为止，尚未有成功利用焦磷酸测序技术鉴定蔬菜杂交品种种子纯度的报道。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种黄瓜杂交种种子纯度快速鉴定方法为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
用于鉴定黄瓜杂交种种子纯度的PCR扩增及焦磷酸特异性引物，包括引物正向序列：5’-TAACTATCATTCTTTATCCCCATCAT-3’，反向引物序列：5’-Biotin-CATAGCCATACAAAAATGCACAT-3’，测序引物序列：5’-CTCAAGTTTTTTTCTTGTTT-3’。
本发明所述快速鉴定黄瓜杂交种种子纯度的方法，该方法以温室黄瓜新品“津优38”供试种子的基因组DNA为模板，对已知“津优38”亲本DNA差异性片段进行分析，结合应用焦磷酸测序技术对“津优38”杂交种种子纯度进行鉴定，其包括如下步骤：
(1)采用引物正向、反向序列的2条PCR特异引物及
MasterMixes，加入供试种子样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：Master Mixes 25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；
反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；
(2)采用测序特异性引物，对供试种子样品的PCR扩增产物进行焦磷酸测序；其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads 3μL，Binding Buffer47μL，10μmol/L测序引物1.2μL，Annealing Buffer 38.8μL；
(3)测序时间8～10min，测序结束后直接通过第一个测序碱基结果“T”的可见光信号峰值判定种子纯度情况：出现1倍“T”的可见光信号峰值时，该供试种子为杂交种；出现2倍“T”或无“T”的可见光信号峰值时，该供试种子为非杂交种。
本发明所述的鉴定方法，其中的Binding Buffer 47μL指的是：10mmol/L Tris-HCl，2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6的溶液；Annealing Buffer 38.8μL指的是：20mmol/L Tris-AC，2mmol/LMgAc2，pH7.6的溶液。
本发明所述的鉴定方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol/L的贮存液，工作浓度为10μmol/L。
本发明所述的检测方法，模板DNA指的是从待测样品提取的基因组DNA。
本发明优选“津优38”杂交种种子纯度的鉴定方法，其包括如下步骤：
(1)采用正向、反向序列2条PCR特异引物及
MasterMixeser，加入供试“津优38”杂交种DNA进行PCR扩增；
其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：Master Mixes 25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(2)采用测序特异性引物，对供试“津优38”杂交种PCR扩增产物进行焦磷酸测序。其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads 3μL，BindingBuffer 47μL(10mmol/L Tris-HCl，2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol/L测序引物1.2μL，Annealing Buffer 38.8μL(20mmol/L Tris-AC，2mmol/L MgAe2，pH7.6)。
测序全过程：测序引物与PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育；四种dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)之一被加入反应体系，如与模扳配对(A-T，C-G)，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。而且释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比；ATP硫酸化酶在三磷酸腺苷双磷酸酶存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测，并由可见光信号峰表示。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理
本方法应用一种新型的核酸测序方法其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。本发明的测序方法具有准确性高，重复性好，自动化程度高和操作简单等优点。
2、引物设计
本发明依据“津优38”亲本的差异性片段设计2条PCR扩增特异性引物和1条测序引物。引物由上海生物工程公司合成。
表1引物序列表如下：
| 引物名称 | 序列(5′to3′) |
| “津优38”正向引物 | TAACTATCATTCTTTATCCCCATCAT |
| “津优38”反向引物 | Biotin-CATAGCCATACAAAAATGCACAT |
| “津优38”测序引物 | CTCAAGTTTTTTTCTTGTTT |
3、反应条件
PCR扩增反应试剂需要
Master Mixes、PCR扩增引物及模板DNA。测序反应试剂需要PCR扩增产物、Sepharose Beads、Binding Buffer、测序引物及Annealing Buffer，需要有焦磷酸测序仪，测序时间8～10min。
材料与方法：
(1)试剂：Promega公司生产的
Master Mixes溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：
Master Mixes 25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads 3μL，Binding Buffer 47μL(10mmol/LTris-HCl，2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol/L测序引物1.2μL，Annealing Buffer 38.8μL(20mmol/L Tris-AC，2mmol/L MgAc2，pH7.6)；
(4)测序时间8～10min，测序结束后直接通过第一个测序碱基结果“T”的可见光信号峰值判定种子纯度情况：只有出现1倍“T”的可见光信号峰值时，该供试种子为杂交种；出现2倍“T”或无“T”的可见光信号峰值时，该供试种子为非杂交种。
本发明用于黄瓜杂交种种子纯度的鉴定方法，具有以下优点：
(1)本发明的黄瓜杂交种种子纯度快速鉴定方法与常规的测定方法的对比，其操作简便：程序化操作，不需特殊理论基础。
(2)精准性：该发明是以焦磷酸测序技术为基础，具有很高的准确性。
(3)快速高效：3h之内即可完成种子纯度鉴定工作；
(4)结果判定简单：鉴定结果可以直接从可见光信号峰值读出，当出现1倍“T”的可见光信号峰值时，该供试种子为杂交种；出现2倍“T”或无“T”的可见光信号峰值时，该供试种子为非杂交种。
附图说明：
图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为Marker、母本1、母本2、母本3、母本4、母本5、母本6、母本7、母本8。
图2为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为，父本1、父本2、父本3、父本4、父本5、父本6、父本7、父本8、Marker、杂交种1、杂交种2、杂交种3、杂交种4、杂交种5、杂交种6、杂交种7、杂交种8。
图3为父本扩增产物测序结果图。
图4为母本扩增产物测序结果图。
图5为杂交种扩增产物测序结果图。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。黄瓜模板DNA的提取：常规CTAB法提取(见附件)。
实施例1
(1)试剂：Promega公司生产的
Master Mixes溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：
Master Mixes 25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL(父本黄瓜DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads 3μL，Binding Buffer 47μL(10mmol/LTris-HCl，2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol/L测序引物1.2μL，Annealing Buffer 38.8μL(20mmol/L Tris-AC，2mmol/L MgAe2，pH7.6)；
(4)测序结果结束后，可以直接通过第一个测序碱基结果“T”的可见光信号峰值判定种子纯度情况。结果如图3所示，测序结果中的第一个碱基“T”为双倍可见光信号峰值，供试种子样品可判定为非杂交种。
实施例2
(1)试剂：Promega公司生产的
Master Mixes溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：
Master Mixes Buffer 25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL(母本黄瓜)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads 3μL，Binding Buffer 47μL(10mmol/LTris-HCl，2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol/L测序引物1.2μL，Annealing Buffer 38.8μL(20mmol/L Tris-AC，2mmol/L MgAe2，pH7.6)；
(4)测序结果结束后，可以直接通过第一个测序碱基结果“T”的可见光信号峰值判定种子纯度情况。结果如图4所示，测序结果中的第一个“T”未出现可见光信号峰值，供试种子样品可判定为非杂交种。
实施例3
(1)试剂：Promega公司生产的
Master Mixes溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：
Master Mixes Buffer 25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL(杂交种黄瓜DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads 3μL，Binding Buffer 47μL(10mmol/LTris-HCl，2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol/L测序引物1.2μL，Annealing Buffer 38.8μL(20mmol/L Tris-AC，2mmol/L MgAc2，pH7.6)；
(4)测序结果结束后，可以直接通过第一个测序碱基结果“T”的可见光信号峰值判定种子纯度情况。结果如图5所示，测序结果中的第一个“T”出现单倍可见光信号峰值，供试样品可判定为杂交种。
附件：常规CTAB法提取黄瓜DNA
(1)取黄瓜籽1粒，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止；
(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样(依试样不同，可适当增加缓冲液的用量)，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；
(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(4)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管。
(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。
(7)干燥DNA沉淀，加30μL水或TE缓冲液溶解DNA。
序列表
<110>天津市农业科学院中心实验室；天津科润黄瓜研究所
<120>一种快速鉴定黄瓜杂交种种子纯度的方法
<160>3
<210>1
<211>26bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
taactatcat tctttatccc catcat 26
<210>2
<211>23bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
Biotin-catagccata caaaaatgca cat 23
<210>3
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctcaagtttt tttcttgttt 20
Claims (3)
1.用于鉴定黄瓜杂交种种子纯度的PCR扩增及焦磷酸特异性引物，其特征在于，包括引物正向序列：5’-TAACTATCATTCTTTATCCCCATCAT-3’，反向引物序列：5’-Biotin-CATAGCCATACAAAAATGCACAT-3’，测序引物序列：5’-CTCAAGTTTTTTTCTTGTTT-3’。
2.一种采用权利要求1所述特异性引物，快速鉴定黄瓜杂交种种子纯度的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)采用权利要求1所述的2条PCR特异引物及
MasterMixes，加入供试种子样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：
Master Mixes 25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；
反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；
(2)采用权利要求1所述的测序特异性引物，对供试种子样品的PCR扩增产物进行焦磷酸测序；其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads 3μL，Binding Buffer 47μL，10μmol/L测序引物1.2μL，Annealing Buffer 38.8μL；
(3)测序时间8～10min，测序结束后直接通过第一个测序碱基结果“T”的可见光信号峰值判定种子纯度情况。
3.如权利要求2所述的鉴定方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol/L的贮存液，工作浓度为10μmol/L。
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| CN101928766B (zh) | 2012-09-05 |
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Granted publication date: 20120905 Termination date: 20130623 |