CN104830885A

CN104830885A - 一种癌蛋白的原核表达方法

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Publication number: CN104830885A
Application number: CN201510223318.0A
Authority: CN
Inventors: 赵勇山; 闻雪; 刘岩峰; 张景海
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明公开了一种癌蛋白的原核表达方法，包括如下步骤：在肝癌细胞HepG2中提取总RNA并逆转录成cDNA pool；设计特异性寡核苷酸引物；以所得cDNA pool为模版，利用设计的引物进行PCR扩增，然后通过酶切和酶连将MDM2部分基因克隆到pET28a(+)表达载体中，得到重组表达载体；将所得重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株中，构建含有重组表达载体的基因工程菌；将所得基因工程菌置于37℃下培养至OD₆₀₀≈0.6～0.8时，诱导重组MDM2基因在该基因工程菌中表达；离心收集菌体后，洗涤2次，离心，弃去上清，收集菌体。本发明极大的提高了基于MDM2蛋白的实验室研究方面的实验的效率，同时极大的降低了实验成本。

Description

一种癌蛋白的原核表达方法

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及一种癌蛋白的原核表达方法。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的重大高发疾病之一，并已成为我国居民的第一位死因，我国科学和技术发展规划纲要已将恶性肿瘤的基础和应用研究列为公共卫生与重要疾病防治的关键科学问题。因此，新颖抗肿瘤药物的研究不仅是临床肿瘤治疗和提高我国人民健康水平的迫使需要，而且对于我国医药产业和社会发展具有重要意义。研究发现，p53基因是与人类肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因，在DNA转录、细胞生长和增殖以及许多代谢过程中有重要作用，能够有效地对抗组织增生，促进细胞凋亡，具有维持基因组稳定、抑制或阻止细胞转化的功能.从而抑制肿瘤的发生。在p53基因下游众多调节因子中，mdm2基因是p53的关键负调节子，与p53之间保持着精细的平衡。mdm2基因是一种进化保守基因，其表达产物MDM2蛋白与p53多肽(p53基因表达产生)是一对相互拮抗的蛋白质，二者形成负反馈调节通路(Negative Feedback Loop)，共同调节细胞周期。该负反馈通路使得细胞内的p53与MDM2蛋白比率保持恒定，然而，在人肿瘤细胞中，MDM2蛋白会由于各种原因产生过量表达累积，MDM2一旦过量表达，p53和MDM2之间的负反馈调节就会失调。在一些肿瘤细胞中，由于外界压力造成的p53激活机制被认为不足以克服MDM2的负反馈转录激活区下游调节作用，从而导致不充分的生长停滞和凋亡作用。因此抑制MDM2蛋白和p53相互作用是当前国外肿瘤治疗研究中的一个热点，而在p53.MDM2结合抑制剂研究的过程中，体外表达MDM2蛋白与相关抑制剂相互作用成为一种较为有效的手段。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种癌蛋白的原核表达方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种癌蛋白的原核表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、在肝癌细胞HepG2中提取总RNA并逆转录成cDNA pool；

S2、设计特异性寡核苷酸引物，上游引物引入Nco I酶切位点，下游引物引入Xho I酶切位点，其序列分别为

上游引物：5’-3’CATGCCATGGAGACCCTGGTTAG；

下游引物：5’-3’CCGCTCGAGTACTACCAAGTTCCTG；

S3、以步骤S1中所得的cDNA为模版，利用步骤S2中设计的引物进行PGR扩增，然后通过酶切和酶连将MDM2部分基因克隆到pET28a(+)表达载体中，得到重组表达载体；

S4、将步骤S3所得重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(入DE3)中，构建含有重组表达载体的基因工程菌；

S5、将步骤S4所得基因工程菌置于37℃下培养至OD₆₀₀≈0.6～0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM，诱导时间为4小时，诱导重组MDM2基因在该基因工程菌中表达；

S6、将步骤S5所得的菌体3500r/min，4℃离心20分钟离心收集菌体，将收集到的菌体用40mL生理盐水洗涤2次后，3500r/min、4℃离心20分钟，弃去上清，收集菌体；

S7、将步骤S6所得的菌体用40mL缓冲液A(0.02M PBS+0.5M NaGl，pH8.0)重悬后，利用超声破碎法破碎，12000×g、4℃离心20min，去上清，收集沉淀；沉淀用40mL的缓冲液B(0.02M PBS+0.5M NaCl+2M尿素，pH8.0)溶解，进行超声破碎，12000×g、4℃离心20min，并重复一次，收集沉淀；将得到的沉淀用缓冲液C(0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，pH8.0)溶解过夜，12000×g、4℃离心20min，取上清；

S7、利用镍柱亲和层析法纯化包涵体蛋白；

(1)以缓冲液C平衡Ni Sepharose Fast Flowc层析柱；

(2)将步骤S36中的上清以0.8mL/min流速上样至色谱柱，然后用起始缓冲液C洗涤不能吸附于柱上的杂蛋白；

(3)去除非特异性吸附物质。采用Buffer D(0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，pH6.0)和Buffer E(0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，pH5.0)阶段洗脱，洗涤脂蛋白、非特异性吸附组分；

(4)目的蛋白洗脱：用Buffer F(0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，Ph4.0)洗脱目的蛋白；

(5)色谱柱的再生与保护：以Buffer F(0.05M EDTA)对色谱柱进行洗脱，除去色谱柱所螯合的Ni2+以及与Ni2+牢固结合的蛋白，然后用蒸馏水在位清洗除去EDTA，最后用20％的乙醇保护色谱柱；

S8、利用透析法体外复性包涵体蛋白，透析后进行超滤浓缩。

采用透析法进行MDM2包涵体的复性，透析外液分别为A(0.02M PBS4.0+0.5M NaCl+4M尿素，pH 4.0)、B(0.02M PBS+0.5M NaCl+2M尿素，pH 4.0)、C(0.02M PBS+0.5M NaCl+1M尿素，pH 4.0)、D(0.02M PBS+0.5M NaCl+OM尿素，pH 4.0)，每次透析时间为4小时；将透析复性后的MDM2蛋白溶液通过超滤(采用截留分子量为3kDa的超滤浓缩离心管Merck Millipore)除盐，5000×g、4℃离心浓缩至3mL备用。

优选的，所述步骤S7中超声破碎的条件为：80％振幅，运行4秒、间歇16秒，25次。

本发明具有以下有益效果：

极大的提高了基于MDM2蛋白的实验室研究方面的实验的效率，同时极大的降低了实验成本。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

实施例

S1、MDM2的部分序列的基因获取

采用RT-PCR方法获取MDM2基因，依据MDM2的成熟蛋白氨基酸序列，设计特异性寡核苷酸引物，以肝癌细胞HepG2总RNA逆转录所得cDNA pool为模版获取MDM2基因。该序列首先被克隆到pET28a(+)表达载体多克隆位点区的Nco I(296)和Xho I(159)位点，利用载体的T7启动子启动基因的表达，起始密码子ATG位于载体294位，其下游有一载体自带的6组氨酸纯化位点(具体可参见Novagen公司的质粒图谱)。组氨酸能提供配位电子和一些金属离子如Ni²⁺鳌合，6个组氨酸能使蛋白吸附于含金属如Ni²⁺的层析填料上，因此可以利用金属鳌合层析来纯化目的蛋白。

S2、MDM2基因工程菌的构建

用于构建的宿主菌DH5a和BL21(入DE3)均购于上海生工生物工程技术服务有限公司，质粒pET-28a由本实验室保存，Nco I和xho I酶购于宝生物工程(大连)有限公司。

MDM2基因***pET28a(+)质粒：将PCR扩增的MDM2基因片段用Nco I、XhoI双酶切后通过T4DNA连接酶连接到同样经酶切的pET28a(+)表达载体上，于16℃孵育过夜，构建pET28a(+)-MDM2重组表达载体，热转化大肠杆菌克隆菌株DH5a，涂布于含有卡那霉素(Kanamycin，50μg/mL)的固体LB培养基上37℃倒置过夜培养筛选重组子，采用菌落PCR方法鉴定含重组质粒的细菌菌落，测序验证其序列正确性。

将上述鉴定正确的pET28a(+)-MDM2重组表达载体从克隆菌DH5a中提取出来，转化大肠杆菌表达菌株BL21(λDE3)感受态，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上37℃培养筛选重组子，此时获得重组子为MDM2基因工程菌。

S3、MDM2基因工程菌的诱导表达及包涵体分离纯化

S31、挑取单克隆基因工程菌落接种于50MI LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养12h；

S32、将上述菌液种于3L液体LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养至OD600≈0.6～0.8时(约4h)，加入终浓度为0.2mM的IPTG，37℃诱导4小时；

S33、离心(4℃，3500rpm，20min)，收集菌体，菌体用40mL生理盐水洗涤2次，3500r/min、4℃离心20分钟，弃去上清于-20℃冻存备用；

S34、菌体用40mL缓冲液A(0.02M PBS+0.5M NaCl，pH8.0)溶解，进行超声破碎(80％振幅，运行4秒、间歇16秒，25次)，12000×g、4℃离心20min，收集沉淀；

S35、沉淀用40mL缓冲液B(0.02M PBS+0.5M NaCl+2M尿素，pH8.0)溶解，进行超声破碎(80％振幅，运行4秒、间歇16秒，25次)，12000×g、4℃离心20min，收集沉淀，重复一次

S36、沉淀用缓冲液C(0.02M PBS+0.5M NaCl+8M尿素，pH8.0)溶解，过夜，12000×g、4℃离心20min收集上清；

S37、利用镍柱亲和层析法纯化包涵体蛋白

(1)以缓冲液C平衡Ni Sepharose Fast Flowc层析柱；

(2)将步骤S36中的上清以0.8mL/min流速上样至色谱柱、，然后用起始缓冲液C洗涤不能吸附于柱上的杂蛋白；

(5)色谱柱的再生与保护：以Buffer F(0.05M EDTA)对色谱柱进行洗脱，除去色谱柱所螯合的Ni²⁺以及与Ni²⁺牢固结合的蛋白，然后用蒸馏水在位清洗除去EDTA，最后用20％的乙醇保护色谱柱；

(6)电泳分析：用12.5％SDS-PAGE对色谱结果进行分析，纯度达到90％以上。

S4、MDM2包涵体蛋白的复性及超滤

S41、采用透析法进行MDM2包涵体的复性，透析外液分别为A(0.02M PBS4.0+0.5M NaCl+4M尿素，pH 4.0)、B(0.02M PBS+0.5M NaCl+2M尿素，pH 4.0)、C(0.02M PBS+0.5M NaCl+1M尿素，pH 4.0)、D(0.02M PBS+0.5M NaCl+OM尿素，pH 4.0)，每次透析时间为4小时；

S42、将透析复性后的MDM2蛋白溶液通过超滤(采用截留分子量为3kDa的超滤浓缩离心管Merck Millipore)除盐，5000×g、4℃离心浓缩至3mL备用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种癌蛋白的原核表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、在肝癌细胞HepG2中提取总RNA并逆转录成cDNA pool；

上游引物：5’-3’CATGCCATGGAGACCCTGGTTAG；

下游引物：5’-3’CCGCTCGAGTACTACCAAGTTCCTG；

S3、以步骤S1中所得的cDNA为模版，利用步骤S2中设计的引物进行PCR扩增，然后通过酶切和酶连将MDM2部分基因克隆到pET28a(+)表达载体中，得到重组表达载体；

S7、将步骤S6所得的菌体用40mL缓冲液A重悬后，利用超声破碎法破碎，12 000×g、4℃离心20min，去上清，收集沉淀；将沉淀用40mL的缓冲液B溶解，进行超声破碎，12 000×g、4℃离心20min，并重复一次，收集沉淀；将得到的沉淀用缓冲液C溶解过夜，12 000×g、4℃离心20min，取上清；

S7、利用镍柱亲和层析法纯化包涵体蛋白；

2.根据权利要求1所述的一种癌蛋白的原核表达方法，其特征在于，所述步骤S7中超声破碎的条件为：80％振幅，运行4秒、间歇16秒，25次。

3.根据权利要求1所述的一种癌蛋白的原核表达方法，其特征在于，所述S7中缓冲液A由0.02M PBS、0.5M NaCl组成，pH为8.0。

4.根据权利要求1所述的一种癌蛋白的原核表达方法，其特征在于，所述S7中缓冲液B由0.02M PBS、0.5M NaCl、2M尿素组成，pH为8.0。

5.根据权利要求1所述的一种癌蛋白的原核表达方法，其特征在于，所述S7中缓冲液C由0.02M PBS、0.5M NaCl、8M尿素组成，pH为8.0。