CN101831441B - 一种表达重组Cry1C基因的大肠杆菌工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组CrylC基因、含有该基因序列的表达载体，以及能够高效表达重组CrylC基因的大肠杆菌工程菌；另外，本发明还提供了所述大肠杆菌工程菌的诱导培养方法，以及由所述大肠杆菌工程菌表达的CrylC重组蛋白的纯化方法。本发明通过PCR方法，将CrylC基因的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，使其能够由大肠杆菌高效表达；本发明采用金属Ni²⁺螯合亲和层析来纯化融合蛋白，极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，纯度高达95％以上，且纯化效率高、成本低，适合大规模制备。

Description

一种表达重组Cry1C基因的大肠杆菌工程菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种高效表达重组Cry1C基因的大肠杆菌工程菌、其构建方法及诱导培养方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性的产孢细菌，该菌体能分泌一种特殊的抗虫晶体蛋白——δ-内毒素，δ-内毒素是目前主要的生物农药之一。苏云金芽孢杆菌的内毒素按氨基酸序列相似性被分为两类，即Cry和Cytδ-内毒素。其中，Cry毒素对多种有害昆虫幼虫具有毒性如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，膜翅目，同翅目，直翅目，食毛目，线虫类，螨类和原生动物等。此类毒素已经在商业化农业，森林管理和蚊虫控制中作为化学合成农药的替代品被广泛应用。Cry毒素还能被转入转基因植物中，从而使植物具有抗虫特性。

自从Schnepf在1981年从HD21Dipel中克隆出第一个Cry基因以来，已有433种晶体蛋白基因被克隆。这些基因按照它们的氨基酸序列可以被分为49种，93个亚种，147类，328小类。其中，Cry1A类蛋白基因是目前世界上应用于转基因植物最为广泛的δ-内毒素基因类型，从而使作物产生抗虫特性。

但是，由于Cry1A类毒素的广泛使用，致使有些有害昆虫幼虫逐渐对其产生抗性。而Cry1C毒素能有效的抵抗鳞翅目害虫，可作为Cry1A毒素的替代物或与Cry1A毒素融合表达得到进一步的抗虫蛋白。

为了解决Cry1C蛋白无法在大肠杆菌中表达的问题，本发明通过设计PCR引物，对Cry1C基因5’端的前86个密码子进行修改，从而使其在大肠杆菌中高效表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在大肠杆菌中高效表达的重组Cry1C基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有所述重组Cry1C基因的表达载体。

本发明的目的还在于提供能够高效表达重组Cry1C基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法。

本发明的再一目的在于提供所述大肠杆菌工程菌的诱导培养方法。

本发明的目的还在于提供由所述大肠杆菌工程菌表达的Cry1C蛋白的纯化方法。

为了实现本发明的目的，使Cry1C蛋白在大肠杆菌中能够稳定高效表达，本发明人通过设计PCR引物，对来源于转基因大米T1C-19的Cry1C基因(其具有如Seq ID No：1所示的核苷酸序列)的前86个密码子进行修改，将其中的稀有密码子替换为大肠杆菌偏爱密码子(如图1所示)，得到重组Cry1C基因，即Cry1C-rcp基因，其具有如Seq ID No：2所示的核苷酸序列。

所述PCR引物包括上游引物5’-TGGAGGAGAACAATCAGAACCAGTGTATCCCGTACAATTGTCTGAGCAATCCGGAAGAAGTTCTGCTGGATGGCGAACGCATCTC-3’和下游引物5’-TCATCACTTTTGTGCGCGTTCAAGGTCAGATTCTGC-3’。由于密码子的简并性，修改后的Cry1C-rcp基因序列能够与原序列表达同样的蛋白。

含有上述修改后的Cry1C基因序列的表达载体，其出发载体为PET-28a(+)。

为了获得构建原核表达载体质粒，本发明将上述修改密码子后的Cry1C-rcp基因序列，用PCR方法在5’端加上GGATCC以构成BamHI酶切位点，3’端加上CATATG以构成Nde I酶切位点，然后经BamHI及Nde I消化后，即可直接克隆至PET-28a(+)质粒，得到PET-28a(+)-Cry1C-rcp质粒，用于该基因的大量复制及表达。

本发明选择使用PET-28a(+)表达载体，这是因为pET***是有史以来在大肠杆菌(E.coli)中克隆表达重组蛋白功能最强大的***。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。此外PET-28a(+)设计了6个组氨酸的纯化位点，组氨酸能够提供配位电子与某些金属离子(如Ni²⁺)螯合，6个连续的组氨酸可以使蛋白有效吸附于含Ni²⁺的层析填料上，因而可以利用金属螯合层析来纯化融合蛋白，从而极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，非常适合大规模制备。

本发明将上述PET-28a(+)-Cry1C-rcp原核表达载体转入大肠杆菌，然后进行重组克隆的筛选，从而获得大肠杆菌工程菌，其出发菌株优选为BL21(DE3)。

所述大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)用PCR方法修改Cry1C基因序列的前86个密码子，获得Cry1C-rcp基因；然后在5’端加上GGATCC构成BamH I酶切位点，在3’端加上CATATG构成Nde I酶切位点；

2)将上述修改后的Cry1C基因***到质粒载体中；

3)然后将载体转入大肠杆菌，进行重组克隆筛选，获得大肠杆菌工程菌。

为了获得Cry1C重组蛋白的高效表达，所述工程菌在如下条件下诱导培养，工程菌于37℃温度下培养至对数生长期，按3％～5％(体积百分数)接种于LB培养基，当OD₆₀₀＝0.6～1.0时，加入IPTG至终浓度为0.01～2mmol/L，在温度15～37℃、200rpm的条件下诱导培养1～6h，离心获得菌体，每200mL培养物能获得3g菌体。

优选的诱导培养条件为：加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，在温度37℃、200rpm的条件下诱导培养4h，离心获得菌体，蛋白表达量达到52.9％(g Cry1C蛋白/g包涵体总蛋白)。

本发明的诱导培养条件中，IPTG的终浓度对目的蛋白表达量影响不大，在IPTG低浓度(0.05mmol/L)诱导条件下，目的蛋白已经有大量表达，随着IPTG浓度的增加，蛋白表达量增加不明显(如图3所示)；目的蛋白的诱导表达量随着诱导时间的增加而增加，当诱导时间达到4h后目的蛋白的表达量趋于稳定(如图5所示)；诱导温度对目的蛋白的诱导表达量也有一定影响，本发明研究了在较低温度(15℃、20℃)及较高温度(30℃、37℃)下目的蛋白在菌体裂解液上清和包涵体中的表达情况，当诱导温度为15℃或20℃时，Cry1C目的蛋白有可溶形式表达；诱导温度为30℃或37℃时，目的蛋白几乎均以包涵体的形式存在；从蛋白表达的总量上来讲37℃时得到的目的蛋白是最多的(如图4所示)。

为了分离纯化Cry1C重组蛋白，本发明还提供了由上述工程菌所表达的Cry1C重组蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

1)提取并溶解含有Cry1C重组蛋白的包涵体；

2)然后用His TrapTM FF凝胶柱进行亲和层析；

3)梯度透析，复性Cry1C重组蛋白。

具体地说，本发明中Cry1C的纯化方法包括如下步骤：

1)在菌体中加入裂解液及溶菌酶，超声破碎，提取并溶解含有Cry1C重组蛋白的包涵体；用洗涤液超声洗涤2次，然后用尿素洗涤液超声洗涤1次，得到包涵体蛋白；

所述裂解液含有50mmol/L Tris-Cl、10mmol/L EDTA、100mmol/LNaCl、调pH至8.0；所述洗涤液含有50mmol/L Tris-Cl、10mmol/LEDTA、100mmol/L NaCl、0.5％(体积)Triton及10mmol/L β-巯基乙醇，调pH至8.0；所述尿素洗涤液含有100mmol/L Tris-Cl及1mol/L尿素，调pH至8.0。

2)然后将上述包涵体蛋白溶于结合缓冲液，与His TrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；

所述结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素、调pH至8.0；所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素、调pH至8.0；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素、调pH至8.0；

3)然后用尿素缓冲液对上述目的蛋白进行梯度透析，每种浓度的尿素缓冲液均在8h内透析3次，复性Cry1C重组蛋白；

所述尿素缓冲液的pH＝8.0，其成分为50mmol/L Tris-Cl及尿素，所述尿素的浓度依次为8、6、4、2、1、0.5、0mol/L。

本发明的纯化方法，通过使用洗涤缓冲液洗涤细胞碎片杂质，能使Cry1C重组蛋白纯度达到86.7％。另外，通常使用的亲和层析具有特异性高，纯化效率高，产物纯度高等优点，但价格昂贵、成本较高；本发明采用金属Ni²⁺螯合亲和层析，其利用表达的融合蛋白上6个组氨酸所提供的配位电子与Ni²⁺螯合，6个连续的组氨酸序列可以使重组蛋白很好地吸附于含金属Ni²⁺的层析填料上，从而利用金属螯合层析来纯化融合蛋白，极大的简化了重组蛋白的下游纯化工作，纯度达95％以上，且纯化效率高，成本低，非常适合大规模制备。

由于尿素能够使包涵体蛋白变性、可溶，而在短时间内大幅降低尿素浓度会使包涵体蛋白出现大量沉淀，因此使用尿素缓冲液梯度透析，可以使Cry1C重组蛋白慢慢回复天然结构及活性(如图6所示)。

本发明克服了Cry1C蛋白在大肠杆菌中无法表达的技术难题，经研究表明，靠近5’端的密码子对蛋白表达具有决定性影响，因此本发明人通过修改5’端的密码子，使得Cry1C蛋白在大肠杆菌中高效表达。与此相对，本发明人尝试使用了常规表达方法，但是未见外源蛋白表达；另外还应用了BL21(DE3)-CodonPlus进行表达，但是表达情况并无明显改善。但是如果用GST标签克隆表达载体便能表达出大量蛋白。这可能是由于GST标签载体的标签较大，这也从另一方面证实了靠近5’端的密码子对Cry1C蛋白表达具有决定性影响的观点。

本发明通过设计PCR引物，对Cry1C基因5’端的前86个密码子进行了修改，将其中的稀有密码子替换为大肠杆菌偏爱密码子，从而使其在大肠杆菌中高效表达。本发明由大肠杆菌工程菌表达的Cry1C蛋白与水稻中的Cry1C蛋白具有相同的免疫原性(图7)。

本发明的优点在于：

1、本发明通过PCR方法修改Cry1C基因，用大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，使得在表达同样蛋白的同时，能够由大肠杆菌高效表达，其蛋白表达量达52.9％(g CryC蛋白/g包涵体总蛋白)；而使用常规表达方法则未见外源蛋白表达；用BL21(DE3)-CodonPlus进行表达，也没有明显改善。

2、使用PET-28a(+)作为表达载体，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制，表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上，能够实现Cry1C基因的高效表达。

3、本发明利用表达的融合蛋白上6个组氨酸能提供配位电子与某些金属离子螯合的特点，采用金属Ni²⁺螯合亲和层析来纯化融合蛋白，极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，纯度高达95％以上，且纯化效率高、成本低，适合大规模制备。

附图说明

图1为本发明对Cry1C基因的前86个密码子进行替换的示意图，上排为原Cry1C核苷酸序列、下排为修改后的Cry1C核苷酸序列。

图2为本发明的PCR方法修改基因序列、重组质粒的酶切鉴定电泳图，其中，M为DL2000Marker；A1～A3分别为修改后引物PCR产物、阳性对照、阴性对照；B1～B2分别为重组质粒双酶切产物、目的基因PCR产物对照。

图3为本发明不同浓度IPTG对Cry1C重组蛋白表达影响的SDS-PAGE分析，其中，M为低分子量标准蛋白；1为空载表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)包涵体总蛋白；2～8依次为IPTG浓度0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mmol/L的重组表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)/Cry1C诱导表达包涵体总蛋白。

图4为本发明不同诱导温度对Cry1C重组蛋白表达影响的SDS-PAGE分析，其中，M为低分子量标准蛋白；1为空载表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)诱导后包涵体总蛋白；2～5依次为诱导温度15、20、30、37℃下重组表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)/Cry1C诱导表达包涵体总蛋白。

图5为本发明不同诱导时间对Cry1C重组蛋白表达影响的SDS-PAGE分析，其中，M为低分子量标准蛋白；1为空载表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)包涵体总蛋白；2～7依次为诱导时间1、2、3、4、5、6h的重组表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)/Cry1C诱导表达包涵体总蛋白。

图6为本发明Cry1C蛋白纯化复性电泳图，其中，M为低分子量标准蛋白；1为透析复性后Cry1C蛋白；2为His TrapTM FF凝胶柱纯化后Cry1C蛋白；3为洗涤后的包涵体蛋白；4为未处理包涵体蛋白。

图7为水稻Cry1C蛋白与本发明原核表达Cry1C蛋白的WesternBlot

其中：M：低分子量标准蛋白；1：水稻Cry1C蛋白；2：本发明原核表达Cry1C蛋白。

图8为本发明Cry1C蛋白的HPLC-MS/MS图谱。

具体实施方式

实施例1

1、用PCR方法修改Cry1C基因

用修改后的上游引物5’-TGGAGGAGAACAATCAGAACCAGTGTATCCCGTACAATTGTCTGAGCAATCCGGAAGAAGTTCTGCTGGATGGCGAACGCATCTC-3’及下游引物5’-TCATCACTTTTGTGCGCGTTCAAGGTCAGATTCTGC-3’；从转基因大米T1C-19基因组中扩增并修改Cry1C基因(转基因大米T1C-19由华中农业大学张启发院士实验室提供)，5’端的稀有密码子被替换(如图1所示)。用1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带后通过T4DNA连接酶于4℃连接过夜至pGEM-T载体，然后转化至大肠杆菌DH5α；转化株先经过蓝白斑筛选，然后再用PCR扩增(扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸10min)及测序鉴定，修改后的基因命名为Cry1C-rcp基因。

2、构建表达载体

通过带有酶切位点的上游引物5’GCGGATCCTCATCACTTTTGTGCGC-3’(下划线部分为BamH I酶切位点)和下游引物5’-GGAATTCCATATGGAGGAGAACAATCAGAACC-3’(下划线部分为Nde I酶切位点)，用PCR方法扩增Cry1C-rcp基因，PCR产物经BamH I和Nde I消化后***pET-28a(+)的BamH I和Nde I位点，将此质粒转入大肠杆菌DH5α，提取转化株质粒经BamH I和Nde I酶切、测序鉴定后，转入大肠杆菌BL21(DE3)。

3、表达重组蛋白

将6mL的过夜培养物(上述含有表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)用LB培养基培养约12h)加入200mL的含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基(Luria-Bertani，含1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)中，在37℃温度下振荡培养，当OD₆₀₀＝0.8时，加入IPTG诱导液至终浓度为0.05mmol/L，在37℃温度下诱导培养4h；最后在12000r/min离心10min收集菌体，并通过SDS-PAGE进行分析。

4、提取并溶解包涵体

取3g菌体加入20mL裂解液(50mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl，pH＝8.0)中，加入溶菌酶至1mg/mL，在37℃孵育30min，每隔10min搅动一次；然后在冰浴条件下超声破碎，功率200～300W，每次超声10s，间隔10s，共超声30次；然后在4℃温度下，在12000r/min离心20～30min沉淀包涵体，弃上清；加入30mL洗涤液(50mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％(体积)Triton，10mmol/L β-巯基乙醇，pH＝8.0)超声波洗涤，即用功率200～300W超声波破碎，每次超声10s，间隔10s，共超声10次；然后在4℃温度下，在12000r/min离心20min沉淀包涵体，弃上清；重复超声波洗涤两次，然后加入20mL尿素洗涤液(100mmol/LTris-Cl，1mol/L尿素，pH＝8.0)超声波洗涤一次，得到纯度较高的包涵体蛋白；最后用无菌水洗涤包涵体两次，冻干，-80℃保存。

5、纯化包涵体蛋白

将上述包涵体蛋白溶解于结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠，40mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，pH＝8.0)中，备用。His TrapTM FF凝胶柱用10mL双蒸水洗涤后用10mL结合缓冲液平衡，然后使目的蛋白与凝胶柱结合，没有结合的蛋白用洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸钠，100mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，pH＝8.0)除去，最后用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，500mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，pH＝8.0)洗脱，得到目的蛋白，纯度达95.6％。

6、复性重组蛋白

纯化后的Cry1C蛋白用透析缓冲液(50mmol/L Tris-Cl，pH＝8.0，8mol/L，6mol/L，4mol/L，2mol/L，1mol/L，0.5mol/L，0mol/L尿素)在4℃温度下梯度透析，每种尿素浓度均在8h内透析3次；重新折叠后的Cry1C蛋白在50mmol/L Tris-Cl(pH＝8.0)缓冲液中，以12000r/min离心15min去除不溶蛋白。

7、鉴定蛋白

SDS-PAGE电泳后的凝胶，经电转仪将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，在室温下，将膜置于5％(质量体积比，g/mL)脱脂牛奶中封闭2h；然后在兔抗Cry1C多克隆抗体中孵育2h，用TBST洗涤6次后再用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG孵育2h，再用TBST洗涤6次后通过BCIP-NBT显色。

将电泳后的目的条带切下，用胰蛋白酶进行胶内酶解，得到多肽混合物；然后经过连有HPLC的2D-LTQ-MS/MS检测，MS/MS图谱通过软件分析，最后将数据在NCBI上比对得出最后结果，结果如图8所示。

实验例1  本发明中不同IPTG终浓度、不同诱导温度及不同诱导时间对Cry1C重组蛋白表达的影响

1、不同浓度的IPTG诱导剂对Cry1C重组蛋白表达的影响

当菌液的OD₆₀₀＝0.8时，向7个无菌小三角瓶中等量分装一定体积的菌液，然后依次向各瓶中加入IPTG至终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mmol/L，空载对照(即将pET-28a(+)质粒直接转入BL21(DE3)菌株中)加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃温度下诱导表达4h，结果如图3所示。

2、诱导温度对Cry1C重组蛋白表达的影响

当菌液的OD₆₀₀＝0.8时，向4个无菌三角瓶中等量分装一定体积的菌液，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，分别于15、20、30、37℃温度下诱导表达4h，结果如图4所示。

3、诱导时间对Cry1C重组蛋白表达的影响

当菌液的OD₆₀₀＝0.8时，将菌液装入无菌三角瓶中，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，于37℃诱导培养6h，每隔1h取样检测，结果如图5所示。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及实验例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种表达重组Cry1C基因的大肠杆菌工程菌

<130>KHP10112099.3

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1896

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggaggaga acaatcagaa ccagtgtatc ccttacaatt gtctttctaa tcctgaagaa     60

gttcttttgg atggagaaag gatctcaact ggtaactcat caattgacat ctctctctca    120

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<211>1896

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<400>2

atggaggaga acaatcagaa ccagtgtatc ccgtacaatt gtctgagcaa tccggaagaa     60

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gatatcgctg ctttctttcc aaactatgac aataggagat atccaattca gccagttggt     780

caacttacaa gggaagttta cactgaccca ctcatcaact tcaacccaca gcttcagtct     840

gttgctcagc ttcctacctt caacgttatg gagagcagcg caatcagaaa tcctcacctc     900

ttcgacatct tgaacaacct tacaatcttt accgattggt ttagtgttgg acgtaacttc     960

tactggggag gacatcgact gatctctagc ctcatcggag gtggtaacat cacatctcct    1020

atctacggaa gagaggctaa ccaggagcct ccaagatcat tcactttcaa cggacctgtg    1080

ttcaggactc tttcaaatcc tactcttcga cttcttcagc aaccttggcc agctccacca    1140

ttcaaccttc gtggtgttga aggagttgag ttctctacac ctacaaacag cttcacctat    1200

cgtggaagag gtactgttga ttctcttact gaacttccac ctgaggacaa cagtgtgcca    1260

cctcgtgaag gatacagtca tcgtctttgt catgcaacct tcgttcaaag atctggaaca    1320

cctttcctta caactggtgt tgtgttctct tggactcatc gtagtgcaac tcttaccaac    1380

acaattgatc cagagaggat caaccagatc cctcttgtga aaggattcag agtttgggga    1440

ggaacctctg tgattacagg accaggattc acaggaggtg atatccttcg aagaaacacc    1500

tttggtgact tcgtttctct tcaagtgaac atcaactcac caatcaccca aagataccgt    1560

cttagatttc gttacgcttc tagtagggat gcacgagtta tcgttcttac aggagctgca    1620

tctacaggag tgggaggtca agttagtgtg aacatgcctc ttcagaaaac tatggagatc    1680

ggagagaacc tcacatctag aacattcaga tacaccgact tcagtaatcc tttctcattc    1740

agagctaatc cagacatcat cggtatcagt gaacaacctc tcttcggtgc aggttctatc    1800

agtagcggtg aactttacat cgacaagatc gagatcatcc ttgcagatgc aacatttgaa    1860

gcagaatctg accttgaaag agcacaaaag tagtga                            1896

<210>3

<211>85

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tggaggagaa caatcagaac cagtgtatcc cgtacaattg tctgagcaat ccggaagaag    60

ttctgctgga tggcgaacgc atctc                                          85

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcatcacttt tgtgcgcgtt caaggtcaga ttctgc                              36

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcggatcctc atcacttttg tgcgc                                          25

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggaattccat atggaggaga acaatcagaa cc                                32

Claims (10)

1.一种重组Cry1C基因，其核苷酸序列为Seq ID No:2所示。

2.含有权利要求1所述基因的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，其出发载体为PET-28a(+)。

4.含有权利要求2或3所述载体的工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌工程菌。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，其出发菌株为BL21（DE3）。

6.一种构建权利要求4或5所述工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）用PCR方法修改核苷酸序列为Seq ID No:2的前86个密码子；然后在5’端加上GGATCC构成BamH I酶切位点，在3’端加上CATATG构成Nde I酶切位点；

2）将上述修改后的核苷酸***到质粒载体中；

3）然后将载体转入大肠杆菌，进行重组克隆筛选，获得大肠杆菌工程菌。

7.权利要求4或5所述工程菌的诱导培养方法，包括如下步骤：将工程菌于37℃温度下培养至对数生长期后，按体积百分数3%～5%接种于LB培养基，当OD₆₀₀=0.6～1.0时，加入IPTG至终浓度为0.01～2mmol/L，在温度15～37℃、200rpm的条件下诱导培养1～6h，离心获得菌体。

8.根据权利要求7所述的诱导培养方法，其特征在于，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，诱导培养温度37℃，诱导培养时间4h。

9.一种权利要求4或5所述工程菌表达的Cry1C蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

1）提取并溶解含有Cry1C重组蛋白的包涵体；

2）然后用His TrapTM FF凝胶柱进行亲和层析；

3）然后通过梯度透析，复性Cry1C重组蛋白。

10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）在菌体中加入裂解液及溶菌酶，超声破碎，提取并溶解含有Cry1C重组蛋白的包涵体；用洗涤液超声洗涤2次，然后用尿素洗涤液超声洗涤1次，得到包涵体蛋白；

所述裂解液含有50mmol/L Tris-Cl、10mmol/L EDTA、100mmol/LNaCl、调pH至8.0；所述洗涤液含有50mmol/L Tris-Cl、10mmol/LEDTA、100mmol/L NaCl、体积百分数为0.5%Triton及10mmol/Lβ-巯基乙醇，调pH至8.0；所述尿素洗涤液含有100mmol/L Tris-Cl及1mol/L尿素，调pH至8.0。

2）然后将上述包涵体蛋白溶于结合缓冲液中，与His TrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；

所述结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素、调pH至8.0；所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素、调pH至8.0；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素、调pH至8.0；

3）然后用尿素缓冲液对上述目的蛋白进行梯度透析，每种浓度的尿素缓冲液均在8h内透析3次，复性Cry1C重组蛋白；

所述尿素缓冲液的pH=8.0，其成分为50mmol/L Tris-Cl及尿素；所述尿素的浓度依次为8、6、4、2、1、0.5、0mol/L。

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