CN104830873A - 一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用 - Google Patents
一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104830873A CN104830873A CN201510236790.8A CN201510236790A CN104830873A CN 104830873 A CN104830873 A CN 104830873A CN 201510236790 A CN201510236790 A CN 201510236790A CN 104830873 A CN104830873 A CN 104830873A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dgeo0395
- protein
- irre
- bacterial strain
- motif
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明用位点突变方式对嗜热异常球菌Deinococcus geothermalis中的IrrE蛋白及其同源蛋白进行了功能基序的氨基酸优化,将功能域基序154LAELAR159中第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸。实验证明,功能域优化序列能够显著提高IrrE蛋白及其同源蛋白的抗逆功能,尤其是对其表达菌株的紫外胁迫抗性作用可提高10倍以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白,具体涉及功能域优化的嗜热异常球菌Dgeo0395同源蛋白,以及该类蛋白在增强原核宿主对干燥、氧化和紫外线辐照抗性方面的应用。
背景技术
IrrE是嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)重要的调控蛋白,由Dgeo0395基因编码。根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库的信息,目前发现的Dgeo0395同源蛋白共有23个。已知Dgeo0395能够特异性响应胁迫信号,提高该菌株本身抗击基因的表达。
但目前未见嗜热异常球菌中的Dgeo0395蛋白在增强其他生物干燥、氧化和紫外线辐照抗性功能的研究报道。也未见到对此类蛋白的关键功能基序进行分析,并通过定点突变使功能优化的报道。
发明内容
本发明的目的是对Dgeo0395基因编码蛋白的关键功能基序进行优化,获得调控能力更好的新蛋白序列,以大大提高重组菌株的抗性。
本发明通过同源建模方式分析调控蛋白Dgeo0395的结构域。发现Dgeo0395由三个结构域组成,其中HTH结构域是参与靶标基因启动子结合作用。其HTH结构域由3个α螺旋(α6、α7和α8)组成。
其中α7螺旋上含有重要的功能域基序“154LAELA159”。目前NCBI数据库中23个Dgeo0395的同源蛋白的蛋白序列中均含有此段功能域基序序列,而且,此段功能域基序仅发现于异常球菌属(Deinococcus)菌株(图1)。
本发明利用氨基酸定点突变的方法,通过抗逆实验结果,分析比较此段基序中的不同位点氨基酸残基对整个调控蛋白Dgeo0395抗逆作用的影响,找到了对嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159进行氨基酸优化的突变方式。
具体研究工作如下:
Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化
1)对嗜热异常球菌Dgeo0395的氨基酸序列(如SEQ ID NO.2所示)进行结构域功能分析。并对其重要的功能域基序154LAELAR159(如SEQ ID NO.3所示),进行氨基酸定点突变。
以下是Dgeo0395氨基酸序列,其中,下划线部分是功能域基序154LAELAR159。MTQGQTPPEELSADPSPETGALAPAKARMRELATAYARRLPGLDTHSLMSGLDATLTFMPMGDRDGAYDPEHRVVLINSRVRPERQRFTLAHEISHALLLGDDDLLSDLHDAYEGERLEQVIETLCNVGAAAILMPETLIDELLARFGPSGRARADVSASSALYALAERTSVPVLYAVCAVSRLEAESGEERLPEKALTVRASAGSPGVKYSLRPGTLIPDDHPVAVALETRLPITQESYVPFRSGRRMPAYVDAFPERQRVLVSFALLPKATKGGEQDESGV
所述定点突变是功能域基序154LAELAR159上第二位丙氨酸(155A)和/或第五位丙氨酸(158A)突变为丝氨酸。
其中,功能域基序154LAELAR159中第二位的丙氨酸突变为丝氨酸,序列如SEQ IDNO.4所示;第五位的丙氨酸突变为丝氨酸,序列如SEQ ID NO.5所示。见下表:
表1Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化
序列号 | 序列 | 备注 |
3 | Leu Ala Glu Leu Ala Arg | 154LAELAR159 |
4 | Leu Ser Glu Leu Ala Arg | 第二位丙氨酸突变为丝氨酸 |
5 | Leu Ala Glu Leu Ser Arg | 第五位丙氨酸突变为丝氨酸 |
2)构建突变基因的重组工程菌株,鉴定重组菌株的干燥、氧化和紫外线辐照胁迫的抗性
此实验表明:功能域基序154LAELAR159对嗜热异常球菌Dgeo0395的功能发挥十分重要。表达嗜热异常球菌Dgeo0395优化蛋白(Dgeo0395-A155S和Dgeo0395-A158S)的重组菌株与优化前的重组菌株相比,紫外线辐照抗性提高达10倍以上(见实施例3及图4、5)。
3)对嗜热异常球菌Dgeo0395同源蛋白DR-0167(如SEQ ID NO.6所示)和DGo_CA2805(如SEQ ID NO.7所示)相同功能域基序进行氨基酸定点突变及紫外线辐照胁迫抗性分析。
此实验表明:本发明提及的功能域基序功能及改造方案不仅适用于嗜热异常球菌Dgeo0395蛋白,也同样适用于Dgeo0395的众多同源蛋白。表明该功能域基序改造在同源蛋白紫外抗逆性功能中作用的通用性。
序列表信息
SEQ ID NO.1:Dgeo0395基因的DNA序列;
SEQ ID NO.2:Dgeo0395的氨基酸序列;
SEQ ID NO.3~5:见表1;
SEQ ID NO.6:DR-0167的氨基酸序列;
SEQ ID NO.7:DGo_CA2805的氨基酸序列。
附图说明:
图1Dego0395及其同源蛋白***发育树。横线标注的是Dgeo0395蛋白,图中蛋白序列包含为目前发现的所有Dgeo0395同源蛋白,共23条。数据来自NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库。
图2是含有嗜热异常球菌Dgeo0395序列的PCR产物及载体验证电泳图谱;
Lane 1:2K plus Marker;Lane 2~3:PCR product of pJET-0395;Lane 4:pRADZ3-0395/NdeI;Lane 5:pRADZ3-0395/NdeI+Spe I;Lane 6:pRADZ3-0395/Spe I;Lane 7:pRADZ3-0395/NdeI+Spe I
图3紫外辐照、丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后,含有空载体菌株(JM-Z3)和含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生长情况对比;
图4丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后,含有功能域基序突变载体的菌株JM-A155S和JM-A158S与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生长情况对比;
图5紫外辐照胁迫冲击前后,含有功能域基序突变载体的菌株JM-A155S和JM-A158S与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生长情况对比。
图6紫外辐照胁迫冲击前后,含有功能域基序突变载体的菌株JM-A155S和JM-A158S与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生存曲线。
图7Dego0395及其同源蛋白序列比对及结构分析。框区为本发明提及功能域基序。图中蛋白序列包含为目前发现的所有Dgeo0395同源蛋白,共15条。数据来自NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库。
图8紫外辐照胁迫冲击前后,表达耐辐射异常球菌DR-0167的大肠杆菌(JM-DR0167)与表达功能域基序突变蛋白的菌株JM-A181S和JM-A184S的生长情况对比。
图9紫外辐照胁迫冲击前后,表达戈壁射异常球菌DGO-CA2805的大肠杆菌(JM-CA2805)与表达功能域基序突变蛋白的菌株JM-S131A的生长情况对比。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明,并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的,均为按照本领域技术人员熟知的常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、菌株来源如下:
克隆载体pJET:为ThermoFisher公司市售产品;
穿梭质粒pRADZ3:为本实验室保存;
大肠杆菌JM 109:为北京全式金公司市售产品。
实施例1嗜热异常球菌Dgeo0395基因序列在大肠杆菌中的表达
一、实验方法
1.根据已公布的嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组中的Dgeo0395基因序列设计1对PCR特异性引物:
0395-F:5′ACCACTAGT ATGACGCAGGGCCAGACCCC 3′
0395-R:5′ACCCATATG TCAGACACCCGACTCATCCT 3′
2.通过PCR方法从嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组DNA中扩增出目的基因序列。
反应条件:94℃10min,[94℃30sec,60℃30sec,72℃1.5min]35个循环,72℃10min。
3.PCR产物经胶回收后,克隆于载体pJET上,命名为pJET-0395,并测序验证;然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的Dgeo0395基因及含有groEL启动子的pRADZ3载体,将Dgeo0395基因连接于pRADZ3载体上,构建大肠杆菌表达载体pRADZ3-0395。
4.将该表达载体转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切,测序验证***序列正确(见图2,3),将该菌株命名为JM-0395。含有pRADZ3空质粒的E.coli JM109命名为JM-Z3。
二、实验结果
成功构建了表达Dgeo0395的重组大肠杆菌工程菌株。
实施例2含嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因重组工程菌株的胁迫抗性实验
一、实验材料
重组工程菌株:实施例1得到的含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395的JM-0395菌株
对照菌株:实施例1所述含空质粒的JM-Z3菌株。
二、实验方法
1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化;
2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的液体LB培养基中,37℃培养至指数中后期;
3.室温下6,000rpm离心5min收集菌体,然后用相同体积的磷酸缓冲液(pH 7.0)将菌体洗涤两次,震荡均匀;
接下来进行紫外辐照抗性、丝裂霉素C抗性和干燥抗性实验
A.紫外辐照(UV)抗性分析:
1)将菌液分为等体积两份;
2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体,作为对照;
3)取另一份菌液经紫外辐照5min后,室温下6,000rpm离心5min后收集菌体;
4)取不同时间段的菌液,10倍稀释至10-5,取10μL点在LB固体培养基平板上,37℃培养2d,观察,记录不同菌株的生长情况;
5)取不同时间段的菌液,10倍稀释至10-5,取200μL涂布LB固体培养基平板,37℃培养2d,记录菌落数量,计算菌株生存率,实验重复3次。
B.丝裂霉素C氧化抗性分析:
1)将菌液分为等体积两份;
2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体,作为对照;
3)将菌体重悬于终浓度为10μg/mL的丝裂霉素C的LB液体培养基中,30℃,220rpm摇床培养5min,10min,15min;
4)取不同时间段的菌液,10倍稀释至10-5,取10μL点在LB固体培养基平板上,37℃培养2d,观察,记录不同菌株的生长情况;
5)取不同时间段的菌液,10倍稀释至10-5,取200μL涂布LB固体培养基平板,37℃培养2d,记录菌落数量,计算菌株生存率,实验重复3次。
C.干燥抗性分析:
1)将菌液分为等体积两份;
2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体,作为对照;
3)另一份分装于敞口的EP管中,置于无菌干燥器内(以颗粒状硅胶作为干燥剂);
4)每隔10d取出一个批次的几种不同菌株,倍比稀释至10-5,取10μL点在LB固体培养基平板上,37℃培养2d,观察,记录不同菌株的生长情况;
5)取不同时间点的菌液,10倍稀释至10-5,取200μL涂布LB固体培养基平板,37℃培养2d,记录菌落数量,计算菌株生存率,实验重复3次。
三、实验结果
如图3显示,紫外辐照、丝裂霉素C和干燥胁迫冲击前,含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395的JM-0395菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致;
紫外辐照、丝裂霉素C和干燥胁迫冲击后,含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因的JM-0395重组菌株生长状况良好,菌落显著数多于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图5)。其中紫外辐照抗性和干燥胁迫抗性较对照菌株提高2个数量级,约100倍;丝裂霉素C氧化胁迫抗性提高3个数量级,约1000倍。
通过菌株胁迫后的生存率计算可以清楚的发现:
UV辐照后对照菌株存活率为0.644%±0.052%;表达菌株Dgeo0395的JM-0395菌株存活率为45.570%±3.797%,比对照菌株提高近70倍。
干旱胁迫处理后对照菌株存活率为3.040%±0.929%,而JM-0395菌株存活率为88.889%±7.274%,比对照菌株提高近30倍。
丝裂霉素C氧化胁迫后对照菌株几乎都已经死亡,而JM-0395菌株存活率为58.642%±4.660%,菌株生存能力显著高于对照菌株。
表2是紫外辐照、丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后,含有空载体菌株(JM-Z3)和含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的重组大肠杆菌菌株(JM-0395)存活率比较。
表2三种胁迫处理后菌株存活率比较
四、实验结论
嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因显著增强了原核生物抵抗紫外辐射、氧化和干燥胁迫的能力。
实施例3嗜热异常球菌Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化序列构建
根据同源基因序列比对分析数据,对嗜热异常球菌Dgeo0395表达蛋白的重要功能域基序154LAELAR159进行了氨基酸序列优化。
一、实验方法
对嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159进行了氨基酸优化。通过同源建模方式分析调控蛋白Dgeo0395的结构域。Dgeo0395由三个结构域组成,其中HTH结构域是参与靶标基因启动子结合作用。其HTH结构域由3个α螺旋(α6、α7和α8)组成,其中α7螺旋上含有重要的功能域基序154LAELA159。目前NCBI数据库中Dgeo0395的同源蛋白共发现23条序列,仅发现于异常球菌属(Deinococcus)菌株(图1)。这些蛋白序列中均含有此段功能域基序。利用氨基酸定点突变的方法,分析此段基序中的不同位点氨基酸残基对整个调控蛋白Dgeo0395抗逆作用的影响。
1.通过氨基酸定点突变的方式对将嗜热异常球菌Dgeo0395的氨基酸序列进行功能域基序154LAELAR159进行优化分析。利用融合PCR的方法将目标位点编码氨基酸的核苷酸序列进行突变,进而获得改位点突变的蛋白突变体。选取的突变位点是154L、155A、157L、158A和159R。分别将154位亮氨酸突变为缬氨酸,155位丙氨酸突变为丝氨酸,157为亮氨酸突变为缬氨酸,158位丙氨酸突变为丝氨酸,159位精氨酸突变为赖氨酸。
引物序列如下:
a-0395-F:5′accactagtatgacgcagggccagacccc 3′
d-0395-R:5′acccatatgtcagacacccgactcatcct 3′
b1-L154V-F:5′gggcgtgcgGTGgctgagctggcgcggcgggcagacgtga 3′
c1-L154V-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagctcagcCACcgcacgccc 3′
b2-A155S-F:5′gggcgtgcgctgAGCgagctggcgcggcgggcagacgtga 3′
c2-A155S-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagctcGCTcaccgcacgccc 3′
b3-L157V-F:5′gggcgtgcgctggctgagGTGgcgcggcgggcagacgtga 3′
c3-L157V-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagCACagccaccgcacgccc 3′
b4-A158S-F:5′gggcgtgcgctggctgagctgAGCcggcgggcagacgtga 3′
c4-A158S-R:5′tcacgtctgcccgcccGCTcagctcagccaccgcacgccc 3′
b5-R159K-F:5′gggcgtgcgctggctgagctggcgAAGcgggcagacgtga 3′
c5-R159K-R:5′tcacgtctgcccgCTTcgccagctcagccagcgcacgccc 3′
2.在待突变的核酸位点处设计两条包含定点突变序列的引物b和c,同时设计该基因的上下游引物a和d。分别用引物a、b与c、d以基因组为模板PCR扩增得到两个片段1、2,然后将1、2两片段按摩尔比1:1混合后作为模板,用引物a、d将这两个片段进行融合。
片段1、2反应条件:94℃10min,[94℃30sec,60℃30sec,72℃1.5min]30个循环,72℃10min。
融合反应条件:94℃10min,[94℃30sec,60℃30sec,72℃2min]40个循环,72℃10min。
3.将获得的重组突变片段连接载体pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例1),获得重组工程菌株JM-L154V、JM-A155S、JM-L157V、JM-A158S-F、JM-R159K。
二、实验结果
成功构建了表达嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159氨基酸位点突变的的重组工程菌株JM-L154V、JM-A155S、JM-L157V、JM-A158S-F、JM-R159K。
实施例4表达嗜热异常球菌菌株Dgeo0395蛋白重要功能域基序154LAELAR159优化重组工程菌株的胁迫抗性实验
一、实验目的
鉴定各重组菌株的干燥、氧化和紫外线辐照胁迫的抗性,并与空白对照及出发菌株比较。
二、实验材料
重组工程菌株:实施例3得到的表达嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159氨基酸位点突变的的重组工程菌株:JM-L154V、JM-A155S、JM-L157V、JM-A158S、JM-R159K。
对照菌株:
实施例1所述含空质粒的JM-Z3菌株;
实施例1所述含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395的JM-0395菌株。
三、实验方法
各菌株对干燥、氧化和紫外线辐照三种胁迫的抗性的实验方法按照实施例2实验方法进行。
四、实验结果
1、紫外(UV)胁迫
结果见下表
表2紫外线辐照胁迫下各菌株存活率比较
UV胁迫处理10分钟时,对照菌株JM-Z3已经全部死亡,表达嗜热异常球菌Dgeo0395基因重组菌株JM-0395的存活率下降为0.125%,而表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A155S的存活率为1.263%,表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A158S的存活率最好,仍为62.5%。
UV胁迫处理15分钟时,表达嗜热异常球菌Dgeo0395基因重组菌株JM-0395的存活率进一步降低为0.014%,而表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A155S的存活率为0.197%,表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A158S的存活率保持在12%左右(表2)。
UV辐照生存曲线显示,功能域基序154LAELAR159中155位的丙氨酸突变为丝氨酸,如SEQ ID NO.4所示,使重组菌株在辐照15分钟时的存活率比突变前提高约15倍;而158位的丙氨酸突变为丝氨酸,如SEQ ID NO.5所示,使得重组菌株在辐照15分钟的存活率比突变前提高近900倍(表2、图6)。
2、重组菌株JM-A155S和JM-A158S的干燥和氧化胁迫抗性
重组菌株JM-A155S和JM-A158S的干燥和氧化胁迫抗性与突变前重组菌株JM-0395一致(见图4)。但重组菌株JM-A155S和JM-A158S
五、实验结论
1、功能域基序优化的重组菌株JM-A155S和JM-A158S对紫外线辐胁迫抗性显著高于出发菌株JM-0395,提高10倍以上(图5)。因此证明,154LAELAR159中,155位和158位丙氨酸是提高抗紫外线辐胁迫功能的活性位点。
2、重组菌株JM-L154V、JM-L157V和JM-R159K对干燥、氧化和紫外线辐照胁迫抗性与菌株JM-0395一致,均高于空质粒菌株。证明,154LAELAR159中,L154V、L157V和R159K位点的突变不影响出发菌的抗逆活性,即,对Dgeo0395的调控作用没有影响。
3、嗜热异常球菌Dgeo0395的功能域基序154LAELAR159具有提高蛋白Dgeo0395抗逆功能的重要作用。
实施例5耐辐射异常球菌中IrrE同源蛋白功能域基序的氨基酸优化序列改造及紫外抗性实验鉴定
一、实验目的
利用NCBI数据库基因信息对Dgeo0395同源蛋白序列进行比对分析(见图1、7)。Dgeo0395在耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)中的同源蛋白是DR0167,该蛋白在α7位置同样含有本发明发现的重要功能域基序180LAELAR185,氨基酸序列与Dgeo0395相同(见图7)。对耐辐射异常球菌中的同源蛋白DR0167的重要功能域基序180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变改造,鉴定该功能域基序在重组突变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。
二、实验方法
1.通过氨基酸定点突变的方式对耐辐射异常球菌IrrE同源蛋白DR0167的氨基酸序列进行空间结构相同位置功能域基序180LAELAR185进行优化分析。同样利用融合PCR的方法将目标位点编码氨基酸的核苷酸序列进行突变,进而获得改位点突变的蛋白突变体。选取的突变位点是为功能域基序中的两个丙氨酸,181A和184A。分别将181位丙氨酸突变为丝氨酸,184位丙氨酸突变为丝氨酸。
引物序列如下:
a-dr0167-F:5′taactagtgtgcccagtgccaacgtcag 3′
d-dr0167-R:5′tacatatgtcactgtgcagcgtcct 3′
b1-A181S-F:5′ggccccaccgggcgcgccctcAGCgaactcgccaagcgggcc 3′
c1-A181S-R:5′ggcccgcttggcgagttcGCTgagggcgcgcccggtggggcc 3′
b2-A184S-F:5′ggccccaccgggcgcgccctcgccgaactcAGCaagcgggcc 3′
c2-A184S-R:5′ggcccgcttGCTgagttcggcgagggcgcgcccggtggggcc 3′
2.获得的耐辐射异常球菌DR0167原始基因片段及重组突变片,并段连接载体pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例1,3),获得重组工程菌株JM-DR0167、JM-A181S和JM-A184S。
3.各菌株对紫外线辐照的抗性实验方法参照实施例2的实验方法进行。
三、实验结果
UV辐照胁迫处理显示,耐辐射异常球菌DR-0167同样能够提高原核微生物UV胁迫抗性。同样,对其功能域基序180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变为丝氨酸,进一步提高了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力(图8)。实验结果显示,功能域基序180LAELAR185中第二位丙氨酸突变为丝氨酸是原DR-0167蛋白的保护作用提高仅10倍;而功能域基序180LAELAR185中第五位丙氨酸突变为丝氨酸将原始DR-0167蛋白的保护作用提高2个数量级,近100倍(见图8)。
四、实验结论
耐辐射异常球菌的DR-0167是Dgeo0395的同源蛋白。DR-0167中同样含有本发明发现的重要功能域基序,为180LAELAR185。氨基酸排列顺序与Dgeo0395相同。实验结果证实,对其功能域基序180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变为丝氨酸,进一步提高了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力。实验结果表明,本发明提及的Dgeo0395的重要功能域基序中第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸,提高该蛋白保护原核细胞UV胁迫抗性的发现,同样适用于对Dgeo0395同源蛋白的抗逆功能改造。
实施例6戈壁异常球菌中IrrE同源蛋白功能域基序的氨基酸序列改造及紫外抗性实验鉴定
一、实验目的
利用NCBI数据库基因信息对Dgeo0395同源蛋白序列进行比对分析(见图1、7)。Dgeo0395在戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)中的同源蛋白是DGo_CA2805,该蛋白在α7位置同样含有本发明发现的重要功能域基序127LAELSR132,氨基酸序列与Dgeo0395不同,其第五位不是丙氨酸,而是丝氨酸(见图7)。对戈壁异常球菌中的同源蛋白DGo_CA2805的重要功能域基序127LAELSR132的第五位丝氨酸进行反向突变改造为丙氨酸,鉴定该功能域基序在重组突变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。
二、实验方法
1.通过氨基酸定点突变的方式对戈壁异常球菌IrrE同源蛋白DGo_CA2805的氨基酸序列进行空间结构相同位置功能域基序127LAELSR132进行分析。同样利用融合PCR的方法将目标位点编码氨基酸的核苷酸序列进行突变,进而获得改位点突变的蛋白突变体。选取的突变位点是为功能域基序中第五位丝氨酸。将131位丝氨酸反向突变为丙氨酸。
引物序列如下:
a-CA2805-F:5′taactagtatgcgcgagctggcggcgg 3′
d-CA2805-R:5′tacatatggtgagagggagacgcgct 3′
b1-S131A-F:5′cgcgccctggccgagttgGCCcgccgcgccgacgtgagt 3′
c1-S131A-R:5′actcacgtcggcgcggcgGGCcaactcggccagggcgcg 3′
2.获得的戈壁异常球菌DGo_CA2805原始基因片段及重组突变片,并段连接载体pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例1,3),获得重组工程菌株JM-CA2805、JM-S131A。
3.各菌株对紫外线辐照的抗性实验方法参照实施例2的实验方法进行。
三、实验结果
UV辐照胁迫处理显示,戈壁异常球菌DGo_CA2805同样能够提高原核微生物UV胁迫抗性。同样,对其功能域基序127LAELSR132第五位丝氨酸突变为丙氨酸,显著降低了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力(图9)。实验结果显示,功能域基序127LAELSR132中第五位丝氨酸突变为丙氨酸将原始DGo_CA2805蛋白的保护作用降低2个数量级,约100倍(见图9)。
四、实验结论
戈壁异常球菌的DGo_CA2805是Dgeo0395的同源蛋白。DGo_CA2805中同样含有本发明发现的重要功能域基序,为127LAELSR132。氨基酸排列顺序与Dgeo0395不同,其第五位氨基酸天然是丝氨酸。本实施例将这一位点氨基酸进行反向突变,并验证该功能域基序在在重组突变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。实验结果证实,对其功能域基序127LAELSR132中第五位丝氨酸进行反向突变为丙氨酸,明显降低了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力。实验结果从反方向证明,本发明提及的Dgeo0395的重要功能域基序中第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸,提高该蛋白保护原核细胞UV胁迫抗性的发现,同样适用于对Dgeo0395同源蛋白的抗逆功能改造。
Claims (6)
1.嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)IrrE蛋白及其同源蛋白中的功能域基序154LAELAR159在抗逆功能改造中的应用,所述154LAELAR159的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.权利要求1所述的应用,所述改造是将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的第二位丙氨酸或第五位丙氨酸突变为丝氨酸。
3.权利要求1或2所述的应用,所述抗逆功能改造是提高细胞抗氧化、抗紫外辐照和抗干燥功能。
4.权利要求3所述的应用,所述抗逆是抗紫外辐照胁迫。
5.权利要求1或2所述的应用,所述嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)IrrE蛋白是Dgeo0395蛋白及其同源蛋白。
6.权利要求1或5所述的应用,所述同源蛋白是NCBI数据库中以下23个蛋白:ProteinID分别是:WP019588002.1、EYB67551.1、WP034358392.1、WP034387888.1、WP034408305.1、WP034406652.1、WP040381646.1、WP029483991.1、WP034419261.1、WP039685814.1、WP012692245.1、WP043817964.1、WP043779788.1、WP017871397.1、WP010886813.1、WP034350714.1、WP014686212.1、WP013615637.1、WP013556095.1、WP027482769.1、AFZ68368.1、WP041231581.1、WP034339224.1。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510236790.8A CN104830873B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用 |
US15/553,599 US10738314B2 (en) | 2015-05-11 | 2016-05-09 | IrrE protein functional domain for improving anti-oxidation capability of cell and application thereof |
PCT/CN2016/081403 WO2016180300A1 (zh) | 2015-05-11 | 2016-05-09 | 一种提高细胞抗氧化能力的irre蛋白功能域及其应用 |
AU2016260738A AU2016260738B2 (en) | 2015-05-11 | 2016-05-09 | IrrE protein functional domain for improving anti-oxidation capability of cell and application thereof |
CA2977853A CA2977853C (en) | 2015-05-11 | 2016-05-09 | Irre protein functional domain for improving anti-oxidation capability of cell and application thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510236790.8A CN104830873B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104830873A true CN104830873A (zh) | 2015-08-12 |
CN104830873B CN104830873B (zh) | 2017-06-30 |
Family
ID=53809073
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510236790.8A Active CN104830873B (zh) | 2015-05-11 | 2015-05-11 | 一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10738314B2 (zh) |
CN (1) | CN104830873B (zh) |
AU (1) | AU2016260738B2 (zh) |
CA (1) | CA2977853C (zh) |
WO (1) | WO2016180300A1 (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016180300A1 (zh) * | 2015-05-11 | 2016-11-17 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种提高细胞抗氧化能力的irre蛋白功能域及其应用 |
CN109097374A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-12-28 | 天津科技大学 | 一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用 |
CN109402081A (zh) * | 2018-11-27 | 2019-03-01 | 江南大学 | 一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用 |
CN113151293A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-07-23 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 抗逆基因线路AcDwEm及其提高作物耐盐抗旱耐高温的应用 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109055417B (zh) * | 2018-08-28 | 2020-07-07 | 浙江新和成股份有限公司 | 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用 |
CN109182310B (zh) * | 2018-09-26 | 2021-10-08 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种耐辐射戈壁异常球菌角蛋白酶基因的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101591630A (zh) * | 2009-06-30 | 2009-12-02 | 新疆农业科学院微生物应用研究所 | 一种耐辐射奇球菌及产生的微生物抗紫外辐射制剂 |
CN101671679A (zh) * | 2009-04-30 | 2010-03-17 | 浙江大学 | 一种耐辐射球菌抗逆相关基因及其应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101418300B (zh) * | 2007-10-22 | 2010-12-08 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 提高植物耐盐及抗旱性的基因及其应用 |
CN101696414B (zh) * | 2009-11-10 | 2012-01-25 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 提高生物辐射抗性的基因及其应用 |
CN202443018U (zh) | 2012-03-05 | 2012-09-19 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 快速联检耐盐HIN和IrrE蛋白的金标试剂盒 |
EP2917365B1 (en) | 2012-11-12 | 2020-03-11 | Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats | Methods and kits for the prognosis of colorectal cancer |
CN104830873B (zh) | 2015-05-11 | 2017-06-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用 |
-
2015
- 2015-05-11 CN CN201510236790.8A patent/CN104830873B/zh active Active
-
2016
- 2016-05-09 CA CA2977853A patent/CA2977853C/en active Active
- 2016-05-09 WO PCT/CN2016/081403 patent/WO2016180300A1/zh active Application Filing
- 2016-05-09 AU AU2016260738A patent/AU2016260738B2/en not_active Ceased
- 2016-05-09 US US15/553,599 patent/US10738314B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101671679A (zh) * | 2009-04-30 | 2010-03-17 | 浙江大学 | 一种耐辐射球菌抗逆相关基因及其应用 |
CN101591630A (zh) * | 2009-06-30 | 2009-12-02 | 新疆农业科学院微生物应用研究所 | 一种耐辐射奇球菌及产生的微生物抗紫外辐射制剂 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ANDREJA VUJIčIć-ŽAGAR等: "Crystal Structure of the IrrE Protein, a Central Regulator of DNA Damage Repair in Deinococcaceae", 《JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY》 * |
H. S. MISRA等: "Physiological and molecular basis of extreme radioresistance in Deinococcus radiodurans", 《CURRENT SCIENCE》 * |
HUIMING LU等: "DNA binding is essential for PprI function in response to radiation damage in Deinococcus radiodurans", 《DNA REPAIR》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016180300A1 (zh) * | 2015-05-11 | 2016-11-17 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种提高细胞抗氧化能力的irre蛋白功能域及其应用 |
US10738314B2 (en) | 2015-05-11 | 2020-08-11 | Biotechnology Research Institute, Chinese Academy Of Agricultural Sciences | IrrE protein functional domain for improving anti-oxidation capability of cell and application thereof |
CN109097374A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-12-28 | 天津科技大学 | 一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用 |
CN109402081A (zh) * | 2018-11-27 | 2019-03-01 | 江南大学 | 一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用 |
CN109402081B (zh) * | 2018-11-27 | 2021-08-20 | 江南大学 | 一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用 |
CN113151293A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-07-23 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 抗逆基因线路AcDwEm及其提高作物耐盐抗旱耐高温的应用 |
CN113151293B (zh) * | 2020-10-20 | 2023-03-10 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 抗逆基因线路AcDwEm及其提高作物耐盐抗旱耐高温的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10738314B2 (en) | 2020-08-11 |
US20180163215A1 (en) | 2018-06-14 |
AU2016260738B2 (en) | 2019-07-18 |
CN104830873B (zh) | 2017-06-30 |
AU2016260738A1 (en) | 2017-08-31 |
WO2016180300A1 (zh) | 2016-11-17 |
CA2977853A1 (en) | 2016-11-17 |
CA2977853C (en) | 2019-04-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104830873A (zh) | 一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用 | |
CN103951743B (zh) | 人sfrp1变体及其应用 | |
CN104611317B (zh) | 一种提高l-天冬酰胺酶分泌表达的方法 | |
CN106591270B (zh) | 一株定点突变改造的基因工程精氨酸脱亚胺酶 | |
CN106119268A (zh) | 一种提高α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1热稳定性的方法 | |
US20230329283A1 (en) | Recombinant antibacterial peptide trsub, preparation method and application for same | |
CN104946661A (zh) | 水稻粒形调控基因gl7及其用途 | |
CN105950524A (zh) | 一种高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法 | |
CN103305536A (zh) | 漆酶基因及工程菌与用途 | |
CN104371993B (zh) | 一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体 | |
CN109706148A (zh) | 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法 | |
Zhao et al. | Multiplex genetic engineering improves endogenous expression of mesophilic α-amylase gene in a wild strain Bacillus amyloliquefaciens 205 | |
Al-Janabi et al. | Novel approach of amplification and cloning of bacterial cellulose synthesis (bcs) operon from Gluconoacetobacter hansenii | |
CN110846333B (zh) | 一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 | |
CN104087570B (zh) | 乌头酸酶突变体、其编码基因及应用 | |
CN108220216B (zh) | 一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用 | |
CN114349831A (zh) | aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法 | |
CN103993021B (zh) | 一种十字花科黑腐病菌的iii型效应物基因及其应用 | |
Clausen et al. | Cloning, sequencing, and sequence analysis of two novel plasmids from the thermophilic anaerobic bacterium Anaerocellum thermophilum | |
CN105002201A (zh) | 嗜热异常球菌Dgeo0395增强细胞抗逆的应用 | |
CN106754605B (zh) | 一种提高枯草芽孢杆菌发酵液中α‑淀粉酶活的方法 | |
CN114410615B (zh) | Yh66_00525蛋白及其编码基因在调控细菌精氨酸产量中的应用 | |
CN114605509B (zh) | Yh66_01475蛋白及其编码基因在调控细菌精氨酸产量中的应用 | |
CN116064633B (zh) | 一种构建高效生物合成维生素k2工程菌的方法 | |
CN114315998B (zh) | Cey17_rs00300基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220413 Address after: 572025 building 3, nuclear energy R & D and Industrial Park, Yiju Road, Yazhou District, Sanya City, Hainan Province Patentee after: Longping Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd. Address before: 100081 No. 12 South Main Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun Patentee before: BIOTECHNOLOGY Research Institute CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES |
|
TR01 | Transfer of patent right |