CN104820033A - 一种河豚毒素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的方法,包括以下步骤:(1)标准贮备液的配制;(2)样品的前处理;(3)液相色谱测试。本发明采用高效液相色谱法检测中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素,以便证明鲎体内的毒素到底是不是含有河豚毒素,从而知道是食什么鲎引起食鲎中毒以及含量多少,为食鲎中毒的预防和治疗提供参考。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法。
背景技术
中国鲎主要分布于日本的濑户内海和九州岛北岸,越南、西菲律宾的岛屿,苏门达腊和爪哇岛,马来西亚的北婆罗洲以及加里曼丹东岸等海域,在中国主要分布于长江以南的浙江、福建、广东、广西、海南以及台湾等沿海海域,现以福建、广东、广西、海南为多。圆尾鲎分布于中国香港、北部湾、雷州湾、印度尼西亚爪哇岛北岸以北、菲律宾南部以西和恒河河口印度东北部以东的海域。在我国圆尾鲎主要分布于北部湾、雷州半岛西海岸以及海南的西海岸,近年来发现雷州半岛南海岸及以东沿岸均有圆尾鲎的分布,如湛江、香港等地不少海滩也分布有不少的圆尾鲎。我国人民素有吃鲎的习惯,鲎肉似蟹,只是口感较粗。在中国的广东、广西常有食鲎中毒的事件发生。
河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种毒性很强的神经性毒素,它最早从河豚鱼中分离出来的。近年来还发现河豚毒素不仅存在于河豚属的鱼类,还存在于虾虎鱼、章鱼、海星、蟹类以及腹足类,甚至还有鲎等众多的海洋生物中。它们不仅本身有较强的毒性而且可以通过食物链富集等途径,污染其他水产品,给人们食用这些水产品构成极大潜在危险。在东南亚河豚毒素中毒已经成为一个难题,一般都是因为摄取了河豚鱼导致的中毒。因为在日本河豚鱼被作为一道佳肴,所以大多数的河豚中毒事件都是发生在日本。另外,误食不明鱼种也是此类中毒事件发生的重要原因,因而加强对水产品中河豚毒素的监测显得尤为必要,多省地方渔业局已将水产品中河豚毒素作为常规检测项目。河豚毒素的检测方法种类繁多,有生物测定法、理化检测方法、免疫化学测定方法等几大类。小鼠法是最常用和最简便的方法,廖永岩等也在2000年用小白鼠法检测了中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素,但此法具有定量不准确且重复性差等缺点。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种检测中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的方法。
其技术方案如下:
一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法,包括以下步骤:
(1)标准贮备液的配制
精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中,用1ml移液枪吸取1.0mL的浓度为0.2%醋酸,使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液,置于冰箱中保存;
(2)样品的前处理
取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g,剪碎后加10ml pH=3.5浓度为0.1%的醋酸于玻璃匀浆器中匀浆,充分匀浆后将样品置于烧瓶中,加50ml浓度为0.1%的醋酸,然后在水浴锅中沸水浴10-20分钟,边加热边搅拌,转速控制在150-200r/min,冷却后用0.45μm滤膜真空抽滤,将滤液放入蒸发皿中,在60-70℃的水浴锅上进行蒸发浓缩,直至10ml,然后过滤定溶至10ml,将浓缩的滤液10ml放在离心管中,经10000r/min的速度,离心15分钟,取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤后,放入干净的离心管中,作为液相色谱待测液;
(3)液相色谱测试
醋酸流动相色谱条件固定相:SunFireTMC18色谱柱,直径4.6mm×长度150mm,进样量为20μ;流动相:0.2%醋酸;流速:0.8mL/min;紫外检测波长:210nm;柱温:25℃;每次进样体积为60μL;pH为3.0;
磷酸流动相色谱条件固定相:SunFireTMC18色谱柱,尺寸为4.6mm×150mm,进样量为20μl;流动相:0.05mol/L NaH2PO4-0.05mol/L Na2HPO4,pH=6.8,庚烷磺酸钠离子对5mM;流速:1mL/min;紫外检测波长为200nm;柱温:25℃;每次进样体积为60μL;pH为6.8。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
1、本发明采用高效液相色谱法检测中国鲎和圆尾鲎体内的的河豚毒素,以便证明鲎体内的毒素到底是不是含有河豚毒素,从而知道是食什么鲎引起食鲎中毒以及含量多少,为食鲎中毒的预防和治疗提供参考。
2、本发明样品前处理步骤中,水浴锅中沸水浴10-20分钟,边加热边搅拌,转速控制在150-200r/min,在这一范围内,物料粘度不会随着搅拌的进行而增大,如果转速过高,粘度增大后转速会逐渐降低会影响河豚毒素的溶出。
附图说明
图1是0.2%的醋酸(pH=3.0)做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。
图2是0.05mol/LNaH2PO4-0.05mol/L Na2HPO4(pH=6.8)以及庚烷磺酸钠离子对5mM做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。
图3是磷酸做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。
图4是0.2%的醋酸(pH=3.0)做流动相的溶解物液相色谱图。
图5是以磷酸缓冲液为流动相作为标准液,全波段扫描的紫外光谱图。
图6是以0.2%的醋酸溶液溶解为流动相作为标准液,全波段扫描的紫外光 谱图。
图7是以0.2%醋酸溶解的河豚毒素标准样,全波段扫描的紫外光谱图。
图8是以中国鲎的肌肉样品溶液为代表,对抽提的样品进行全波段扫描的紫外光谱图。
图9是以圆尾鲎的肌肉样品溶液为代表,对抽提的样品进行全波段扫描的紫外光谱图。
图10是对标准品分别选用194、198、200、204、214nm等5种波长进行色谱检测。
图11是以磷酸流动相、200nm紫外波长条件下,进行0.2%醋酸和河豚毒素标准样的色谱检测。
图12是将河豚毒素标准样、中国鲎肌肉、圆尾鲎肌肉色谱图进行比较。
图13是将河豚毒素标准样、中国鲎黄色***、圆尾鲎黄色***色谱图进行比较。
图14将河豚毒素标准样、中国鲎肌肉、圆尾鲎肌肉色谱图色谱峰的高矮进行比较.
图15将河豚毒素标准样、中国鲎黄色***、圆尾鲎黄色***色谱图进行色谱峰高矮的比较。
具体实施方式:
下面以实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不局限于这些实施例。
材料与方法
中国鲎的成鲎购于湛江海鲜批发市场;圆尾鲎成鲎采自湛江东海岛民安海区。
仪器
日本岛津EL-120HA电子天平(感量0.01g),日本岛津AY120电子天平(感量0.0001g),天津市津腾实验设备有限公司GM-0.33Ⅱ真空隔膜抽滤机,科大创新股份有限公司KDC-160H高度冷冻离心机。日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪,日本岛津SPD-20A可见-紫外检测器,SunFireTMC18色谱柱(4.6mm×150mm),意大利哈纳HI8424 pH计,北京普析通用仪器有限公司TU1901紫外-可见分光光度计。
试剂
河豚毒素,经北京毕特博生物有限公司,从美国ENZO公司进口,纯度大于99%。庚烷磺酸钠,冰醋酸、NaH2PO4和Na2HPO4均为分析纯,甲醇为色谱纯,购自湛江林达公司。超纯水自制。
方法
标准贮备液的配制
精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中,用1ml移液枪吸取1.0mL的醋酸(0.2%),使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液,置于冰箱中保存。
样品的前处理
参照周昕等的方法进行改良的河豚毒素抽提法进行样品处理:取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g,剪碎后加10ml 0.1%的醋酸(pH=3.5)于玻璃匀浆器中匀浆。充分匀浆后将样品置于烧瓶中,加50ml醋酸(0.1%),然后在水浴锅中沸水浴10-20分钟,边加热边搅拌,转速控制在150-200r/min。冷却后用0.45μm滤膜真空抽滤,将滤液放入蒸发皿中,在60-70℃的水浴锅上进行蒸发浓缩,直至10ml,然后过滤定溶至10ml。将浓缩的滤液10ml放在离心管中,经10000r/min的速度,离心15分钟。取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤后,放入干净的离心管中,作为液相色谱待测液。中国鲎、圆尾鲎组织共进行2次取样抽提。
色谱条件
醋酸流动相色谱条件固定相:SunFireTMC18色谱柱,直径4.6mm×长度150mm,进样量为20μ;流动相:0.2%醋酸;流速:0.8mL/min;紫外检测波长:210nm;柱温:25℃;每次进样体积为60μL;pH为3.0;
磷酸流动相色谱条件固定相:SunFireTMC18色谱柱,尺寸为4.6mm×150mm,进样量为20μl;流动相:0.05mol/L NaH2PO4-0.05mol/L Na2HPO4,pH=6.8,庚烷磺酸钠离子对5mM;流速:1mL/min;紫外检测波长为200nm;柱温:25℃;每次进样体积为60μL;pH为6.8。
结果与分析
流动相的确定
在实验中首先选择0.2%的醋酸(pH=3.0)做流动相,对河豚毒素标准样进行液相色谱分析,结果如图1。
从图1可见,以醋酸为流动相时,标准样色谱图不理想。
后选用0.05mol/LNaH2PO4-0.05mol/L Na2HPO4(pH=6.8)以及庚烷磺酸钠离子对5mM做流动相,结果如图2。
从图2可见,标准样基线平直,能很好地显示出2个峰来,色谱图比较理想。
为了确定流动相是否对图2的标准样中的峰有干扰,对磷酸流动相进行液相色谱分析,结果如图3。
从图3可见,磷酸流动相对液相色谱的干扰相当小,图2中标准样中的2个峰,应不是磷酸流动相干扰造成。
因为河豚毒素标准样用0.2%醋酸溶解,所以对0.2%醋酸进行色谱分析,结 果如图4。
从图4可见,除2.30之间有一个峰之外,其它位置基线平直,不会对溶解物造成干扰。这也说明,以磷酸为流动相能较好地将醋酸溶解的河豚毒素分离出来(图2)。
检测波长的确定
以流动相作为标准液,对流动相溶液进行全波段扫描,结果如图5。
从图5可见,磷酸缓冲液流动相在紫外分光光度计下几乎没有吸收峰,不会对液相色谱结果产生干扰。
因为河豚毒素用0.2%的醋酸溶液溶解,中国鲎和圆尾鲎组织均用稀醋酸溶液提抽,所以,对0.2%的醋酸溶液溶解进行全波段扫描,结果见图6。
从图6可见,0.2%醋酸最大吸收峰值为210.00nm。
因为河豚毒素标准样用0.2%醋酸溶解,所以,再对河豚毒素标准溶液进行全波段扫描,结果见图7。
从图7可见,0.2%醋酸溶解的河豚毒素标准样最大吸收峰值为208.00nm。
再以中国鲎和圆尾鲎的肌肉样品溶液为代表,对抽提的样品进行全波段扫描,结果见图8、9。
从图8可见,中国鲎肌肉抽提样最大吸收峰值为230.00nm。从图9可见,圆尾鲎肌肉抽提样最大吸收峰值为212.00nm。
综合分析醋酸、河豚毒素及中国鲎和圆尾鲎样品的紫外吸收峰可知,194-214nm应是检测河豚毒素的理想波长区间。所以,对标准品分别选用194、198、200、204、214nm等5种波长进行色谱检测,结果见图10。
从图10可见,198nm(图10b)和200nm(图10c)TTX的吸收峰最高,而且两者相差不大。这说明198nm、200nm紫外波长检测河豚毒素较为理想。200nm被选定为本实验后续实验的检测波长。
河豚毒素峰位置的确定
确定流动相和检测波长后,进行标准样河豚毒素的峰位置确定。在磷酸流动相、200nm紫外波长条件下,进行0.2%醋酸和河豚毒素标准样的色谱分析,结果见图11。
从图11可见,在a的0.2%醋酸色谱图中,只在2.3.0位置有一吸收峰;而b的0.2%醋酸溶解的河豚毒素标准样的色谱图中,除在2.30位置有一吸收 峰外,在8.3附近有另一明显的吸收峰。这说明,图2标准样色谱图中的第一个峰应是溶剂醋酸,第二个峰是河豚毒素。
中国鲎与圆尾鲎河豚毒素的比较
中国鲎和圆尾鲎肌肉河豚毒素的比较
将河豚毒素标准样、中国鲎肌肉、圆尾鲎肌肉色谱图进行比较,结果如图12。
从图12可见,在8.5附近,圆尾鲎肌肉(图12c)与河豚毒素标准样(图12a)有一明显的吸收峰,而中国鲎肌肉(图12b)这一峰不明显。这说明,圆尾鲎肌肉里含有河豚毒素,而中国鲎肌肉里几乎不含河豚毒素。
中国鲎和圆尾鲎黄色***河豚毒素的比较
将河豚毒素标准样、中国鲎黄色***、圆尾鲎黄色***色谱图进行比较,结果如图13。
从图13可见,在8.5附近,圆尾鲎黄色***(图13c)与河豚毒素标准样(图13a)有一明显的吸收峰,而中国鲎黄色***(图13b)这一峰不明显。这说明,圆尾鲎黄色***里含有河豚毒素,而中国鲎黄色***里几乎不含河豚毒素。
比较中国鲎与圆尾鲎体内河豚毒素量的大小
将河豚毒素标准样、中国鲎肌肉、圆尾鲎肌肉色谱图色谱峰的高矮进行比较,结果见图14。
从图14可见,在8.5附近,圆尾鲎肌肉的吸收峰(图14c)最高,标准样的吸收峰(图14a)其次,而中国鲎肌肉(图14b)在这一点的吸收峰不明显。这说明,圆尾鲎肌肉里含有河豚毒素多,而中国鲎肌肉里几乎不含河豚毒素。
将河豚毒素标准样、中国鲎黄色***、圆尾鲎黄色***色谱图进行色谱峰高矮的比较,结果如图15。
从图15可见,在8.5附近,圆尾鲎黄色***的吸收峰(图15c)最高,标准样的吸收峰(图15a)其次,而中国黄色***(图15b)在这一点的吸收峰不明显。这说明,圆尾鲎黄色***里含有河豚毒素多,而中国鲎黄色***里几乎不含河豚毒素。
以上所述,仅为本发明最佳实施方式,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)标准贮备液的配制
精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中,用1ml移液枪吸取1.0mL的浓度为0.2%醋酸,使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液,置于冰箱中保存;
(2)样品的前处理
取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g,剪碎后加10ml pH=3.5浓度为0.1%的醋酸于玻璃匀浆器中匀浆,充分匀浆后将样品置于烧瓶中,加50ml浓度为0.1%的醋酸,然后在水浴锅中沸水浴10-20分钟,边加热边搅拌,转速控制在150-200r/min,冷却后用0.45μm滤膜真空抽滤,将滤液放入蒸发皿中,在60-70℃的水浴锅上进行蒸发浓缩,直至10ml,然后过滤定溶至10ml,将浓缩的滤液10ml放在离心管中,经10000r/min的速度,离心15分钟,取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤后,放入干净的离心管中,作为液相色谱待测液;
(3)液相色谱测试
醋酸流动相色谱条件固定相:SunFireTMC18色谱柱,直径4.6mm×长度150mm,进样量为20μ;流动相:0.2%醋酸;流速:0.8mL/min;紫外检测波长:210nm;柱温:25℃;每次进样体积为60μL;pH为3.0;
磷酸流动相色谱条件固定相:SunFireTMC18色谱柱,尺寸为4.6mm×150mm,进样量为20μl;流动相:0.05mol/L NaH2PO4-0.05mol/L Na2HPO4,pH=6.8,庚烷磺酸钠离子对5mM;流速:1mL/min;紫外检测波长为200nm;柱温:25℃;每次进样体积为60μL;pH为6.8。
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